Epitel ve stromal hücrelerden oluşan ve yerli endometrial dokunun özelliklerini koruyan insan primer endometriyal organoidler oluşturmak için bir protokol sunulmuştur. Bu protokol, rahim dokusu alımından endometrial organoidlerin histolojik işleme yöntemlerini açıklamaktadır.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Multicellular Human Primer Endometrial Organoidlerin Üretimi
* These authors contributed equally
Bu makalede
Özet
Özet
İnsan endometrium vücutta ki en hormonal duyarlı dokulardan biridir ve gebeliğin kurulması için gereklidir. Bu doku da hastalıklı olabilir ve morbidite ve hatta ölüme neden olabilir. İnsan endometrial biyolojisini inceleyen model sistemler, tek hücreli in vitro kültür sistemleri ile sınırlandırılmıştır. Buna ek olarak, endometriumun en önemli hücre tiplerinden biri olan epitel hücreleri, kültürdeki fizyolojik özelliklerini iyi yaymaz veya korumaz ve böylece endometriyal biyoloji anlayışımız sınırlı kalmaktadır. İlk defa insan endometriumunun hem epitel hem de stromal hücrelerinden oluşan endometrial organoidler oluşturduk. Bu organoidler herhangi bir ekzojen iskele malzemeleri gerektirmez ve özellikle epitel hücreleri küresel benzeri yapıyı kapsayacak şekilde düzenlemek ve üretmek ve kollajen salgılayan merkezinde stromal hücreleri ile polarize olur. Östrojen, progesteron ve androjen reseptörleri epitel ve stromal hücrelerde ifade edilir ve östrojen ve testosteron fizyolojik düzeyleri ile tedavi organoidlerin organizasyonu teşvik. Bu yeni model sistemi, normal endometriyal biyoloji ve hastalıkları daha önce mümkün olmayan şekillerde incelemek için kullanılabilir.
Giriş
İnsan endometrium hatları rahim boşluğu ve implantasyon sırasında embriyo için ilk temas olarak hizmet vermektedir. Endometrium luminal ve glandüler epitel hücreleri, destekleyici stromal fibroblastlar, endotel hücreleri ve bağışıklık hücrelerinden oluşur. Birlikte, Bu hücre tipleri seks steroid hormonları için en duyarlı dokulardan biri olan endometrial doku makyaj1. Her adet döngüsü sırasında meydana gelen değişiklikler çarpıcı. Embriyo implantasyonunun gerçekleşmesi için uygun büyüme ve endometriumun yeniden şekillendirilmesi gereklidir. Östrojen ve progesteron anormal yanıt gebeliğin başarılı kurulması için izin vermez ve hatta endometrial neoplazi de dahil olmak üzere hastalıklara neden olabilir refrakter bir endometrium neden olabilir.
Endometriumda oluşan hormon yanıtlarını ve temel değişiklikleri incelemek için ameliyat veya endometrial biyopsi sırasında hastalardan alınan endometrial dokulardan alınan hücreler hücre kültüründe yayılımkonusu olmuştur. Endometrial stromal hücreler tercihen çoğalır ve kolayca yayılır, ve progesteron tarafından indüklenen farklılaşma süreci in vitro recapitulated olabilir. Sonuç olarak, desidualizasyon2,3olarak adlandırdığı bu farklılaşma sürecinde çok şey öğrenilmiştir. Endometrium diğer önemli hücre tipi, luminal ve glandüler epitel hücreleri, ancak, polarite kaybetme, yaşlanma, yaşlanmak, ve sınırlı çoğaltıcı potansiyele sahip, geleneksel monolayers olarak iyi büyümek yok. Sonuç olarak, daha az biyoloji ve insan endometrium onların rolü bilinmektedir. Birçok neoplazi epitel hücrelerinden kaynaklandığı gibi, hiperplazi veya kanser hücrelerine dönüşüm ile ilişkili mekanizmalar tam olarak tanımlanmış olmaya devam etmektedir. Ayrıca, çalışmalar hormon yanıtı endometriumepitelve stromal hücreler arasında samimi parakrin eylemleri içerdiğini kurduk4 ,5.
