Neoplazi anlayışı için baş ve boyun kanseri hastalarında mutasyona uğramış spesifik genler ile murine modellerinin geliştirilmesi gereklidir. Burada, belirli genomik değişikliklerile murine HNC hücre hatları oluşturmak için adeno-ilişkili bir virüs-Cas9 sistemi kullanarak primer minür dil hücrelerinin in vitro dönüşümü için bir protokol salıyoruz.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Adeno-Associated Virus-Cas9 Sistemi Kullanılarak Genetiği Değiştirilmiş Bir Murine Baş ve Boyun Kanseri Hücre Hattı In Vitro Kurulması
* These authors contributed equally
Bu makalede
Özet
Özet
Primer normal epitel hücrelerinin kullanımı, onkogenlerde ve tümör baskılayıcı genlerde spesifik mutasyonlar getirerek hücresel dönüşüm için gerekli genomik değişiklikleri tekrarlanabilir bir şekilde tetiklemelerini mümkün kılar. farelerde kısa palindromik tekrar (CRISPR) tabanlı genom düzenleme teknolojisi. Bu teknoloji, fare kullanarak insan kanserlerinde meydana gelen genetik değişiklikleri doğru bir şekilde taklit etmemizi sağlar. Genetik olarak murine primer hücreleri dönüştürerek, daha iyi kanser gelişimi, ilerleme, tedavi ve tanı inceleyebilirsiniz. Bu çalışmada, adeno ilişkili virüs (AAV) in vitro kullanarak genom düzenleme sağlamak için Cre-indüklanabilir Cas9 fare dil epitel hücreleri kullanılır. Özellikle, normal dil epitel hücrelerinde KRAS, p53 ve APC değiştirerek, biz bir murine baş ve boyun kanseri üretti (HNC) in vitro hücre hattı, hangi syngeneic farelerde tümörijenik. Burada sunulan yöntem, belirli genomik değişikliklerle HNC hücre hatlarının nasıl üretilebildiğini ayrıntılı olarak açıklar ve sinjenezik farelerde tümör ilerlemesini tahmin etmeye uygunluklarını açıklar. Bu umut verici yöntemin hnc tümör biyolojisi ve tedavisi için bilgilendirici ve yararlı olacağını öngörüyoruz.
Giriş
HNC dünya çapında yaygın bir malignitedir1. HNC neoplazi sinin oluşumunun modelleştirilmesi şu anda bilimsel bir dönüm noktasında2. HNC2,3,4 (örneğin, TP53, PIK3CA, NOTCH1, FAT1 ve RAS) birçok genetik mutasyon tespit edilmiş olsa da, HNC indüklemek için konser de gerekli genomik değişikliklerin belirli kombinasyonları belirsizliğini koruyor.
İnsan HNC hücre hatlarının mevcut kullanımı önemli ölçüde patogenez ve tedavi ile ilişkili mekanizmaları naçıklığa kavuşturmak için yardımcı oldu
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Bu çalışma Negev Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi Ben Gurion Üniversitesi tarafından onaylanmıştır. Hayvan deneyleri IACUC (IL.80-12-2015 ve IL.29-05-2018(E)) tarafından onaylanmıştır. Bu çalışmada kullanılan hayvan testleri, barınma ve çevre koşullarının tüm yönleri Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu'na uygun olarak hazırlanmıştır13.
1. Adeno ile ilişkili virüs üretimi
- 1. Gün: Hücre kültürü
- DMEM'in 15 mL'sinde 14,5 cm plaka başına 4 x 106 HEK293T hücre tohumu. Polietilenmin (PEI) (1 μg/μL) ile transfeksiyon için 10 tabak hazırlayın.
- 2. Gün: PEI....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Normal Cas9 hücrelerini dönüştürmek için AAV sistemini kullanma
Şekil 1 bu çalışmada kullanılan AAV transgen plazmidinin ayrıntılı bir vektör haritasını sunmaktadır. Şekil 2, AAV-Cas9 tabanlı sistemin tasarımını ve çalışmasını özetler. Viral parçacıklar üretmek için HEK293T hücreleri PEI transfeksiyon yöntemi kullanılarak AAV transgen vektörü ve diğer viral ambalaj vektörleri ile transfeced edildi. Transfeksiy.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Çeşitli yöntemler daha önce başarı 25 değişken dereceleri ile kültürbirincil hücreleri dönüştürmek için kullanılmıştır25,26,27,28. Bu yöntemlerin çoğu dönüşüm için fare fibroblast hücreleri kullanın14,17,18,19 veya 4-nitroquinoline-1-oksit (4-NQO)21<.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
M.S. Biyobilim Enstitüsü Danışma Kurulu'nda ve Menarini Ricerche Puma Biyoteknoloji, Daiichi-Sankio, Targimmune, Immunomedics ve Menarini Ricerche'den araştırma fonları aldı. M.S. aynı zamanda Medendi Medical Travel'ın kurucularındandır ve son 2 yıl içinde Menarini Ricerche ve ADC Pharma'dan fahri ödül almıştır. Diğer tüm yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Teşekkürler
