Dalgalanma Tsalimi ile Mikrobiyal Mutasyon Oranlarının Ölçülmesi

Özet

Burada, bir dalgalanma test gerçekleştirmek ve mikrobiyal mutasyon oranını tahmin etmek için bir protokol sunulmuştur. Bu protokol, araştırmacıların farklı mikrop ve ortamlardaki mutasyonları tetkik etmelerini sağlayarak genotip ve ekolojik bağlamın spontan mutasyon oranlarını nasıl etkilediğini belirleyecektir.

Özet

Dalgalanma tahlilleri, sıvı ortamlarda büyüyen mikroplardaki mutasyon oranlarını tahmin etmek için yaygın olarak kullanılmaktadır. Birçok kültür her birkaç bin hücre ile aşılanmış, fenotipik olarak test edilebilir seçici bir belirteç her duyarlı. Bu paralel kültürler, bilim kaleminin yokluğunda birçok nesil boyunca büyür. Kültürlerin bir alt kümesi mutasyon riski altındaki hücrelerin toplam sayısını tahmin etmek için kullanılır (yani, büyüme döneminin sonundaki popülasyon büyüklüğü veya N_t). Kalan kültürler seçici agar üzerine kaplanır. Gözlemlenen dirençli mutantların paralel kültürler arasında dağılımı, matematiksel bir model kullanılarak beklenen mutasyonel olayların sayısını tahmin etmek için kullanılır. M'nin N_t ile bölünmesi, nesil başına lokus başına mutasyon oranının tahminini verir. Testin üç kritik yönü vardır: seçilen henotypik belirteç, paralel kültürlerin seçilen hacmi ve seçici agar yüzeyinin kuluçkadan önce tamamen kuru olmasını sağlamak. Test nispeten ucuz dur ve sadece standart laboratuvar ekipmanına ihtiyaç duyar. Ayrıca mutasyon birikimi ve tek hücreli tahliller gibi alternatif yaklaşımlardan daha az zahmetlidir. Tetki hızla birçok nesiller boyunca gitmek organizmalar üzerinde çalışır ve belirteçleri ve hücre ölümü fitness etkileri hakkında varsayımlar bağlıdır. Ancak, son zamanlarda geliştirilen araçlar ve teorik çalışmalar bu sorunların artık analitik olarak ele alınabileceği anlamına gelir. Titre, izole veya bir toplumda büyüyen farklı genotiplere sahip hücrelerdeki farklı henotypik belirteçlerin mutasyon oranı tahminini sağlar. Paralel olarak birden fazla tahlil yaparak, tahliller bir organizmanın çevresel bağlamının spontan mutasyon oranını nasıl etkilediğini incelemek için kullanılabilir, bu da antimikrobiyal direnç, karsinogenez, yaşlanma ve evrimi anlamak için çok önemlidir.

Giriş

1901 yılında Hollandalı botanikçi Hugo de Vries mutasyon 1 terimini icat^etti. Yirmi altı yıl sonra, Hermann Joseph Muller X-ışınları²mutajenik eylem keşfetti, mutasyonlar zaten evrimitici güçlerinden biri olarak algılandı. Ancak mutasyonların niteliği açık değildi. Mutasyonların kendiliğinden mi (yani spontan bir mutasyon) mı yoksa seçime yanıt olarak mı (yani indüklenmiş mutasyon) ortaya çıkıp çıkmayacağı sorusunu cevaplamak için mutasyona neden olan olayları gözlemlemek için bir yönteme ihtiyaç vardı. Böyle bir yöntem hücre bölünmesi başına beklenen mutasyon sayısını veya mutasyon oranı olarak bilinen mutasyon oranını^ölçecek,4.