Son zamanlarda, endometrial epitel hücrelerinin üç boyutlu (3D) organoid kültürü iki bağımsız grup tarafından kurulmuştur6,7, endometrial dokudan oluşan organoidlerin ilk raporları. Bu organoidler bir protein matrisi(Malzeme Tablosu)içine gömülü endometrial epitel hücrelerinden oluşuyordu ve endometrial endometriumun hormonal olarak duyarlı önemli bir bölmesi olan stromal fibroblastları içermiş. Matris proteinler çok dan çok değişebilir ve mutlaka dokuda meydana gelmez sinyal yolları tetikleyebilir gibi, endometrium bileşenleri ile matris proteinleri yerine ideal olacaktır. Mevcut çalışmada, insan endometriumunun epitel ve stromal hücrelerinin iskelesiz insan endometrial organoidlerinin oluşturulmasına bir protokol sunulmuştur. Stromal hücrelerin varlığı sadece epitel hücreleri için destek sağlamakla kalmıyor, aynı zamanda endometriyal hormon yanıtı için önemli olduğu tespit edilen gerekli parakrin eylemleri de sağlar4,8,9 .
Yeni multisellüler endometriyal organoid oluşturmak için basit ve hem epitel hem de stromal hücreleri içeren endometrium bir model sistemi sunuyor. Bu organoidler hormonal dengesizlik veya eksojen hakaretler nedeniyle tümörigenez gibi hastalığın uzun süreli hormonal değişiklikleri ve erken olaylarını incelemek için kullanılabilir. Bu organoidlerin karmaşıklığı sonunda diğer hücre tipleri içerecek şekilde genişletilebilir, endotel ve bağışıklık hücreleri muhtemelen miyomsal hücreleri ile de dahil olmak üzere gerçekten insan doku fizyolojisi taklit etmek.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Endometrial örnekler Northwestern Üniversitesi Prentice Kadın Hastanesi'nde benign rahim koşulları için rutin histerektomi geçiren premenopozal kadınlardan alındı, Kurumsal İnceleme Kurulu onaylı protokole göre. Çalışmaya dahil olan tüm kadınlardan yazılı izin alındı.
1. Agarose Kalıplarının Hazırlanması
- Hücre izolasyonuna başlamadan önce, organoidleri üreticinin talimatlarına göre barındırmak için %1,5 agarose mikro kalıpları(Malzeme Tablosu)atar ve dengeler.
2. Endometrial Organoidlerin Üretimi
- Primer stromal ve epitel hücrelerinin hasat
- Aseptik tekniği kullanan bir biyogüvenlik kabininde, enzim solüsyonu (2.5 mg/mL kollajenaz tip I + 0.1 mg/mL DNase I 10 mL dispase [500 ünite]) 37 °C'de hazırlayın ve çözeltiyi 15 mL konik tüpe 0,2 μm şırınga filtresi kullanarak steril filtre uygulayın.
- Aseptik tekniği kullanarak bir biyogüvenlik kabine, rahim biyopsileri ve neşter ile çok küçük parçalar halinde başlık altında kıyma doku endometrium kazımak.
NOT: Yeterli sayıda organoid üretmek için en az 20 mm x 10 mm x 1 mm olan endometrial doku gereklidir. - 15 mL konik tüpte enzim çözeltisine taze kıyılmış doku koyun. Kapağı kapatın ve kontaminasyonu önlemek için üst kısmı balmumu filmi(Malzeme Tablosu)ile sarın.
- Bir su banyosu veya 37 °C'de bir kuvöz ile tüp koyun 30 dakika hafif sallayarak (80−100 rpm).
- 50 mL konik bir tüp üzerinde 20 μm hücreli süzgeç üstüne 100 μm hücreli süzgeç yığını. Çözeltiyi iki süzgeçten süzün ve 15 mL konik tüpü Hank'in dengeli tuz çözeltisinin (HBSS) 10 mL'i ile durulayın; Malzeme Tablosu) ve tüm hücrelerin toplanmasını sağlamak için süzgeç aracılığıyla yıkama koymak.