Dr. Daniel Gitler'a pAd Delta 5 Helper plazmidini sağladığı için teşekkür ederiz. Bu çalışma İsrail Bilim Vakfı (ISF, 700/16) (ME), Amerika Birleşik Devletleri-İsrail Binational Science Foundation (BSF, 2017323) (ME ve MS), İsrail Kanser Derneği (ICA, 20170024) (ME için), İsrail Kanser Araştırma Vakfı (ICRF, 17-1693-RCDA) (ME) ve Endişe Vakfı (ME) tarafından finanse edilmiştir #7895. Fellowship: ME ve SJ ve MP BGU Kreitman burs alon bursu.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Antikorlar< / güçlü > | |||
| Anti fare HRP | Jackson ImmunoResearch | 115-035-146 | |
| Anti tavşan HRP | Jackson ImmunoResearch | 711-035-152 | |
| Cas9 Fare mAb | Hücre Sinyal Teknolojisi | 14697 | |
| Cre | BioLegend | 900901 | |
| Cy3-AffiniPure Keçi Anti-Fare IgG | Jackson ImmunoResearch | 115-165-062 | |
| Cy-AffiniPure Goat Anti-Tavşan IgG | Jackson ImmunoResearch | 111-165-144 | |
| GFP | Santa Cruz Biyoteknoloji | sc-9996 | |
| Fosfo-p44/42 MAPK (Erk1/2) | Hücre Sinyalizasyon Teknolojisi | 4370 | |
| Tavşan monoklonal anti E kaderin | Hücre Sinyalizasyon Teknolojisi | 3195S | |
| Tavşan monoklonal anti-KRT 14 | Abcam | AB-ab181595 | |
| ve beta; aktin | MP Biyomedikal | 691001 | |
| ve beta; katenin | Hücre Sinyalizasyon Teknolojisi | 9582S | |
| < güçlü > Hücre hatları < / güçlü > | |||
| HEK93T | ATCC | CRL-3216 | |
| Kültür Ortamı, Kimyasalları ve Reaktifleri | |||
| Bradford Reaktifi | Bio-Rad | 30015484 | |
| BSA | Amresco | 0332-TAM-50G | |
| DAPI florürlü | Güney Biyoteknoloji | 0100-20 | |
| DMEM | Biyolojik Sanayi İsrail Beit-Haemek Ltd. | 01-055-1A | |
| ECL (Westar Süpernova ve Westar Nova 2.0) | Cyanagen | XLS3.0100 ve XLS071.0250 | |
| FBS | Biyolojik Endüstriler İsrail Beit-Haemek Ltd. | 04-127-1A | |
| HBSS | Sigma | H6648 | |
| Heparin - Agaroz | Sigma | H6508 | |
| İzolat II Genomik DNA Kiti | Bioline | BIO-52066 | |
| MgCl2 | Panreac AppliChem | 300283 | |
| NaCl | Bio Lab Ltd | 1903059100 | |
| PBS | Biyolojik Endüstriler İsrail Beit-Haemek Ltd. | 02-023-1A | |
| PEI | Polysciences | 23966-1 | |
| Kalem Strep Çözeltisi | Biyolojik Endüstriler İsrail Beit-Haemek Ltd. | 03-031-1B | |
| PFA | Santa Cruz Biyoteknoloji | 30525-89-4 | |
| Fosfataz inhibitör kokteyli | Biotool | B15001A/B | |
| Proteaz inhibitörü kokteyli | MilliporeSigma | P2714-1BTL | |
| Tris tamponu | MERCK Millipore | 648311-1KG | |
| Enzimler | |||
| Benzonaz | Sigma | E1014 | |
| Kollajenaz IV | Thermo Fisher Scientific | 17104019 | |
| DNAse | Thermo Fisher Scientific | 18047019 | |
| Hyaluronidaz | MilliporeSigma | H3506 | |
| Tripsin | Biyolojik Endüstriler İsrail Beit-Haemek Ltd. | 03-050-1B | |
| Cam eşyalar | |||
| Kapak slipleri | Bar Naor | BNCB00130RA1 | |
| Slaytlar | Bar Naor | BN9308C | |
| Fare suşları | |||
| C57BL/6 | Envigo | ||
| B6; 129-Gt(ROSA)26Sortm1(CAG-cas9*,-EGFP)Fezh/J | Jackson labs | 24857 | |
| NOD. CB17-Prkdc-scid/NCr Hsd (Nod.Scid) | Envigo | ||
| Plasmids | |||
| AAV pCM109 EFS Cre sg APC sg Kras sg P53- Kras HDR | MIT | Geniş Enstitüsü Dr Randall J Platt ve Dr. Joseph Rosenbluh'tan nazik hediye MIT ve Harvard Broad Enstitüsü, Cambridge, MA 02142, ABD | |
| AAV 2/9 kapsid vektörü | Addgene | 112865 | |
| pAD Delta F5 yardımcısı | Negev | Dr Daniel Gitler, Sağlık Bilimleri Fakültesi Fizyoloji ve Hücre Biyolojisi Bölümü ve Zlotowski Sinirbilim Merkezi, Negev Ben-Gurion Üniversitesi, Beer-Sheva 84105, İsrail tarafından sağlanmıştır. | |
| < güçlü > Plastik eşyalar< / güçlü > | |||
| Amicon-ULTRA filtre 100 KDa | Millipore | UFC910024 | |
| 0.22 ve mikro; m steril filtreler, 4 mm | Millex | SLGV004SL | |
| 0.45 &mikro; m steril filtreler, 13 mm | Millex | SLHV013SL | |
| Kültür plakaları | Greiner Bio-One | ||
| Falcon tüpleri | Greiner Bio-One |
Kaynaklar
- Reyes-Gibby, C. C., et al. Genome-wide association study identifies genes associated with neuropathy in patients with head and neck cancer. Scientific Reports. 8 (1), 8789(2018).
- Riaz, N., Morris, L. G., Lee, W., Chan, T. A.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