Şekil 1: 96 derinliğindeki bir kuyu plakasında mikrobiyal bir türle dalgalanma tayininin nasıl yapılacağının şematik illüstrasyonu. (A) Beş farklı ortam ('kırmızı', 'mavi', 'yeşil', 'mor' ve 'turuncu' tahlilleri) içeren 50 mL'lik tüplerdeki hücreleri aşılama ve alıştırın. (B) 96 derin kuyu plakasında az sayıda hassas hücre ile paralel kültürler hazırlayın. 'Kırmızı' tahlil 20 paralel kültüre sahipken, 'mavi', 'yeşil', 'mor' ve 'turuncu' tahlillerin hepsi 19 paralel kültüre sahiptir. Paralel kültürlerin 96 derin kuyu plakası üzerindeki konumları rastgeledir. Randomizasyon Ek LayoutGenerator.R komut dosyası veya başka bir araç ile yapılabilir. Sağ üstteki düzen rasgeleleştirme sonucudur. (C) 96 derin kuyu plakakuluçka ve hücrelerin bölmek ve kendiliğinden mutasyona izin. Derin kuyulardan A1, B1, C1, E1, F1 ve G1'den altı kültür mutant sayısının nasıl dalgalı olduğunu göstermektedir: üçüncü hücre bölünmesinden sonra sırasıyla 4, 0, 2, 2, 1 ve 4 kırmızı hücre. Mutantların sayısı sadece spontan mutasyonların farklı sayıda (0, 1, veya 2 ilk kırmızı hücre tarafından gösterildiği gibi) nedeniyle değil, aynı zamanda bir kültür döngüsü sırasında bir direnç mutasyonu kendiliğinden ortaya çıktığında önemli olduğu için (hücre bölünmesi 1, 2 veya 3). (D) 96 derin kuyu plakasının inkübasyonundan sonra mutantların sayısı 81 paralel kültürün kaplaması ile belirlenir. Düzende bunlar kalın kenarlı dairelerdir. Tüm paralel kültür seçici bir agar içeren 6 kuyu plaka bir kuyu üzerine kaplanır. (E) Kalan 15 kültür seyreltilir ve ortalama hücre sayısını belirlemek için seçici olmayan agar üzerine kaplanır (N_t). Düzende bunlar Ntwells olarak etiketlenir ve kenarlıklara sahiptir. Her bir tsay N_t için üç paralel kültür üzerinde ortalama. Sağ altta derin bir kuyu D1 (bir 'yeşil' töz parçası) yetiştirilen seyreltilmiş bir kültür 25 CPU ile non-selektif bir agar plaka içeren bir Petri çanak. (F) Selektif 6 kuyu plakasının inkübasyonundan sonra gözlenen mutant ların sayısı sayılmış ve beklenen mutasyonel olay sayısı, m, maksimum olasılık tahmincisi kullanılarak tahmin edilmiştir. (G) Mutasyon ların sayısını, mve tsay başına hücre sayısını bilmek, N_t, mutasyon oranı m/N_tolarak tahmin edilebildi . Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Salvador Luria ve Max Delbrück 1943 yılında dalgalanma tsay⁵ ile bu soruna dahice bir çözüm sağladı (Şekil 1bakınız). Test, az sayıda mikrobiyal hücreile başlatılan birden fazla popülasyonla (paralel kültürler olarak adlandırılır) başlar(Şekil 1A,B). İyi huylu, seçici olmayan bir ortamda(Şekil 1C)büyümeden sonra, paralel kültürler selektif belirteç (fajlar, antibiyotikler vb.) içeren plakalara aktarılır ve sadece direnç mutasyonu olan hücreler hayatta kalır ve koloni üretebilirler(Şekil 1D). Ana beklenti, direnç mutasyonları indüklenirse, mutasyon taşıyan hücre sayısının farklı popülasyonlar arasında ortalama varyansa eşit olarak dağıtılması gerektiğiydi. Luria ve Delbrück'ün dalgalanma tartışımıyla buldukları şey, mutantların sayısının büyük ölçüde dalgalandığını ve farklı popülasyonlar arasındaki mutant ların sayısındaki farkın ortalamadan çok daha fazla olduğudur. Luria ve Delbrück mutasyonların spontan olduğunu gösterdiler. DNA kopyalandığında mutasyonların kendiliğinden ortaya çıktığını gösterdiler ve mutantların sayısı popülasyonun büyümesi sırasında mutasyonun ne zaman meydana geldiğine bağlı. Her biri mikrobiyal hücre (mavi) ile başlatılan altı popülasyonun hiçbirinin, 1 veya 2 tek mutasyonun yaşamadığı Şekil 1C'yebakın. Popülasyonlar A1, E1 ve F1 tek bir mutasyon (ilk kırmızı hücre) yaşadı, ancak tek bir mutasyon bir kültür döngüsü sırasında çeşitli zaman noktalarında kendiliğinden ortaya çıktığı için, popülasyonlar çok farklı sayıda gözlenen mutantla sonuçlandı (sırasıyla dört, iki ve bir). Öte yandan, C1 ve G1 popülasyonları, bir yerine iki mutasyonolayı yaşamalarına rağmen, E1 ve A1 ile aynı sayıda gözlenen mutanta sahip oldu. Popülasyonlar arasında gözlenen mutantların dalgalanması sadece titreşmeyi söylemekle kalmamış, aynı zamanda mutant frekansının (yani mutant hücrelerinin oranının) mutasyon oranının yetersiz bir göstergesi olduğunu göstermiştir.

Dalgalanma tartışımının genel amacı, belirli bir sıvı ortamda büyüyen belirli bir bakteri veya diğer tek hücreli organizmanın spontan mutasyon oranını tahmin etmektir. Dalgalanma testi mikrobiyal mutasyon oranlarının çevresel bağımlılığını incelemek için en uygun araç olmaya devam eder ve hızlı ve ucuz mutasyon oranı tahminisağlar. Mutasyon oranı tahminine alternatif yaklaşımlar, örneğin maksimum derinlikte sıralama⁶, popülasyon sıralama⁷, mutasyon birikimi^{deneyleri 8}, ya da ebeveynlerin ki bir yavrunun genom dizilerini karşılaştırarak⁹ çok daha zahmetli, ve böylece potansiyel olarak çevresel bağımlılıkları tespit etmek için kötü uygundur. Ancak, bir mutasyonun oluşumu nun ve onarımının dinamik yönleri, bir dalgalanma tsay'ı veya yukarıda listelenen bir mutasyon oranını doğrulama yöntemlerinden herhangi biri için büyük ölçüde erişilemez. Mutasyonların sayısının zaman, mekan veya bir popülasyon içindeki tek tek hücreler arasında nasıl değiştiğini incelemek için, tek hücre yaklaşımları^11,12 gereklidir, bu da dalgalanma testlerinden daha zahmetli olmanın yanı sıra, son derece özel beceri ve ekipman gerektirir.

Uygulamada, bir dalgalanma tsay hücreleri bir henotypic marker bu marker için seçim eksik bir ortamda meydana gelen bir mutasyon nedeniyle bir henotypic marker kazanıyor sayma. Yayınlanmış yüzlerce tahlil^10'un meta-analizi, tahlilin 1943'teki kuruluşundan bu yana en az 39 farklı henotibik belirteç kullanıldığını göstermektedir. Dalgalanma tsay laboratuvar, klinik, nonmutator ve mutasyon suşları arasında mutasyon oranlarının ortalamaları ve çevresel bağımlılık karşılaştırmak için kullanılabilir müsamahakar ortamlarda büyüyen. Tizin, minimal veya zengin ortamlarda büyüyen farklı genetik geçmişe sahip hücrelerde mutasyon oranı tahminisağlar. Tetki sadece monokültür olarak büyüyen popülasyonlar için uygun olmakla kalmıyor, aynı zamanda hücre-hücre etkileşimlerinin mutasyon oranları üzerindeki etkilerini incelemek için de kullanılabilir^11. İlgi gerilimi ikinci bir türle birarada olduğunda ve suşları ayırt etmek için nötr bir belirteç kullanıldığında, aynı tüpteki iki suş için mutasyon oranları aynı anda titreşebilir.

Dalgalanma tahlilleri spontan mutasyon oranının hem bir hücrenin genotipine hem de çevresine bağlı olduğunu ortaya koymuştur¹² ve kendisi¹³evrimleşen bir özelliktir. Belirli bir genotipin mutasyon oranı çevreile değiştiğinde mutasyon oranı plastisite¹¹olarak tanımlanır. Plastik mutasyon oranları en iyice strese bağlı mutagenez (SIM)¹⁴için ele alınmıştır. Buna ek olarak, dalgalanma tahlilleri kullanılarak, son zamanlarda hücre popülasyonunun (genellikle taşıma kapasitesinde bir parti kültürü) büyüdüğü yoğunluğun bakteriler ve tek hücreli ökaryotlar arasındaki mutasyon oranlarıyla yakından ilişkili olduğu gösterilmiştir. Üretim başına genom başına mutasyon oranı yoğun popülasyonlarda 23 kat^10,11kadar azalır. Bu yoğunlukla ilişkili mutasyon oranı plastisite (DAMP) bir çoğunluk algılama sistemi¹⁵ bağlı olabilir ve SIM¹⁶bağımsız hareket .