NOT: Akış-sıvı stromal hücreleri ve kırmızı kan hücreleri (~ 20 mL toplam) içerir. Epitel hücreleri 20 μm süzgeç üzerinde toplanır. Sindirilmemiş doku parçaları 100 μm süzgeç üstünde kalır. Sindirilmemiş dokuyu biyolojik tehlike selamı kabına atın. - 20 μm hücresüzü adım 2.1.5'ten yeni bir 50 mL konik tüpe ters çevirin ve epitel hücrelerini süzgeçten 20 mL organoid ortam(Malzeme Tablosu)ile yıkayın ve %1 kalem/strep ile tamamlayın.
- 5 dk için 500 x g adım 2.1.5 ve 2.1.6 konik tüpler santrifüj.
- Toplanan stromal hücrelerle, supernatant çıkarın ve kırmızı kan hücresi lisis tampon 10 mL ile pelet resuspend. 37 °C'de 10−15 dk. Konik tüpü 5 000 x g 5 dk için santrifüj edin, süpernatantı çıkarın ve 200−300 μL organoid ortamla peleti yeniden askıya alın (daha fazla talimat için 2.2.2 numaralı adıma bakın).
- Toplanan epitel hücreleri ile, supernatant çıkarın ve organoid medya 100 μL ile yeniden askıya (daha fazla talimatlar için adım 2.2.2 bakınız).
- Tohumlama hücreleri
- 24 kuyulu bir tablanın kuyularında %1,5 agarose kalıplarını (kuyu başına 1 kalıp) dengeledikten sonra, agarose kalıplarının dışındaki organoid ortamı çıkarın ve doku kültür plakasını yatırın, böylece agarose yemeklerinin hücre tohumlama odasından orta dikkatle kaldırılır.
- Mikroskop altında epitel (adım 2.1.9) ve stromal (adım 2.1.8'den) hücre süspansiyonlarını görüntüleyin. Epitel veya stromal hücre süspansiyonlarına bir seferde 100 μL daha fazla organoid ortam ekleyin, böylece süspansiyonlar yoğunluğu kabaca eşit olur.
NOT: Epitel hücreleri bir araya toplanır ve epitel hücrelerini tek hücresüspansiyonlarına sindirmek/denemek tavsiye edilmez. - Stromal hücrelerin 1 kısmını epitel hücrelerinin 3 bölümü ile hacmine göre birleştirin.
- Pipet 50 μL (60.000 hücre) agarose kalıp hücre tohumlama odasına kombine hücre süspansiyon.
- Agarose kalıpları hücrelerle doldurulduktan sonra, 24 kuyulu plakanın kuyusuna 400 μL taze organoid ortam ekleyin.
NOT: Ortam agarose yemeklerinin yüzeyinin hemen altına ulaşır ve hücrelerin kalıplardan dışarı süzülmesine neden olmaz. 2−3 gün sonra hücreler yerleşir ve organoidler oluşturmaya başlar. - 500 μL organoid ortam ile her iki günde bir orta yıkın.
- 2-3 gün sonra, epitel ve stromal hücrelerin örgütlenmesini teşvik etmek için 0.1 nM estradiol (E) ve 0.8 nM testosteron (T) ile takviye edilen bir ortam değiştirin.
NOT: Epitel ve stromal hücrelerin organizasyonu hormonlu veya hormonsuz oluşabilir rağmen, daha fazla organoidler hormonların varlığında organize olacaktır.
3. Deneyler için Endometrial Organoidlerin Hasat
NOT: Deney yapıldıktan sonra histoloji veya RNA analizi için endometrial organoidler işlenebilir. Aşağıdaki adımlar organoidlerin nasıl işlenir olduğunu açıklar.
-
Histoloji
- Fosfat tamponlu salinde (PBS) %1.5 agarose kaynatılarak çözün. Sıvı agarose yaklaşık 50 °C'ye soğumasını bekleyin.
