Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Adeno-Associated Virus-Cas9 Sistemi Kullanılarak Genetiği Değiştirilmiş Bir Murine Baş ve Boyun Kanseri Hücre Hattı In Vitro Kurulması

7.7K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/60410

⸱

9 Ocak 2020

 ,  ,  ,  , 
1The Shraga Segal Department of Microbiology, Immunology and Genetics, Ben-Gurion University of the Negev, 2Faculty of Health Sciences, Ben-Gurion University of the Negev, 3Human Oncology & Pathogenesis Program (HOPP), Memorial Sloan Kettering Cancer Center, 4Institute of Pathology, Barzilai University Medical Center

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Neoplazi anlayışı için baş ve boyun kanseri hastalarında mutasyona uğramış spesifik genler ile murine modellerinin geliştirilmesi gereklidir. Burada, belirli genomik değişikliklerile murine HNC hücre hatları oluşturmak için adeno-ilişkili bir virüs-Cas9 sistemi kullanarak primer minür dil hücrelerinin in vitro dönüşümü için bir protokol salıyoruz.

Özet

Primer normal epitel hücrelerinin kullanımı, onkogenlerde ve tümör baskılayıcı genlerde spesifik mutasyonlar getirerek hücresel dönüşüm için gerekli genomik değişiklikleri tekrarlanabilir bir şekilde tetiklemelerini mümkün kılar. farelerde kısa palindromik tekrar (CRISPR) tabanlı genom düzenleme teknolojisi. Bu teknoloji, fare kullanarak insan kanserlerinde meydana gelen genetik değişiklikleri doğru bir şekilde taklit etmemizi sağlar. Genetik olarak murine primer hücreleri dönüştürerek, daha iyi kanser gelişimi, ilerleme, tedavi ve tanı inceleyebilirsiniz. Bu çalışmada, adeno ilişkili virüs (AAV) in vitro kullanarak genom düzenleme sağlamak için Cre-indüklanabilir Cas9 fare dil epitel hücreleri kullanılır. Özellikle, normal dil epitel hücrelerinde KRAS, p53 ve APC değiştirerek, biz bir murine baş ve boyun kanseri üretti (HNC) in vitro hücre hattı, hangi syngeneic farelerde tümörijenik. Burada sunulan yöntem, belirli genomik değişikliklerle HNC hücre hatlarının nasıl üretilebildiğini ayrıntılı olarak açıklar ve sinjenezik farelerde tümör ilerlemesini tahmin etmeye uygunluklarını açıklar. Bu umut verici yöntemin hnc tümör biyolojisi ve tedavisi için bilgilendirici ve yararlı olacağını öngörüyoruz.

Giriş

HNC dünya çapında yaygın bir malignitedir1. HNC neoplazi sinin oluşumunun modelleştirilmesi şu anda bilimsel bir dönüm noktasında2. HNC2,3,4 (örneğin, TP53, PIK3CA, NOTCH1, FAT1 ve RAS) birçok genetik mutasyon tespit edilmiş olsa da, HNC indüklemek için konser de gerekli genomik değişikliklerin belirli kombinasyonları belirsizliğini koruyor.

İnsan HNC hücre hatlarının mevcut kullanımı önemli ölçüde patogenez ve tedavi ile ilişkili mekanizmaları naçıklığa kavuşturmak için yardımcı oldu3. Ancak, immün azat lı murine sistemlerinde insan hücre hatlarının incelenmesinin sınırlamaları vardır, çünkü bu sistemler in vivo neoplastik prosese, spesifik gen mutasyonlarının rolüne ve immün mikroortamdaki tedavi yanıtlarına hitap etmez. Bu nedenle, farklı genlerin dönüşüm sürecine nasıl katkıda bulundugunu incelemek ve immünyonlu farelerde yeni molekül temelli tedavileri test etmek için spesifik genetik degistirimlere sahip murin hücre hatlarınin geliþimi ve kurulmasý birincil öneme sahiptir.

Biyomedikal araştırmalarda gen fonksiyon çalışmaları, örneğin5,çift iplikçikli sonları (DSBs) tanıtarak, DNA düzenleme teknolojilerinde gelişmelerden önemli ölçüde etkilenmiştir. Çinko parmak nükleazlarının kullanımı, transkripsiyon aktivatör benzeri efektör nükleazlar ve kümelenmiş düzenleyici aralıklı kısa palindromik tekrarlar (CRISPR/Cas9) dahil olmak üzere bu teknolojiler, çekirgesinde ilgi çeken herhangi bir genin manipülasyonuna olanak sağlar. En son CRISPR/Cas9 sistemleri, Cas9 nükleazını genomdaki belirli bir bölgede DSB oluşturmak üzere yönlendiren bir kılavuz RNA'dan (gRNA) oluşur. Bu sistem, en geleneksel olarak tedavi edilmesi en zor organizmalar5'te bile, herhangi bir hücre veya hedef dokudaki endojengenlerindeğiştirilmesinde geniş bir tanıma kazanmıştır. Sadeliği, hızı ve verimliliği sayesinde diğer sistemlere göre birden fazla avantajı vardır.