Burada, escherichia coli suş K-12'nin glikoz minimal ortam ortamında antibiyotik rifampisine direnç kazandırması için kullanılan dalgalanma teşbiiçin ayrıntılı bir protokol sunulmuştur. Ancak, bu protokol sadece mutasyonun kültür koşullarını ve henotibik belirteçlerini değiştirerek çok çeşitli mikropları incelemek için kullanılabilen temel bir şablon olarak görülmelidir. Protokol başlangıcından itibaren gelişti^{5,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29} mikroplar ın geniş bir yelpazede kullanımı ile ve hatta kanser hücreleri³⁰ ve artırmak için modifiye edilmiştir mikrobiyal mutasyon^{oranlarının}çevresel bağımlılıklarının doğru bir şekilde test edilmesi için gerekli olan iş artışı^{10 ,11,16.} Burada açıklanan protokol zaten literatürde tartışılan dalgalanma teşbe tüm metodolojik ve analitik konuları kapsamaz, dirençli mutasyonların özellikle fitness etkileri³¹, fenotipik gecikme³², hücre ölümü³³, ve mutasyon oranlarını tahmin etmek için çeşitli algoritmaların uygunluğu^26,34. Bu önemli olabilir, örneğin, fitness etkilerinin çevresel bağımlılık mutasyon oranı tahminleri hatalı varyasyona yol açabilir³⁵. Ancak, burada kullandığımız analitik araçların mutant fitness ve hücre ölümü varyasyonu ile başa çıkabileceğini unutmayın. Notlar ve tartışma ele olarak, aynı çevreye bağımlı fitness etkileri olması olası değildir birden fazla henotypic belirteçleri dikkate alınması tavsiye edilir. Bu protokol, insanların mikrobiyal suşların ve ortamların çeşitliliğinde mutasyon oranlarının çevresel bağımlılıklarını rutin olarak hesaplamalarını sağlayacaktır. Farklı ortamlardaki mutasyonların henüz tam olarak test edilmemiş olduğunu ve popülasyon yoğunluğu düşünüldükten sonra dalgalanma tahlilleri mutasyon oranı nın daha kesin bir tahminini verebilir¹⁰. Bu protokol, mutasyon oranlarını destekleyen mekanizmaların anlaşılması için gerekli olduğu gibi, evrim, karsinogenez, yaşlanma ve antimikrobiyal direnci anlamak için hayati önem taşıyan daha fazla dalgalanma denemesi yapılmasını sağlayacaktır.

Protokol

1. Gün 1: Kültürlerin Aşılanması ve Uyumu

1. E. coli MG1655 gliserol stoğundan ( gliserol, -80 °C) 3 mL sıvı likit et suyu (LB, bkz. Ek Tablo 1)aşılayınız. LB kültürünü 37 °C'de ~7 saat için 120 rpm'de çalkalayın.
   NOT: Bu deneyde, LB büyüyen E. coli K12 MG1655 kullanılır, ancak bu titreşme herhangi bir E. coli suşu veya diğer culturable mikrobiyal türler ile yapılabilir. Kuluçka sıcaklığı, kuluçka süreleri ve büyüme ortamının besin düzeyi türlere veya zorlanmaya göre değişime tabi olabilir.
2. Tuzlu çözeltiyi kullanarak kültürü 2000 kat seyreltin. Seyreltilmiş çözeltinin 100 μL'sini üç adet 50 mL vidalı konik polimer tüpe (50 mL tüp) 10 mL sıvı Davis minimal orta (DM, ek tablo 1'ebakınız), sırasıyla 80 mg/L, 125 mg/L veya 250 mg/L glikoz içeren ekleyin. Bu, mutasyon oranının tahmin edilen ortamla (yani çevre) aynıdır. 37 °C'de bir gecede 120 rpm'de kültürleri sallayın.
   NOT: Ortam seçimi türler, zorlanma veya araştırma sorusuna göre değişime tabidir.