- Bir diseksiyon mikroskobu altında, 24-iyi plaka tilt ve dikkatle agarose kalıp dışından orta pipet. Organoidleri bozmamak için agarose kalıbının içinden ortayı dikkatlice çıkar.
- Bir diseksiyon mikroskobu altında, dikkatle pipet 70-75 ° L sıcak (50 °C) 1.5% agarose agarose çanak odasına. Organoidleri rahatsız etmemeye dikkat edin.
- 4 °C'de 5 dk soğumaya bırakın.
- 24 kuyu plakasının her bir kuyuya %4 paraformaldehit (PFA) ekleyin ve 4 °C'de organoidiçeren tüm mühürlü agarose kalıbını düzeltin. Daha sonra 4 °C'de %70 etanolde parafin gömme işlemi ne kadar hazır olana kadar saklayın.
-
RNA yalıtımı
- Bir diseksiyon mikroskobu altında, 24-iyi plaka tilt ve dikkatle agarose kalıp odasından orta pipet.
- Zorla pipet 1 mL taze organoid orta doğrudan agarose kalıbına böylece organoidler mikrowells dışarı atılır. Çok fazla kabarcıklar oluşturmak için dikkatli olun.
- 3.2.2 adımdan aynı ortamla pipetlemetekrar tekrarlayın.
- Organoidler içeren tüm orta toplayın. Organoidleri toplamak ve RNA ekstraksiyonuna geçmek için maksimum hızda santrifüj.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Protokol şeması Şekil 1'degösterilmiştir. Komindoku patologlar tarafından incelendikten sonra ameliyatla elde edildi. Endometriyal astar kazınarak miyometriumdan ayrılmış ve endometriyal doku enzimatik olarak protokolde belirtildiği gibi hücrelere sindirilmiştir. Epitel ve stromal hücreler agarose kalıplarında mikrowelllere eklendi. Kültürde 7 gün kaldıktan sonra organoidler 7−14 gün daha E ve T ile tedavi edildi.
Histolojik işlemler için, endometriyal organoidler...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Ekzojen iskele malzemeleri kullanılmadan endometriumun epitel ve stromal hücrelerinden oluşan insan endometriyal organoidleri ürettik. Birincil endometrial epitel hücrelerininorganoidler6,7oluşturabildiği gösterilmiş olsa da, bu hücreler fare sarkom hücreleri tarafından salgılanan jelatinimsi bir protein matrisine gömülmüştür (bkz. Malzemeler Tablosu) spheroid benzeri yapılar oluşturur. Buna ek olarak, endometrial stromal hücreler yoktu. Sistemim...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Teşekkürler
Bu çalışma NIEHS/NIH/NCATS UG3 hibe (ES029073) ve Northwestern Feinberg School of Medicine Bridge fund (JJK) tarafından finanse edilmiştir. Biz parafin katıştırma için sabit organoidler işleme için Northwestern Patoloji Çekirdek Tesisi kabul etmek istiyorum. Woodruff, Burdette ve Urbanek laboratuvarları da dahil olmak üzere tüm UG3 ekibini anlayışlı tartışmalar ve işbirlikleri için kabul etmek istiyoruz.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Agaroz HS, moleküler biyoloji sınıfı | Denville Scientific | CA3510-6 | |
| Agaroz kalıpları | Sigma-Aldrich | Z764043 | (https://www.microtissues.com/) |
| Amonyum klorür (NH < alt > 4 < / alt > Cl) | Amresco | 0621 | |
| ve beta; -Estradiol | Sigma-Aldrich | E2257 | |
| Kollajenaz, Tip II, toz | Thermo Fisher Scientific | 17101015 | |
| Dispase | Corning | 354235 | |
| DNase I | Sigma-Aldrich | D4513 | |
| EDTA | Fisher Scientific | BP120-1 | |
| Eozin Lekesi | VWR | 95057-848 | |
| Östrojen Reseptörü (SP1), tavşan monoklonal antikoru | Thermo Fisher Scientific | RM-9101-S | |
| DAPI ile Fluoroshield, histoloji montaj ortamı | Sigma-Aldrich | F6057 | |
| Hank'in Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS) | Corning | 21-022-CV | 1x kalsiyum, magnezyum ve fenol kırmızısı içermez |