Onkolojide CRISPR/CAS9 teknolojisi kanser hücrelerini etkin bir şekilde taklit etme ihtiyacını karşılamıştır. HNC bu sistemi kurmak için, biz güçlü KRAS onkogen ve iki önemli tümör baskılayıcı genler, APC ve p536manipüle. GENIE veritabanı7göre, Bu kombinasyon HNC nadirdir. RAS mutasyonları (HRAS, NRAS ve KRAS) tüm HNC popülasyonlarının sadece ~%7'sinde mevcuttur. Bu tümörler tedaviye dirençli olma eğilimindedir8,9.

Cas9 ve gRNA'sının teslimi, aav veya lentivirüsler kullanılarak viral transdüksiyon yoluyla sağlanır. Rekombinant AAV genellikle yüksek titreşme, hafif bağışıklık yanıtı, geniş bir hücre yelpazesi nekadar bilgi verme yeteneği ve genel güvenlik sayesinde genleri hedef hücrelere ulaştırmak için tercih edilen bir yöntemdir. Bir AAV sistemi kullanılarak, çeşitli dokuya özgü fare hücre hatları oluşturuldu ve yeni hücre hatları halageliştiriliyor 10,11,12. Ancak, murine HNC hücre hattı modelleri hücreleri üretebilir verimli bir genomik düzenleme sistemi geliştirilmeye devam etmektedir. Bu çalışmada, primer minyon dil hücrelerini tümörijenik duruma dönüştürmek için in vitro AAV-Cas9 tabanlı bir sistem geliştirmeye çalıştık. Bu eşsiz CRISPR/Cas9 dönüşüm protokolü ve kurulan tümör hücre hattı, genomik değişikliklerin çeşitliliğiile indüklenen HNC'nin biyolojisini daha iyi anlamak için kullanılabilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Bu çalışma Negev Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi Ben Gurion Üniversitesi tarafından onaylanmıştır. Hayvan deneyleri IACUC (IL.80-12-2015 ve IL.29-05-2018(E)) tarafından onaylanmıştır. Bu çalışmada kullanılan hayvan testleri, barınma ve çevre koşullarının tüm yönleri Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu'na uygun olarak hazırlanmıştır13.

1. Adeno ile ilişkili virüs üretimi

  1. 1. Gün: Hücre kültürü
    1. DMEM'in 15 mL'sinde 14,5 cm plaka başına 4 x 106 HEK293T hücre tohumu. Polietilenmin (PEI) (1 μg/μL) ile transfeksiyon için 10 tabak hazırlayın.
  2. 2. Gün: PEI kullanarak HEK293T hücrelerinin transfeksiyonu
    1. Transfeksiyondan önce ortamı çıkarın ve sıcak DMEM 1 saat ile yeniden besleyin.
    2. Prewarm transfeksiyon reaktifleri ve DMEM.
    3. AAV ITR (AAV pCM109 EFS Cre sg APC sg KRAS sg P53- KRAS HDR), 10 g AAV 2/9n capsid plazmid içeren ilgi plazmid 10 g kullanın (AAV2 rep geni ve AAV9 kapak geni ile, ve plaka başına yardımcı plazmid (pAdDelta F5 yardımcı) 10 μg (Bkz. Malzeme Tablosu).
      NOT: Yardımcı plazmid yeni nesil - pAdDeltaF614,15,16 da AAV üretimi için kullanılabilir.
    4. Plazmidleri tabak başına 1 mL düz DMEM ile karıştırın. Daha sonra plazmid karışımına ve girdabına 90 μL polietilenin (toplam plazmid: PEI konsantrasyonu = 1:3) ekleyin.
    5. PEI-plazmid DNA karışımını oda sıcaklığında 20 dakika (RT) kuluçkaya yatırın.
    6. Karışımı HEK293T hücrelerinin üzerine damla şeklinde ekleyin ve plakaları 37 °C'de hücre kültürü kuluçka makinesine 24 saat için %5 CO2 ile aktarın.
  3. 3. Gün: Transfeksiyon sonrası orta değişim
    1. Ortamı tamamen çıkarın ve 15 mL taze DMEM ekleyin.
  4. Gün 5: Virüs Hasat
    1. Kuru buz/etanol banyosu hazırlayın.
    2. Hücreleri bir hücre kazıyıcı ile toplayın ve 50 mL tüpler (50 mL tüp başına 2 plaka) içine aktarın.
    3. Oda sıcaklığında 15 dakika boyunca 800 x g'de dönme tüpleri.
    4. Tüm tüplerden supernatant atın. Sadece ilk tüpe 0,5 mL lysis tamponu (150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH = 8,5) plaka başına (yani 10 plaka için 5 mL) ekleyin. Hücreleri yeniden askıya alın ve toplam hacmi bir sonraki tüpe aktarın ve son tüpe kadar devam edin.
    5. Hücre süspansiyonuna yeni bir 50 mL tüp aktarın. 1.4.4 adımda açıklandığı gibi aynı aktarım yöntemini kullanarak tüpleri aynı lysis tamponu hacmiyle (plaka başına 0,5 mL) yıkayın.
    6. Hücre süspansiyonuna kuru buz/etanol banyosu ile 37 °C su banyosu arasında ~10 dk dondurma/çözülme döngüleri üç tur akıtın. Her çözülmeden kısa bir süre sonra girdap.
    7. Arınma aynı gün yapılırsa, rt'de denge ve elüsasyon arabelleği (tarif için Tablo 1'e bakınız) ayarlayın.
    8. Plaka başına 50 adet benzonaz ekleyin ve 37 °C'de 1,5 saat kuluçkaya yatırın.
      NOT: Benzonaz, konak üretici hücrelerinden kalan nükleik asitleri ve hücre süspansiyonunda bulunan plazmid DNA'sını sindirmek için kullanılır.
    9. Tüpleri 3.000 x g'de 15 dakika 4 °C'de döndürün.
    10. Supernatant'ı 18 G çelik iğne kullanarak şırıngada toplayın ve çözeltiyi 0,45 m'lik bir filtreden 15 mL'lik bir tüpe geçirerek kaba bir şekilde elde edin.
    11. Ham lysate'yi arınmaya veya arınmaya devam edene kadar birkaç hafta 4 °C'de saklayın.