2. Gün 2: Paralel Kültürlerde Mutantların Nesli

1. İlk olarak, bakterilerin kültüredeceği ortamları hazırlayın. Her zaman gerekenden daha fazla hazırlayın (yani, yirmi 1 ml kültürler 22 mL gerektirir). Hazırlamak 22 mL 1) DM ile 80 mg / L glukoz, 2) DM ile 125 mg / L glukoz, 3) DM ile 250 mg / L glukoz, 4) DM ile 80 mg / L glukoz, ve 5) DM ile 250 mg / L glukoz 5 50 mL tüpler. Sırasıyla GLC-80A, GLC-125, GLC-250A, GLC-80B ve GLC-250B olarak etiketleyin.
2. Ortamlar için inocula hazırlayın. Ortamın 1 mL'lik inoculumunun 1.000−5.000 hücre içerdiğinden emin olun. Bunu aşağıdaki adımları izleyerek yapın.
   1. Geceleme kültürlerinin optik yoğunluğunu (OD) 600 nm'de ölçün (adım 1.2'den).
   2. Glikoz ile DM mL başına 1.000-5.000 hücre son yoğunluğuna ulaşmak için her gece kültürü seyreltin. Elimizde, 2.2.1 cinsinden ölçülen OD 0.3 ise, bu bir gecede kültürün 100 kat seyreltme (tuzlu çözelti) yapmak anlamına gelir, daha sonra 22 mL ortama bu çözeltinin 11μl ekleyerek.
3. Paralel kültürler hazırlayın.
   NOT: Bu protokol, üç ortam kullanılarak beş dalgalanma tahlilleri (bir 96 kuyu plakası üzerindeki maksimum makul sayı) gerçekleştiren bir 96 derin kuyu plakası için yazılmıştır. Deneyim le, birden fazla derin kuyu plakaları paralel olarak çalıştırılabilir.
   1. Bir 96 derin kuyu plaka için paralel kültürlerin rasgele bir düzen oluşturun. Ek R komut dosyası LayoutGenerator.R (Şekil 1B'dekidüzene bakın) bunun için kullanılabilir. Her paralel kültürü 96 derin kuyu plakasına düzene göre yerleştirin.
      NOT: LayoutGenerator.R çalıştıran ilk tahlil 20 paralel kültürlere sahip olmasını sağlayacak, ve ikinci, üçüncü, dördüncü ve beşinci tahliller 19 paralel kültürlerher sahip.
   2. Randomize düzene göre 96 derin kuyu plakasının her kuyuya 1 mL aşılanmış ortam aktarın.
   3. Bant ile derin kuyu plaka kapağını düzeltin. Kapağı sıkıca tamir etmeyin, çünkü kültür büyümesi havalandırma miktarına duyarlıdır.
   4. Kapağı ve bandı ile tüm plaka tartın ve 37 °C'de 24 saat için 250 rpm plaka sallamak. Deneysel setler arasında buharlaşma miktarını stabilize etmek için kuvözde 2 L distile su yerleştirin.
4. Non-selektif Tetrazolyum (TA) agar plakası üzerindeki aşılanmış ortamların her birinin 10 μL'lik kaplaması ile inokül boyutunu belirleyin (Ek Tablo 1'ebakınız). Agar yüzeyi kuruyana kadar steril L şeklinde bir yayıcı kullanın. Tüplü TA agar plakaları bir gecede 37 °C'de kapanık.
   NOT: TA agar şeker L-arabinose ve suda çözünen boya 2,3,5-triphenyltetrazolium klorür içeren zengin bir agar, okside şeklinde renksiz. Bakteri boyayı azalttığında formazan oluşumu nedeniyle kırmızıya döner. Ta agar'da L-arabinose kullanamayan koloniler koyu kırmızıdır. MG1655 gibi diğer suşlar pembemsidir. Renkli bakteri kolonileri daha güvenilir ve hızlı sayma yapar, nokta daha kolay olduğu için standart LB agar yerine TA agar kullanımı tavsiye edilir.
5. 6 kuyu plakası içinde rifampisin içeren seçici TA agar hazırlayın. Pipet 5 mL seçici TA agar 6 kuyu plakası her kuyu içine. Antibiyotik rifampisini TA agar'a eklenmeden hemen önce hazırlayın.
   NOT: Sikloserin bir belirteç olarak kullanıldığında, agar ve L-arabinose ile takviye glukoz 250 mg /L ve seçici agar olarak 2,3,5-triphenyltetrazolium klorür ile Davis minimal orta kullanın. Yani, TA agar sikloserin dirençli sadece hücreleri seçmez, tripto ve maya ekstresi çünkü (TA agar hem temel bileşenleri) amino asit D-alanin içerir. Bu amino asit sikloserin antimikrobiyal etkisi antagonize ve tüm hücrelerin bir koloni yapmak için izin verir.
   1. Seçici ve kalan seçici olmayan plakaları karanlıkta (örn. bir kutuda) oda sıcaklığında bırakın.

3. Gün 3: Seçici ve Non-selektif Agar Plakaları Kaplama Kültürler

1. Seçici olmayan agar plakaları üzerinde koloni oluşturan birimleri (CFU) sayın ve CFU'yu 100 ile çarparak inoculanın boyutunu belirleyin. Bu, paralel kültürün hacmi (1 mL = 1.000 μL) ile kaplamalı hacim (10 μL) arasındaki orandır.
   NOT: Seçici olmayan plakalar buzdolabında saklanırsa CFU daha sonra sayılabilir.
2. Kuluçka 24 saat sonra, buharlaşma miktarını belirlemek için tüm derin kuyu plaka tartMak. Bu yaklaşık% 10 olması muhtemeldir.
3. Başlangıç hacmi V[0h] = 1.000 μl ve büyüme ortamının yoğunluğumg/μl cinsinden ölçüldüğünde plakanın ağırlığı mikrolitrelere dönüştürülerek mikrolitrelerde 24 saat kuluçkadan sonra paralel kültürün ortalama hacmini(V[24h]) hesaplayın. Bu çalışmada 1 mg/μl yoğunluk kullanır:
   
4. Her tsay başına rastgele seçilen üç kültürü (Şekil 1B'dekidüzende siyah bir daire ile vurgulanmış toplam 15) etiketli mikrosentrifüj tüplere aktarın. Son popülasyon boyutunu (veya N_t)belirlemek için daha sonra kullanılmak üzere bankta bırakın (bkz. adım 3.6).
5. Kalan 81 paralel kültürü derin kuyu plakasından rifampisin içeren seçici TA agar'a koyun. Pipet, 96 derin kuyu plakasından 6 kuyuluk bir kuyuya kadar bütün bir paralel kültür. Herhangi bir 6 kuyu plakabirden fazla dalgalanma tsay paralel kültürleri içerdiğinden emin olun.
   1. Seçici agar plakaları kapakları çıkarın ve steril koşullarda ortaya bırakın. Seçici TA agar yüzeyindeki tüm sıvıyı kurutun.
      NOT: Agarın tamamen kuru olması çok önemlidir. Ancak, seçici TA agar ıstırmayın, çünkü çatlamasına izin verilmemelidir.
6. Seçici TA agar plakaları kururken, birkaç saat kadar sürebilir, adım 3.4 koloni şekillendirme birimleri (CFU) kullanılarak hazırlanan 15 kültürün N_t belirlemek.
   1. Mikrosantrifüj tüplerinden kültürleri seyrelterek CFU'yu belirleyin. Her adımda kültürün 100 μL'si ile 900 μL tuzlu çözeltiyi karıştırıp girdaplayarak beş adet 10 kat seyreltme adımı kullanın. Seçici olmayan TA agar ve inkübat plakaları üzerinde son seyreltme faktörü (10⁵seyreltme faktörü ile) plaka 40 μL bir gecede aşağı 37 °C'de kapağı.
      NOT: 96 kuyu plakalı seyreltme serisi, bu adımın hızını artırabilecek çok kanallı pipet ile gerçekleştirilebilir.
7. Bir kez 6 kuyu plaka üzerinde tüm kuyular kültür sıvı ücretsiz, geri kapağı koymak ve tüm 6 iyi plakalar kuruolana kadar bankta aşağı kapağı ile 6 iyi plaka yerleştirin. Hepsi kuruyunca, plakaları 37 °C'de 44-48 saat boyunca kuluçkaya yatırın.
   NOT: Diğer belirteçler için (nalidixic asit, sikloserin, higromisin B veya 5-FOA) 68-72 saat boyunca plakalar inkübe. Kuvözdeki nem oranının yüksek olduğundan emin olun. Seçici agar plakaların kuluçka döneminde kurumaması çok önemlidir.