| Hematoksilen Leke Çözeltisi | Thermo Fisher Scientific | 3530-32 | Modifiye Harris formülasyonu, cıva içermeyen |
| Heparin çözeltisi | KÖK HÜCRE TEKNOLOJİLERİ | 07980 | MammoCult media'ya eklendi |
| Hidrokortizon stok çözeltisi | STEMCELL Technologies | 07925 | MammoCult media'ya eklendi |
| Organoid media - Mammocult | STEMCELL Technologies | 05620 | 2 µ ile desteklenmiş; L / mL heparin ve 5 &mikro; L/mL hidrokortizon |
| Paraformaldehit, %16 çözelti | Elektron Mikroskobu Bilimleri | 15710 | |
| Penisilin-Streptomisin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Fosfat tamponlu salin, pH 7.4 | Sigma-Aldrich | P3813 | |
| Progesteron Reseptörü, PgR 1294, eşlenik, kültür süpernatantı | Agilent Technologies | M356801-2 | |
| protein matrisi - Matrigel | BD Biosciences | 356231 | |
| Saflaştırılmış fare anti-E-kaderin antikoru | BD Biociences | 610181 | Clone 36 |
| Rekombinant anti-vimentin antikoru [EPR3776] | Abcam | ab92547 | |
| RNA lizis ve izolasyon kiti | Zymo Research | R2060 | |
| Sodyum bikarbonat (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S6014 | |
| Testosteron | Sigma-Aldrich | 86500 | |
| Trikrom Leke | Abcam | ab150686 | |
| Balmumu filmi - Parafilm | VWR | 52858-000 |
Kaynaklar
- Henriet, P., Gaide Chevronnay, H. P., Marbaix, E. The endocrine and paracrine control of menstruation. Molecular and Cellular Endocrinology. 358 (2), 197-207 (2012).
- Gellersen, B., Brosens, I. A., Brosens, J. J. Decidualization of the human endometrium: mechanisms, functions, and clinical perspectives. Seminars in Reproductive Medicine. 25 (6), 445-453 (2007).
- Gellersen, B., Brosens, J. J. Cyclic decidualization of the human endometrium in reproductive health and failure. Endocrine Reviews. 35 (6), 851-905 (2014).
- Li, Q., et al. The antiproliferative action of progesterone in uterine epithelium is mediated by Hand2. Science. 331 (6019), 912-916 (2011).
- Wetendorf, M., DeMayo, F. J. The progesterone receptor regulates implantation, decidualization, and glandular development via a complex paracrine signaling network. Molecular and Cellular Endocrinology. 357 (1-2), 108-118 (2012).
- Boretto, M., et al. Development of organoids from mouse and human endometrium showing endometrial epithelium physiology and long-term expandability. Development. 144 (10), 1775-1786 (2017).
- Turco, M. Y., et al. Long-term, hormone-responsive organoid cultures of human endometrium in a chemically defined medium. Nature Cell Biology. 19 (5), 568-577 (2017).
- Kurita, T., et al. Stromal progesterone receptors mediate the inhibitory effects of progesterone on estrogen-induced uterine epithelial cell deoxyribonucleic acid synthesis. Endocrinology. 139 (11), 4708-4713 (1998).
- Kim, J. J., Kurita, T., Bulun, S. E. Progesterone action in endometrial cancer, endometriosis, uterine fibroids, and breast cancer. Endocrine Reviews. 34 (1), 130-162 (2013).
- Bui, H. N., et al. Dynamics of serum testosterone during the menstrual cycle evaluated by daily measurements with an ID-LC-MS/MS method and a 2nd generation automated immunoassay. Steroids. 78 (1), 96-101 (2013).
- Wiwatpanit, T., Murphy, A. R., Lu, Z., Urbanek, M., Burdette, J. E., Woodruff, T. K., Kim, J. J. Scaffold-free endometrial organoids respond to excess androgens associated with polycystic ovarian syndrome. The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. , (2019).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