2. AAV arıtma

  1. 5. gün veya sonrası
    1. Rt'ye denge ve elüsasyon arabelleği yerleştirin.
    2. Kromatografi kolonlarını 10 mL lik denge tamponu ile yıkayın.
    3. Sütun17'ye heparin-agarose plakası başına 0,5 mL ekleyin ve sonra denge tamponu ekleyin (heparin-agarose'un hacmi 4 kat). Kolon ters çevirerek çözeltileri karıştırın ve agarose tortu sağlar.
    4. Yerçekimi tarafından sütundan denge tampon elute.
      NOT: Agarose'un kurumasını önlemek için bazı denge tamponu bırakın.
    5. Ham lysate'yi kolona yükleyin ve 4 °C'de 2 saat boyunca sürekli ajitasyon la kuluçkaya yatırın. Dik bir konuma sütun getirin ve çökelti agarose sağlar.
    6. Yerçekimi ile ham lysate elute.
    7. Kolon denge tamponu (heparin-agarose hacmi 4x) ile yıkayın.
    8. Sütunun altına 100 kDa santrifüj protein filtresi yerleştirin ve bir elüsyon tamponu (heparin-agarose hacmi3 kat) kullanarak virüsü filtreye aşındırın.
      NOT: Elüsyon arabelleği 15 mL'yi geçmemelidir.
    9. Filtrede 1 mL'den az kalana kadar filtreyi ~30 dk için 3.000 x g'de santrifüj edin.
    10. Filtrede 1 mL'den az kalana kadar filtreyi ~30 dk için 3.000 x g'de PBS ve santrifüj ile doldurun. Tüm tuzları kaldırmak için bu adımı 2x tekrarlayın.
    11. Virüs çözeltisini 3.000 x g'de santrifüj ile filtreye yoğunlaştırarak mümkün olduğunca küçük bir hacme (200°L'den az) ulaşın.
    12. Bir iğne ve şırınga ile virüs çözeltisi aspirate ve bir tüp içine 0,22 μm filtre ile çözüm itin.
    13. Depolama için konsantre viral parçacıkların aliquots olun.
      NOT: Aliquots 4 °C'de kısa süreli depolama için ~20 μL ve -80 °C'de uzun süreli depolama için ~5 μL olmalıdır.
    14. Daha önce açıklandığı gibi viral titre ve viral transdüksiyon verimliliğini belirlemek14,18,19,20.