4. Gün 4: Kültürlerdeki Hücre Sayısının Belirlenmesi

1. Seçici olmayan agar plakaları üzerinde CFU saymak. CFU'yu seyreltme faktörü (10⁵⁾ile çarparak kültürdeki canlı hücre sayısını tahmin edin ve mikrolitrelerde hesaplanan ortalama hacim V[24h]ile (bkz. 3.3 adım) ve kaplamalı hacim (40 μl) arasındaki oran:
   
2. Belirli bir ortamda yetişen belirli bir genotipn N_t üç kültürden bu değerlerin ortalamasıdır.

5. Gün 5: Mutasyon Oranının Tahmini

1. Seçici TA agar plakalarında antibiyotiğe dirençli kolonilerin sayısını (yani, derin kuyu plakasında spontan mutasyon sonucu ortaya çıkan dirençli hücrelerin sayısı 2−3) saymak. Belirli bir titreşme için (örneğin, sıfır sayıları da dahil olmak üzere 16 veya 17 değer) için mutantların gözlenen sayısının paralel kültürler arasındaki dağılımı kaydedin.
   NOT: Seçici plakalar buzdolabında saklanırsa, antibiyotiğe dirençli koloniler daha sonra sayılabilir.
   1. Mutasyonel olayların sayısını tahmin etmek için her dağılımı kullanın, m, R-paket flan^{kullanarak 36}.
      NOT: Benzer işlevselliği²⁹ile R-paket rSalvador da vardır.
   2. Gözlemlenen mutantların dağılımını tek bir sütun olarak metin dosyasında tek bir töze kaydedin.
2. Aşağıda açıklandığı gibi m'yi tahmin etmek için Shinyflan yazılımını (http://shinyflan.its.manchester.ac.uk/) kullanın.
   1. Sekmede Hipotez Testi değerleri varsayılan olarak bırakır (yani, Bilinmeyen Fitness işaretli, Tahmin Yöntemi = Maksimum Olasılık (ML), Mutant Yaşam Süresinin Dağılımı = Üstel (LD modeli), Winsor Parametresi = 1.024, Mutasyon Sayısı ve Fitness = 1, Güven Düzeyi = 0.95, Sınıf sayısı ve Maksimal Değer = 100).
   2. Gözat'ı tıklatın ve gözlenen mutantların dağılımı ile metin dosyasını seçin. İlk olarak Ek Veri dosyasını deneyin.
   3. Dosyayı yükledikten sonra Test Yap'atıklayın. Test sonucu altındasağ tarafta , One Sample ML-Test (LD modeli) altında, Mutasyon Numarasıbulabilirsiniz. Bu m,mutasyonel olayların beklenen sayısıdır.
   4. Mutasyon Numarası için Yüzde 95 Güven Aralığının altında m'ninüst ve alt sınırını bulun.
3. M ve N_t (CFU tarafından belirlenen) kullanılabilir hale gelince, belirli bir ortamda belirli bir genotipin mutasyon oranını tahmin edin. M'deki üst ve alt sınırları n_t ile aynı şekilde bölünerek mutasyon hızı üzerinde güven aralıkları oluşturur (NB bu, N_t'dekibelirsizliği hesaba katmaz).
   NOT: Sonuçlar nesil başına rpoB locus başına mutasyon oranı olarak sunulmaktadır. Baz çifti başına mutasyon oranı rpoB lokus başına mutasyon oranının 79'a bölünmesiyle oluşturulur, ki bu da bir rpoB genindeki kaç nokta mutasyonunun rifampisin^37'yedirenç verdiğine güncel bilgimizdir. Nükleotit başına mutasyon oranının kromozom büyüklüğüyle(E. coli K-12 MG1655 = 4,639,675 bp) çarpılması genom başına mutasyon oranını verir.
4. Kalan dört dalgalanma tahlilleri ile 5.1−5.3 adımlarını tekrarlayın.

Sonuçlar

Sonuçlar, her hafta beş mutasyon oranı tahmini oluşturmak için 96 derin kuyu plakasının kullanıldığı üç farklı araştırmacı tarafından dört farklı hafta içinde rapor edilen protokolle toplandı. Toplamda üç adet 96 derin kuyu plakası, E. coli K-12 MG1655'te(Şekil 2A,protokolde kullanıldığı gibi) 15 mutasyon oranı tahmini (± 95% güven aralığı, CI) oluşturulurken, e. coli K-12 BW25113 ΔmutT mutant(Şekil 2B)beş tahmin için bir 96 derin kuyu plakası kullanılmıştır . Şekil 2'de m tahmin aralığına sahip ortanca hassasiyet ,5 (%1,00−(,9, n = 20) şeklindedir. Kesinlik, σ_m / m x 0 olarak hesaplanan beklenen mutasyoner olay sayısının(m)değişiminin bir katsayısıdır (σ'nin daha önce gösterildiği gibi³⁸olarak hesaplandığı yer). Şekil 2'nin ham verileri "Krasovec_etal_JoVE_data.csv" Ek Veri Dosyası'nda mevcuttur. Ek Veri Dosyası şekil 2oluşturmak için bir R komut dosyası eşlik ediyor. Ayrıca bakteri suşları hakkında daha fazla bilgi için Ek Tablo 2'ye ve veri dosyasındaki sütunların açıklandığı Ek Tablo 3'ebakınız. Rifampisin ve nalidixic asit ile elde edilen veri noktaları daha önce Krašovec ve ark.^10'da yayınlanmış ve ilk yayınlandığı zamanki gibi burada da aynı dislere sahip.

Şekil 2'de üç farklı fenotipik belirteç, sikloserin, rifampisin ve nalidixic asitin MG1655 mutasyon oranları sunulmuştur. Burada, protokolde açıklandığı gibi 80, 125 ve 250 mg/L glukoz ile Davis minimal ortamda mutasyon oranları değerlendirildi. Bir olguda 1.000 mg/L glukoz kullanıldı (Şekil 1B). Uygulamada, herhangi bir başlangıç glikoz konsantrasyonu kullanılabilir. Beklendiği gibi sikloserin direncinde mutasyon oranları daha yüksek, nalidixic asit direnci için en düşük ve rifampisin direnci oranı ortadaydı. Bu, en büyüğü sikloserin ve en küçüğün nalidixic asit olduğu bu üç direnç için bilinen hedef boyutlarına uygun olarak yapılır. Tartışma ve Şekil 3, mikrobiyal mutasyon oranlarının dalgalanma tsay ile ölçülmesine optimize etmek için hedef boyutları, paralel kültürlerin hacimleri ve çevredeki besin seviyelerinden nasıl yararlanılalabilenayrıntılar verir.