3. Birincil hücrelerin izolasyonu ve kültürü

  1. 1. Gün
    1. 6 haftalık erkek veya kadın B6;129-Gt(ROSA)26Sortm1(CAG-cas9*,-EGFP)Fezh/J co2 boğulma veya başka bir IACUC onaylı protokol ile ötenazi.
      NOT: Bu CRISPR/Cas9 knockin fareler, cag organizatörü tarafından yönetilen cas9 enonukleaz ve EGFP'nin Cre rekombinaza bağımlı ifadesine sahiptir. Bu farelerin genomunda bulunan yukarı Lox-Stop-Lox (LSL) dizisi Cre rekombinaz yokluğunda Cas9 ve EGFP ekspresyonunu engeller. Tek kılavuz RNA (sgRNA) ve Cre kaynağı ile birlikte kullanıldığında, onlar vivo veya ex vivo14tek veya birden fazla fare genlerinin düzenlenmesine izin verir.
    2. Cerrahi makas kullanarak ötenazi liyatatan dili ayırın.
    3. Neşter kullanarak dil dokusunu çok küçük parçalara ayırarak dokuyu elle ayırın. Doku parçalarını 4.5ml RPMI düz orta (dışarı serum ile) içeren 15 mL tüp içinde toplayın.
    4. Doku parçalarına üçlü enzim karışımını (200 μl) (tarif için Tablo 1'e bakın) ekleyin.
    5. Doku-enzim karışımını 37 °C'de 30 dakika kuluçkaya yatırın ve dokunun ve dokunun ve dokunun.
    6. Enzim intiamını durdurmak için doku-enzim karışımına HBSS/PBS içeren %5 fetal sığır serumu (FBS) ekleyin.
    7. Dağılmış hücreleri ve daha büyük doku parçalarını ayırmak için yukarıdaki hücre süspansiyonuna steril 70 μm naylon örgü ile filtre uygulayın.
    8. Filtrelenmiş hücre süspansiyonunu 300 x g için 5 dk'lık HBSS/PBS'de RT'de santrifüj ile yıkayın.
    9. Kültür ortamındaki peleti yeniden askıya alın (RPMI/DMEM'de %10 FBS) ve farklı hücre kolonileri oluşana kadar 60 mm kültür yemeklerinde büyür.
      1. Hücre kolonileri oluşana kadar 3 mL tam ortam (%10 FBS) içeren 60 mm'lik bir kültür kabında filtrenin üstünde tutulan kültür hücresi agregaları.
    10. 1 haftalık kültürden sonra fibroblast kontaminasyonu için birincil hücreleri mikroskopik olarak inceleyin. Fibroblastları gidermek için 37 °C'de 37 °C'de %0,25 tripsin %0,02 EDTA çözeltisi ile agregalardan ve hücre süspansiyonlarından geliştirilen birincil hücreleri tedavi edin.
      NOT: Genellikle hücre agregalarından elde edilen birincil kültür, tek hücreli süspansiyonlara göre daha fazla koloni üretir. Bu kolonilerden hücreler AAV transdüksiyonu ile daha iyi transdüksiyon verimi sağlar.

4. Primer hücrelerin AAV transdüksiyonu

  1. 10. Gün
    1. Tohum 2 x 105 ana hücreleri tam medya 2 mL 6 kuyu plakaları iyi başına (RPMI/ DMEM% 10 FBS).
    2. Ertesi gün, 1012 viral genom/mL (1010 transducing birimleri/mL) ile hücreleri aktarın ve 37 °C'de 48 saat viral parçacık içeren ortamdaki hücreleri kuluçkaya yatırın.
    3. Viral parçacık içeren ortamı çıkarın ve AAV'den geçirilen hücreleri tam ortamla besleyin.
      NOT: Sadece transdüksiyon geçirmiş hücreler GFP ifade eder ve çoğalmaya başlar. Transdüksiyon geçirmeyen hücreler 2 hafta içinde ölür.
    4. Kültür genişleme 2 hafta sonra, doğrulama ve in vivo tümörijenik deneyler için hücreleri tohum.
      NOT: Standart protokoller kullanılarak spesifik genom düzenlemenin doğrulanması için AAV transdükse hücrelerinden ve Cas9 farelerinden normal primer hücrelerden genomik DNA çıkarıldı. Çıkarılan DNA'nın dizilendirilmesi ve sıralı verilerin analizi(Tablo 2)daha önce açıklandığı gibi bir hibridizasyon yakalama tabanlı yeni nesil sıralama testi (örneğin, MSK-IMPACT platformu) kullanılarak yapılmıştır21.

5. İmmünfluoresans ve batı lekeleme kullanarak normal hücrelerin tümörijenik hücrelere dönüşümünün doğrulanması

  1. İmmünofloresans
    1. 12 mm cam kapaklı 2 x 105 hücre yiyerek bir gece kuvöze yerleştirin.
    2. PBS'de %4 paraformaldehitteki hücreleri düzeltin (pH = 7.4) ve immünoresans etiketleme işlemi.
    3. Sabit hücreleri % 1 BSA'da ilk primer antikorveya PBST'de %1 serum içeren sabit hücreleri, RT'de 1 saat nemli bir odada veya 4 °C'de bir gecede kuluçkaya yatırın. Kullanılan birincil antikorlar tavşan monoklonal anti-KRT 14, tavşan monoklonal anti-E-kadherin antikor ve Cas9 fare mAb'dir.
    4. Hücreleri 1x PBS ile 5 dk boyunca 3x yıkayarak kapaklardan birincil antikor çözeltisini çıkarın.
    5. Cy3 eşek anti-tavşan IgG ve / veya Cy3 keçi anti-fare IgG ikincil antikorlar ile hücreleri kuluçka 5% BSA PBST için 1 saat rt karanlıkta.
    6. İkincil antikor solüsyonu kapaklardan çıkarın ve 5.1.4 adımda açıklandığı gibi hücreleri 3kat yıkayın.
    7. DaPI (DAPI Fluoromount) içeren montaj ortamı bir damla ile kapakları monte.
    8. Slaytlar floresan mikroskobu kullanılarak görüntülene kadar 4 °C'de karanlıkta saklayın.
  2. Batı lekeleme
    1. Tohum 1 x 106 dönüştürülmüş hücreleri 100 mm kültür çanağı içinde ve bir gece kuvözde yerleştirin.
    2. Dönüştürülmüş hücreleri 200 μl buz gibi PBS'ye yıkayın ve kazıyın.
    3. Hücreleri peletlemek için 4 °C'de 2.000 x g'de 10 dk hücre süspansiyonu içeren tüpü santrifüj edin.
    4. Fosfataz inhibitörü kokteylleri ve 4 °C'de 10 dakika proteaz inhibitörü içeren lysis tamponu (bkz. Tablo 1)kullanarak hücreleri aspire edin ve hücreleri lyse. 10.000 x g ve 4 °C'de 10 dk için lysate santrifüj ve temizlenmiş lysates toplamak.
    5. Üreticinin protokolünü izleyerek protein konsantrasyonu belirlemek için ticari olarak kullanılabilir bir Bradford test kiti kullanın. Protein örneklerini 0,5 veya 1 μg/μL'ye ayarlamak için 4x numune tamponu (500 mM Tris pH = 6.8 = %40 gliserol, %8 SDS, %20 H2O, %0.02 bromofenol mavisi) kullanın.
      NOT: Numuneler -80 °C'de veya Batı leke analizi yapılana kadar saklanabilir.
    6. %10 sodyum dodecyl sülfat-poliakrilamid jel elektroforez (SDS-PAGE) ile eşit miktarda toplam lizat (30 μg) ayrı ayrı dır. Boyanın jelin dibine ulaştığından emin olun. Proteini 30 dk boyunca 25 V'de yarı kuru lekelerle naylon membrana aktarın.
    7. Tris-tamponlu salin (TBS)-0.1% Tween (TBST) tamamen kapsayacak şekilde membran üzerine% 5 BSA dökün. Membranı 1 saat boyunca tökezleyin. Mebrane'yi bir gecede primer antikorlarla (anti-Cre, anti-Cas9, anti-GFP, anti-β catenin, anti p53, anti-fosfo-ERK ve anti-β aktin %5 BSA TBST'de seyreltilmiş) inkütam.
    8. Kuluçkadan sonra membranları 10 dakika boyunca 1x TBST ile yıkayın ve çözeltinin membranı tamamen kapladığından emin olun. Bu yıkama 3x gerçekleştirin ve sonra membrana horseradish peroksidaz (HRP)-konjuge ikincil antikor (seyreltilmiş 1:10.000% 5 BSA TBST) ekleyin. RT'de 1 saat kuluçka.