Dalgalanma töz, hangi suşun kurucu bir mutasyon olduğunu ve normal mutasyon oranlarına sahip olduğunu açıkça göstermektedir. ΔmutT suş mg1655 olarak nalidixic asit direnci(Şekil 2B)yaklaşık 50x daha yüksek mutasyonoranınasahipti (Şekil 2A ). Ancak, farklı ortamlarda belirli bir genotipmutasyon oranını belirlemek için, sadece bir fenotipik belirteç kullanarak ortam başına genotip başına en az beş kopya kullanılması önerilir. Daha önce bu tür deneyleri analiz etmek için kullanılan istatistiksel yöntemlerin ayrıntılı bir özeti için Krašovec ve ark.^10'dakiek bilgilere bakın.

Şekil 2: Escherichia coli popülasyonlarında dalgalanma tsay tarafından tahmin edilen mutasyon oranlarının temsili şekli. (A) Yabani tip MG1655 (daireler) bildirilen protokol tarafından belirlenen mutasyon oranı. Bu rakam rifampisin (açık mavi daireler), nalidixic asit (kırmızı daireler) ve sikloserin (koyu mavi daireler) direnci varlığında mutasyon oranlarını gösterir. Nalidixic asit için 10 mL'lik daha büyük kültür hacimleri kullanılmıştır (bkz. Ek Veri Dosyası). Rifampisin ve nalidixic asit verileri Şekil 2a'dan Krašovec ve ark.^10'danyeniden çizilir. (B) Keio³⁹ ΔmutT

Tartışma

Bir mutasyon oranı herhangi bir tahmin içinde ve çalışmalar arasında tekrarlanabilirlik sağlamak için elde edilen hassasiyeti en üst düzeye çıkarmak gerekir³⁴. Bir dalgalanma tsay için, üç kritik hususlar vardır. İlk ikisi verilen protokolde ayarlanmıştır, ancak protokol farklı suşlarla veya ortamlarla çalışacak şekilde uyarlanmışsa sorun giderme gerekir (Bkz. Şekil 3). İlk uygun henotypic marker seçmektir. Bakteriler için, iki marker loci, rpoB veya gyrA,antibiyotikler rifampicin ve nalidixic asit direnç conferring birinde oranları tahmin etmek için tavsiye edilir, sırasıyla. Bu iki loci de antibiyotik direnci mutasyonlar için hedef boyutu farklıdır. Rifampisin³⁷ ve nalidixic asit^40'a direnç veren 79 ve 20 benzersiz mutasyon vardır. Uygulamada, bu ortalama olarak, rifampisin dirençli mutantlar daha sık gözlenen anlamına gelir. Yani, cevaplanması gereken ilk soru (Şekil 3'tekiQ1) zorlanmanın bir mutasyon olup olmadığıdır. Birçok gözlemlenen mutant koloninin beklendiği kurucu mutasyonlar incelendiğinde, daha küçük bir hedef boyutuna (örneğin, nalidixic asit) sahip bir belirteç kullanmak daha iyidir. Şekil 2B'yebakınız, kurucu mutator E. coli K-12 BW25113 ΔmutT mutasyon oranlarının işaretleyici olarak nalidixic asit kullanılarak tahmin edildiği yer. Yabani tipte (yani normal) mutasyon oranına sahip mutasyon olmayan bakteriyel suşlarla çalışırken, rifampisin daha iyi bir seçimdir (Bkz. Şekil 2A). Eğer nedense daha fazla gözlemlenen mutantlara ihtiyaç duyulsa, ilgili bir belirteç sikloserine karşı dirençtir. Bu belirteç için, direnç mutasyonları ondan fazla genortaya çıkabilir⁴¹, yani hedef boyutu bile rifampisin için daha büyüktür. Maya ve arke incelerken sırasıyla 25S ribozomal proteinler ve URA3 mutasyon oranlarının tahmin edilebilmektedir, higromisin B ve 5-floro-orotik asit (5-FOA) direnci ni ğeşler.

İkinci kritik husus ise paralel kültürlerin hacmidir. Hangi hacmin kullanılacağı gözlenen mutantların gerçek sayısına bağlıdır. Gözlenen mutantların beklenen sayısı seçilen henotibik belirteç için hedef boyutundan, suşların mutasyonları onarma ve önleme kapasitesinden (ortalama mutasyon oranı) ve hem kullanılan ortam hem de kültür hacminden etkilenen çevrenin taşıma kapasitesinden etkilenir. Eğer rifampisin dirençli mutant koloniler içermis bir paralel kültür yoksa sikloserin kullanılmalı veya kaplamalı hücre sayısı artırılmalıdır. Bu, minimal bir ortama daha fazla glikoz ekleyerek veya daha zengin (veya eksiksiz) bir ortamda büyüyen hücrelerle elde edilebilir. Ancak, birçok durumda, nüfus yoğunluğunda böyle bir artış mutasyon hızında bir azalma ile ilişkilidir, sınırlı sonuçlanan, eğer varsa, mutant kolonilerin sayısında artış^{gözlenen 10}. Besinleri artırmak bir çözüm değilse, her paralel kültürün hacmini artırarak hücre sayısını artırmak bir seçenektir. Ortam tek karbon ve enerji kaynağı olarak şekerli minimum tuzları içeriyorsa (yani Şekil 3'teki Q2'ye cevap "minimal orta"), 0,5 ile 1,5 mL arasındaki hacimler kullanılmalıdır. Ortam zenginse, paralel kültürlerin hacimleri 0,35−1 mL arasında olmalıdır. Son soru dirençli kolonilerin medyan sayısı ile ilgilidir. Çok az mutant koloni gözlenirse (yani Şekil 3'teki Q3'e cevap 0 ise) ve çevre değiştirilmemelidir, paralel kültürlerin hacmi artırılmalı veya daha büyük bir hedef boyutuolan antibiyotik (örn. sikloserin) kullanılmalıdır. Öte yandan, tüm seçici plakalarda çok sayıda mutant koloni salgılanırsa (plaka başına ~150'den fazla, şekil 3'ebakınız), kaplamalı hücre sayısı azaltılmalıdır, bu da genellikle daha düşük hacimli bir hacim kullanmak veya daha küçük bir hedef boyutuolan bir antibiyotiğe geçmek anlamına gelir (örneğin, nalidixic asit).