    9. Kuluçkadan sonra membranları 10 dakika boyunca 1x TBST ile yıkayın ve çözeltinin membranı tamamen kapladığından emin olun. Bantları ortaya çıkarmak için chemiluminescence görüntüleme (bkz. Malzemeler Tablosu)gerçekleştirin ve buna göre görüntüleri yakalayın.
  3. İmmünyetersiz farelerde dönüştürülmüş hücrelerin tümörijenik potansiyelinin doğrulanması
    NOT: Fareler Negev Ben-Gurion Üniversitesi'nin kurumsal yönergelerine göre bakım ve tedavi edildi. Nod. CB17-Prkdc-scid/NCr Hsd (NOD. In vivo çalışmalarda SCID) ve C57BL/6 fareler kullanıldı. Fareler 12 saatlik ışık/karanlık döngüsü ile hava filtreli laminar akış dolaplarında yer aldı ve yiyecek ve su reklamı libitum ile beslendi.
    1. 6-8 haftalık kadın NOD kullanın. CB17-Prkdc-scid/NCr Hsd (NOD. Çalışma için SCID) ve C57BL/6 fareler.
    2. AAV-Cas9 dönüştürülmüş hücreleri trypsize. 37 °C'de önceden ısınmış DMEM kullanarak tripsinizasyonu durdurun ve 50 mL'lik bir tüpte toplayın.
    3. Tüpü 800 x g'de 10 dk oda sıcaklığında santrifüj edin. Supernatant atın ve FBS olmadan DMEM ortamda hücre pelet resuspend. Santrifüjü tekrar gerçekleştirin ve hücre peletini 1x PBS'de yeniden askıya alın.
      NOT: Hücreleri 1x PBS'de çok uzun süre tutmayın. Hücre kümelenmesini önlemek için hücre süspansiyonuna her zaman buz üzerinde tutun.
    4. Hücreleri saymak ve hücreleri istenilen konsantrasyona (2,5 x 107 hücre/mL) 1x PBS kullanarak seyreltmek için otomatik bir hücre sayacı kullanın. Her NOD sağ kanadında AAV-Cas9 dönüştürülmüş hücre süspansiyon bir deri altı enjeksiyon uğrama ile tümörler oluşturmak. CB17-Prkdc-scid/NCr Hsd (NOD. SCID) fare (2 x 106 hücre/fare). Syngeneic farelerde bir ortotropik model oluşturmak için, enjekte 0.5 × 106 birincil hücreler veya AAV-Cas9 C57BL / 6 immünobeceriksiz farelerin dil içine hücreleri dönüştürülmüş.
    5. Co2 boğulma ile enjeksiyondan sonra hayvanları ötenazi yapın ve immünohistokimya analizi için ötenazi yapılan farelerdeki tümörleri inceleyin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Normal Cas9 hücrelerini dönüştürmek için AAV sistemini kullanma
Şekil 1 bu çalışmada kullanılan AAV transgen plazmidinin ayrıntılı bir vektör haritasını sunmaktadır. Şekil 2, AAV-Cas9 tabanlı sistemin tasarımını ve çalışmasını özetler. Viral parçacıklar üretmek için HEK293T hücreleri PEI transfeksiyon yöntemi kullanılarak AAV transgen vektörü ve diğer viral ambalaj vektörleri ile transfeced edildi. Transfeksiy...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Çeşitli yöntemler daha önce başarı 25 değişken dereceleri ile kültürbirincil hücreleri dönüştürmek için kullanılmıştır25,26,27,28. Bu yöntemlerin çoğu dönüşüm için fare fibroblast hücreleri kullanın14,17,18,19 veya 4-nitroquinoline-1-oksit (4-NQO)21<...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

M.S. Biyobilim Enstitüsü Danışma Kurulu'nda ve Menarini Ricerche Puma Biyoteknoloji, Daiichi-Sankio, Targimmune, Immunomedics ve Menarini Ricerche'den araştırma fonları aldı. M.S. aynı zamanda Medendi Medical Travel'ın kurucularındandır ve son 2 yıl içinde Menarini Ricerche ve ADC Pharma'dan fahri ödül almıştır. Diğer tüm yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Teşekkürler

Dr. Daniel Gitler'a pAd Delta 5 Helper plazmidini sağladığı için teşekkür ederiz. Bu çalışma İsrail Bilim Vakfı (ISF, 700/16) (ME), Amerika Birleşik Devletleri-İsrail Binational Science Foundation (BSF, 2017323) (ME ve MS), İsrail Kanser Derneği (ICA, 20170024) (ME için), İsrail Kanser Araştırma Vakfı (ICRF, 17-1693-RCDA) (ME) ve Endişe Vakfı (ME) tarafından finanse edilmiştir #7895. Fellowship: ME ve SJ ve MP BGU Kreitman burs alon bursu.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Antikorlar< / güçlü >
Anti fare HRPJackson ImmunoResearch115-035-146
Anti tavşan HRPJackson ImmunoResearch711-035-152
Cas9 Fare mAbHücre Sinyal Teknolojisi14697
CreBioLegend900901
Cy3-AffiniPure Keçi Anti-Fare IgGJackson ImmunoResearch115-165-062
Cy-AffiniPure Goat Anti-Tavşan IgGJackson ImmunoResearch111-165-144
GFPSanta Cruz Biyoteknolojisc-9996
Fosfo-p44/42 MAPK (Erk1/2)Hücre Sinyalizasyon Teknolojisi4370
Tavşan monoklonal anti E kaderinHücre Sinyalizasyon Teknolojisi3195S
Tavşan monoklonal anti-KRT 14AbcamAB-ab181595
ve beta; aktinMP Biyomedikal691001
ve beta; kateninHücre Sinyalizasyon Teknolojisi9582S
< güçlü > Hücre hatları < / güçlü >
HEK93TATCCCRL-3216
Kültür Ortamı, Kimyasalları ve Reaktifleri
Bradford ReaktifiBio-Rad30015484
BSAAmresco0332-TAM-50G
DAPI florürlüGüney Biyoteknoloji0100-20
DMEMBiyolojik Sanayi İsrail Beit-Haemek Ltd.01-055-1A
ECL (Westar Süpernova ve Westar Nova 2.0)CyanagenXLS3.0100 ve XLS071.0250
FBSBiyolojik Endüstriler İsrail Beit-Haemek Ltd.04-127-1A
HBSSSigmaH6648
Heparin - AgarozSigmaH6508
İzolat II Genomik DNA KitiBiolineBIO-52066
MgCl2Panreac AppliChem300283
NaClBio Lab Ltd1903059100
PBSBiyolojik Endüstriler İsrail Beit-Haemek Ltd.02-023-1A
PEIPolysciences23966-1
Kalem Strep ÇözeltisiBiyolojik Endüstriler İsrail Beit-Haemek Ltd.03-031-1B
PFASanta Cruz Biyoteknoloji30525-89-4
Fosfataz inhibitör kokteyliBiotoolB15001A/B
Proteaz inhibitörü kokteyliMilliporeSigmaP2714-1BTL
Tris tamponuMERCK Millipore648311-1KG
Enzimler
BenzonazSigmaE1014
Kollajenaz IVThermo Fisher Scientific17104019
DNAseThermo Fisher Scientific18047019
HyaluronidazMilliporeSigmaH3506
TripsinBiyolojik Endüstriler İsrail Beit-Haemek Ltd.03-050-1B
Cam eşyalar
Kapak slipleriBar NaorBNCB00130RA1
SlaytlarBar NaorBN9308C
Fare suşları
C57BL/6Envigo
B6; 129-Gt(ROSA)26Sortm1(CAG-cas9*,-EGFP)Fezh/JJackson labs24857
NOD. CB17-Prkdc-scid/NCr Hsd (Nod.Scid)Envigo
Plasmids
AAV pCM109 EFS Cre sg APC sg Kras sg P53- Kras HDRMITGeniş Enstitüsü Dr Randall J Platt ve Dr. Joseph Rosenbluh'tan nazik hediye MIT ve Harvard Broad Enstitüsü, Cambridge, MA 02142, ABD
AAV 2/9 kapsid vektörüAddgene112865
pAD Delta F5 yardımcısıNegevDr Daniel Gitler, Sağlık Bilimleri Fakültesi Fizyoloji ve Hücre Biyolojisi Bölümü ve Zlotowski Sinirbilim Merkezi, Negev Ben-Gurion Üniversitesi, Beer-Sheva 84105, İsrail tarafından sağlanmıştır.
< güçlü > Plastik eşyalar< / güçlü >
Amicon-ULTRA filtre 100 KDaMilliporeUFC910024
0.22 ve mikro; m steril filtreler, 4 mmMillexSLGV004SL
0.45 &mikro; m steril filtreler, 13 mmMillexSLHV013SL
Kültür plakalarıGreiner Bio-One
Falcon tüpleriGreiner Bio-One
Ben Gurion Üniversitesi