Hacim seçildikten sonra, bir 96 derin kuyu plakası üzerindeki tüm paralel kültürlerin aynı ses ekibe sahip olması en iyisidir. Bu plaka ağırlığı paralel kültürlerin gerçek hacmidaha kesin belirlenmesini sağlar. Belirli bir genotipin mutasyon oranları farklı ortamlar arasında karşılaştırıldığında, yine tüm ortamlarda paralel kültürlerin aynı hacmi kullanmak en iyisidir. Nalidixic asit yabani tip tahmin için kullanılırsa (yani, normal) mutasyon oranları veya nalidixic asit daha küçük bir hedef boyutu nalidixic asit daha küçük bir hedef boyutu nalidsik iktisat için başka bir fenotipik marker kullanılır, hacim daha da artırılmalıdır. Bir seçenek, 15 mL'ye kadar hacimli 50 mL tüplerde paralel kültürler yapmaktır. Örneğin, E. coli K-12 MG1655 mutasyon oranına nalidixic aside tahmin edildiğinde 50 mL tüplerde 10 mL paralel kültür hazırlanmıştır (Bkz. Şekil 2A). Paralel 10 mL kültürler daha sonra seçici TA agar üzerine kaplandı ve standart 90 mm Petri kapları yerine büyük 150 mm plakalara döküldü. 50 mL tüplerde paralel kültürlerin hazırlanmasının dezavantajı, 96 derin kuyu plakasındaki mutasyon oranlarına kıyasla, elde edilen iniş oranının çok daha düşük olmasıdır. Bir çözüm paralel kültürlerin sayısını azaltmaktır. Ancak, bu mutasyonolayların beklenen sayısı ve paralel kültürlerin sayısı na bağlı olarak mtahmini için kesinlik^{etkileyecektir 26}. 14−17 paralel kültüre sahip gözlemlenen mutantların dağılımının elde edilmesi (Şekil 2'deolduğu gibi), katı bir iş ve kabul edilebilir bir hassasiyet seviyesi olan^{%26 ile %20} arasında iyi bir dengedir. %17,5'lik ortanca hassasiyet düzeyi, çok daha büyük bir veri kümesi^10'danhesaplanan %16,4 (%5,7−%−38,9%, n = 580) ara sıra aralığıyla ortanca hassasiyete benzer. Bu nedenle 96 derin kuyu plakası veya 50 mL tüpte paralel kültürler hazırlanırken gözlemlenen mutantların dağılımının en az 14 paralel kültürle elde edilmesi tavsiye edilir. Farklı ortamlarda mutasyon oranları tahmin edildiğinde, bir plaka üzerindeki 96 paralel kültürün aynı ortamda yetiştiği çok plakalı bir deney yaparak hassas seviyelerin test edilebilmektedir. Buna ek olarak, paralel kültürler hazırlarken, inocula'nın düşük sayıda hücre içermesi önemlidir, çünkü inokülde herhangi bir dirençli hücrenin bulunma olasılığını azaltır. Önceden var olan dirençli mutantlar inokülde istenmezler, çünkü sayıca artacak ve seçici plakalar üzerinde bir çim oluşturacak ve mutasyon oranının tahmini mümkün olmayacaktır. Örneğin, mutasyon olmayan E. coli popülasyonlarının çoğunda rifampisin direncine mutasyon oranı ~10^-8sıradadır. Bu nedenle, önceden var olan dirençli bir mutant ile kültür aşılama önlemek için, bir az 10^{8 hücreleri} (örneğin, 10³−10⁴ hücreleri) ile aşılamak gerekir. Son kritik adım seçici agar plakaları inkübe önce, seçici agar yüzeyi tamamen kuru olduğundan emin olmaktır. Örneğin, 6 kuyulu plakalar kullanılıyorsa ve paralel bir kültürün ilk hacmi 1 mL ise yayıcılar kullanılamaz. Yüzeylerin sıvısının kuruması için plakalar steril koşullarda açık bırakılmalıdır. Bu süre son derece değişken olabilir, ortam koşullarına ve plakaların durumuna bağlı olarak. Bu süre en aza indirilmelidir, ancak birkaç saate kadar olabilir.

Dalgalanma tsay doğal kısıtlamalar vardır. Sadece genomun küçük bir alt kümesinde mutasyonun henotypik belirteçlerini tahlil ediyor. Bu nedenle, bir oranı tahmin etmek için yeterli sayıda mutasyonu gözlemlemek için yeterli sayıda nesilden geçen büyük popülasyonlar gerektirir. Bu dalgalanma tahlilleri sadece hızlı bir şekilde nesiller çok sayıda geçme yeteneğine sahip organizmalar üzerinde kullanılabilir anlamına gelir, bakteri gibi, fırıncı maya⁴², veya sıvı-kültür memeli hücreleri³⁰. Ayrıca, mutasyonlar belirli bir hücrenin spesifik biyokimyasal durumlarda meydana gelen nadir olaylardır. Dalgalanma tahlillerinin zaman içinde büyük hücre popülasyonlarına bakması, bu koşulların önemli ölçüde farklılık sağlayabileceği anlamına gelir. Bu titreyi kullanarak, belirli bir popülasyonun mutasyon oranlarının gecikme evresinden erken ve geç üstel evreye ve son olarak da sabit bir evreye doğru ilerlemesini incelemek zordur. Popülasyondaki tek hücreler arasındaki mutasyon oranlarının herhangi bir farklılaşması dalgalanma tsayından tamamen gizlidir. Tek hücreli mutasyon dinamiği DNA onarım proteini MutS⁴³ tek molekül izleme veya birikmiş MutL proteinleri⁴⁴sayarlayarak incelenebilir. Yüksek iş itimat sıralamasındaki son gelişmeler, ana-yavru^üçlüs9,45 ve çok nesilli soy ağacı^46'danmutasyon oranlarını doğrudan tahmin etmeyi de mümkün kılmıştır. Bu tür metodolojik gelişmeler, tek bir nesil içinde meydana gelen mutasyonların doğrudan sayma izin vermeye başlıyor. Ancak, bu doğrudan yaklaşım floresan mikroskobu, mikroakışkanlar veya tüm genom dizilemesi gibi pahalı ve son teknolojiye ihtiyaç duyar. Öte yandan, dalgalanma test nispeten ucuz ve sadece standart laboratuvar ekipmanları gereklidir. Daha fazla dalgalanma tahlilleri yapmak da daha doğrudan tek hücreli yaklaşımlar ile test edilebilir yeni hipotezler nesil kolaylaştıracaktır.

Mutasyonların incelenmesinde uzun zamandır devam eden bir ilgi vardır, bu nedenle dalgalanma tözbüyük olasılıkla yaygın olarak kullanılan bir yöntem olmaya devam edecektir. Luria ve Delbrück^5'in son 4 yılda (2015-2018) yayınladığı belgenin atıf sayısı, bu makalenin atıfları için ilk beş arasında yer almaktadır. Ancak, doğru bir dalgalanma tahlil yürütmek için gerekli hassas manuel çalışma büyük miktarda nedeniyle, çoğu çalışma sadece dalgalanma tahlilleri bir avuç yürütmek. Ancak bu, mutasyon oranının çevresel bağımlılıklarını ortaya çıkarmak için yeterli değildir. Bu yazıda açıklandığı gibi, çok kuyu lu plakalar kullanılarak yapılan dalgalanma tahlillerini düzene sokarak, mevcut maksimum verim, burada açıklandığı gibi paralel olarak 11 derin kuyu plakasi (55 dalgalanma tahlilleri) dir. Bir gün paralel olarak iki dizi dalgalanma tahlilleri çalıştırmak, haftada 110 tahlil yapılmasına olanak sağlar. Verilen tamamen manuel protokolden dalgalanma tahlillerinin çeşitli adımlarını otomatikleştirerek, iş elde etme de başka bir adım değişikliği mümkün olabilir. Ayrıca, mutasyon oranının çevresel bağımlılıklarının incelenmesi için nüfus yoğunluğunun da dikkate alınması gerekmektedir. Önceki sonuçlar¹⁰ mutasyon oranını etkileyen bilinen faktörler hesaba katıldığında, popülasyon yoğunluğunun kontrol edilmesinin mutasyon oranı tahminlerindeki değişimi %90'dan fazla azaltabileceğini göstermektedir. Yoğunluğu kontrol etmek için, n_t 'nin (mutasyon oranını tahmin etmek için kullanılır) popülasyon yoğunluğunu belirlemek için kullanılan yöntemden bağımsız olarak belirlenmesini öneririz. Bakterilerde, N_t CFU ve yoğunluk tarafından belirlenebilir, örneğin, bir ATP tabanlı parlaklık tsay¹⁰.

Bir organizmanın ekolojik bağlamının spontan mutasyon oranını nasıl etkilediğini incelerken yüksek iş ve kontrol yoğunluğu da önemlidir. Mutasyon oranı plastisite varlığını bilmek önemlidir, ancak mutasyon oranı plastisite daha geniş bir biyolojik bağlamda dahil edilecekise, bunun nedenleri ve etkileri anlamak karşılanması gereken önemli sorunlardır. Dalgalanma tahlil sonuçları hızla elde edilir, çünkü birçok hipotezleri test etmek için kullanılabilecek büyük bir araçtır, ve tahliller diğer yöntemlere göre ucuzdur. Örneğin, bakteri toplulukları ve mikrobiyomlarda mutasyon oranının çevresel bağımlılıklarını incelemek için aşama belirlenmiştir. Dalgalanma testini kokültürlere uyarlamak, suşların küçük moleküller aracılığıyla birbirlerinin mutasyon oranlarını etkilediği hipotezini test edebilir. Kokültürlerle birlikte binlerce dalgalanma tahlilleri yapmak, suşların hem birbirlerinin mutasyon oranlarını değiştirme yeteneklerinde hem de mutasyon oranlarının başkaları tarafından değiştirilmeye yatkınlıklarında farklılık gösterip değiştirmediğini belirleyebilir. Mutasyon oranı manipülasyonuna yatkınlıkta suşlar arasındaki varyasyon belirli genetik varyasyona atfedilebilir. Bu, evrimin karmaşık topluluklarda nasıl işlediğine ilişkin görüşlerimizi değiştirebilir, en azından antimikrobiyal direncin nasıl ortaya çıktığı gibi geniş öneme sahip örneklerde.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
1,5 mL Mikrosantrifüj tüpleri	Starlab International GmbH	S1615-5550
2,3,5-Trifeniltetrazolyum klorür	Sigma-Aldrich	T8877-10g
6 kuyucuklu plakalar	Greiner Bio-One	REF 657102
90 mm Petri Kapları Üç Bacalı	ThermoFisher Scientific	REF 120189
96 derin kuyu plakası (Masterblock 2 mL)	Greiner Bio-One	REF 780270
Amonyum sülfat	Fisher Chemical	A/6440/53
Bacto Agar	Becton, Dickinson and Company	REF 214010
Bacto maya özü	Becton, Dickinson and Company	REF 212750
Cycloserin	Sigma-Aldrich	1158005-250MG	Sadece alternatif bir fenotipik belirteç test etmek için
D-Glikoz susuz	Fisher Chemical	G/0500/61
50 mL Santrifüj Tüpü	Corning	REF 430828
L-(+)-Arabinoz	Sigma-Aldrich	A3256-500g
Magnezyum sülfat heptahidrat	Fisher Chemical	M/1050/53
Nalidiksik asit	Sigma-Aldrich	N8878-5G	Sadece bir alternatif test etmek için fenotipik belirteç
Potasyum fosfat dibazik trihidrat	Sigma-Aldrich	P5504-500g
Potasyum fosfat monobazik	Sigma-Aldrich	P0662-500g
Rifampisin	EMD Millipore Corp, ABD	557303-1GM
Sodyum klorür	Fisher Chemical	S/3160/60
Spektofotometre	Jenway	6320D
Tiamin hidroklorür	Sigma-Aldrich	T4625-25g
Trisodyum sitrat dihidrat	Sigma-Aldrich	S1804-500g
Tripton	Fisher Chemical	1278-7099