Kaynaklar

  1. Reyes-Gibby, C. C., et al. Genome-wide association study identifies genes associated with neuropathy in patients with head and neck cancer. Scientific Reports. 8 (1), 8789(2018).
  2. Riaz, N., Morris, L. G., Lee, W., Chan, T. A. Unraveling the molecular genetics of head and neck cancer through genome-wide approaches. Genes & Diseases. 1 (1), 75(2014).
  3. Leemans, C. R., Snijders, P. J. F., Brakenhoff, R. H. The molecular landscape of head and neck cancer. Nature Reviews Cancer. 18 (5), 269-282 (2018).
  4. Jiang, X., Ye, J., Dong, Z., Hu, S., Xiao, M. Novel genetic alterations and their impact on target therapy response in head and neck squamous cell carcinoma. Cancer Management and Research. 11, 1321-1336 (2019).
  5. Im, W., Moon, J., Kim, M. Applications of CRISPR/Cas9 for Gene Editing in Hereditary Movement Disorders. Journal of Movement Disorders. 9 (3), 136-143 (2016).
  6. Li, H., et al. Genomic analysis of head and neck squamous cell carcinoma cell lines and human tumors: a rational approach to preclinical model selection. Molecular Cancer Research: MCR. 12 (4), 571-582 (2014).
  7. AACR Project GENIE Consortium, T.A.P.G.. AACR Project GENIE: Powering Precision Medicine through an International Consortium. Cancer Discovery. 7 (8), 818-831 (2017).
  8. Suh, Y., Amelio, I., Guerrero Urbano, T., Tavassoli, M. Clinical update on cancer: molecular oncology of head and neck cancer. Cell Death & Disease. 5 (1), e1018(2014).
  9. Anderson, J. A., Irish, J. C., Ngan, B. Y. Prevalence of RAS oncogene mutation in head and neck carcinomas. The Journal of Otolaryngology. 21 (5), http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/1361585 321-326 (1992).
  10. Ryals, R. C., Boye, S. L., Dinculescu, A., Hauswirth, W. W., Boye, S. E. Quantifying transduction efficiencies of unmodified and tyrosine capsid mutant AAV vectors in vitro using two ocular cell lines. Molecular Vision. 17, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21552473 1090-1102 (2011).
  11. Smith-Arica, J. R., et al. Infection Efficiency of Human and Mouse Embryonic Stem Cells Using Adenoviral and Adeno-Associated Viral Vectors. Cloning and Stem Cells. 5 (1), 51-62 (2003).
  12. Li, J., Xiao, X., Kenniston, T., Kudlow, J., Giannoukakis, N. AAV Vectors. Molecular Therapy. 3 (5), S174-S192 (2001).
  13. Institute of Laboratory Animal Resources (U.S.). Guide for the care and use of laboratory animals. , National Academy Press. (1996).
  14. Platt, R. J., et al. CRISPR-Cas9 knockin mice for genome editing and cancer modeling. Cell. 159 (2), 440-455 (2014).
  15. Zhang, Y., Chirmule, N., Gao, G. P., Wilson, J. CD40 ligand-dependent activation of cytotoxic T lymphocytes by adeno-associated virus vectors in vivo: role of immature dendritic cells. Journal of Virology. 74 (17), 8003-8010 (2000).
  16. Xiao, X., Li, J., Samulski, R. J. Production of high-titer recombinant adeno-associated virus vectors in the absence of helper adenovirus. Journal of Virology. 72 (3), 2224-2232 (1998).
  17. Auricchio, A., Hildinger, M., O'Connor, E., Gao, G. P., Wilson, J. M. Isolation of Highly Infectious and Pure Adeno-Associated Virus Type 2 Vectors with a Single-Step Gravity-Flow Column. Human Gene Therapy. 12 (1), 71-76 (2001).
  18. Lock, M., et al. Characterization of a Recombinant Adeno-Associated Virus Type 2 Reference Standard Material. Human Gene Therapy. 21 (10), 1273(2010).
  19. Challis, R. C., et al. Systemic AAV vectors for widespread and targeted gene delivery in rodents. Nature Protocols. 14 (2), 379-414 (2019).
  20. Rabinowitz, J. E., et al. Cross-packaging of a single adeno-associated virus (AAV) type 2 vector genome into multiple AAV serotypes enables transduction with broad specificity. Journal of Virology. 76 (2), 791-801 (2002).
  21. Cheng, D. T., et al. Memorial Sloan Kettering-Integrated Mutation Profiling of Actionable Cancer Targets (MSK-IMPACT). The Journal of Molecular Diagnostics. 17 (3), 251-264 (2015).
  22. Sun, H., Taneja, R. Analysis of Transformation and Tumorigenicity Using Mouse Embryonic Fibroblast Cells. Cancer Genomics and Proteomics. 383, 303-310 (2007).
  23. Durkin, M., Qian, X., Popescu, N., Lowy, D. Isolation of Mouse Embryo Fibroblasts. BIO-PROTOCOL. 3 (18), (2013).
  24. Jozefczuk, J., Drews, K., Adjaye, J. Preparation of Mouse Embryonic Fibroblast Cells Suitable for Culturing Human Embryonic and Induced Pluripotent Stem Cells. Journal of Visualized Experiments. (64), e3854(2012).
  25. Boehm, J. S., Hession, M. T., Bulmer, S. E., Hahn, W. C. Transformation of Human and Murine Fibroblasts without Viral Oncoproteins. Molecular and Cellular Biology. 25 (15), 6464(2005).
  26. Gupta, T., Sáenz Robles, T. M., Pipas, J. M. Cellular transformation of mouse embryo fibroblasts in the absence of activator E2Fs. Journal of Virology. 89 (9), 5124-5133 (2015).
  27. Leong, H., Blewitt, M. Retrovirus Mediated Malignant Transformation of Mouse Embryonic Fibroblasts. BIO-PROTOCOL. 3 (15), (2013).
  28. Parikh, N., Nagarajan, P., Sei-ichi, M., Sinha, S., Garrett-Sinha, L. A. Isolation and characterization of an immortalized oral keratinocyte cell line of mouse origin. Archives of Oral Biology. 53 (11), 1091-1100 (2008).
  29. Badarni, M., et al. Repression of AXL expression by AP-1/JNK blockage overcomes resistance to PI3Ka therapy. JCI Insight. 5, 125341(2019).
  30. Chen, Y. F., et al. Establishing of mouse oral carcinoma cell lines derived from transgenic mice and their use as syngeneic tumorigenesis models. BMC Cancer. 19 (1), 281(2019).
  31. Hoover, A. C., et al. The Role of Human Papillomavirus 16 E6 in Anchorage-Independent and Invasive Growth of Mouse Tonsil Epithelium. Archives of Otolaryngology-Head & Neck Surgery. 133 (5), 495(2007).
  32. Smahel, M., et al. Metastatic MHC class I-negative mouse cells derived by transformation with human papillomavirus type 16. British Journal of Cancer. 84 (3), 374-380 (2001).
  33. He, L., et al. Increased Growth of a Newly Established Mouse Epithelial Cell Line Transformed with HPV-16 E7 in Diabetic Mice. PloS One. 11 (10), e0164490(2016).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Baş Boyun KanseriCRISPR Cas9AAV TransdüksiyonuPrimer Hücre KültürüDil Epitel HücreleriGen DüzenlemeTümörijenik TransformasyonSiyenjenik Farelerİmmünofloresan AnalizWestern Blotting
Adeno-Associated Virus-Cas9 Sistemi Kullanılarak Genetiği Değiştirilmiş Bir Murine Baş ve Boyun Kanseri Hücre Hattı In Vitro Kurulması
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.