Yöntem makalesi

Kemotaktik Kolektif Göç için Mikroakışkanlarla Entegre Çekiş Mikroskobu

DOI:

10.3791/60415

⸱

13 Ekim 2019

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Sciences, Korea University, 2Department of Mechanical Engineering, Korea Advanced Institute of Science and Technology, 3Department of Environmental Health, Harvard T.H. Chan School of Public Health

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gelişimkolektif hücre göçü, yara iyileşmesi, ve kanser metastazı genellikle büyüme faktörleri veya sinyal moleküllerinin gradyanları tarafından yönlendirilir. Burada açıklanan bir mikroakışkan sistem ve biyokimyasal gradyan altında kolektif göç mekaniği ölçmek için nasıl bir gösteri ile çekiş mikroskobu birleştiren deneysel bir sistemdir.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hücreler kimyasal uyaranlara yanıt olarak göç desenlerini değiştirirler, uyaranların degradeleri de dahil olmak üzere. Kemotaksis olarak bilinen kimyasal degrade yönünde hücresel göç, gelişiminde önemli bir rol oynar, bağışıklık yanıtı, yara iyileşmesi, ve kanser metastazı. Kemotaksis tek hücre göçünün yanı sıra in vivo hücre koleksiyonlarını modüle ederken, in vitro araştırma kısmen uygun deneysel araçların eksikliği nedeniyle, tek hücreli kemotaksis üzerinde duruluyor. Bu boşluğu doldurmak için, burada açıklanan kolektif hücre göçü üzerinde kimyasal degradelerin etkilerini göstermek için mikroakışkan ve mikro desenleme birleştiren benzersiz bir deneysel sistemdir. Ayrıca, traksiyon mikroskobu ve monolayer stres mikroskobu, substrattaki ve komşu hücreler arasındaki hücresel kuvvet değişikliklerini karakterize etmek için sisteme dahil edilmiştir. Kavram kanıtı olarak, Madin-Darby köpek böbrek (MDCK) hücrelerinin mikro desenli dairesel adaların göçü, bilinen bir saçılma faktörü olan hepatosit büyüme faktörü (HGF) gradyanı altında test edilir. HGF'nin yüksek konsantrasyonuna yakın hücreler, bir hücre adası içinde karşı taraftakihücrelerden daha hızlı göç eder. Aynı ada içinde, hücresel çekiş her iki tarafta benzer, ancak hücreler arası stres yüksek HGF konsantrasyonu tarafında çok daha düşüktür. Bu yeni deneysel sistem hücresel kolektifler tarafından kemotaktik göç mekaniği çalışma için yeni fırsatlar sağlayabilir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biyolojik sistemlerde hücresel göç doku oluşumunda yer alan temel bir olgudur, bağışıklık yanıtı, ve yara iyileşmesi1,2,3. Hücresel göç de kanser gibi bazı hastalıklarda önemli bir süreçtir4. Hücreler genellikle toplu hücre geçişi4,5olarak bilinen tek tek yerine bir grup olarak göç. Hücrelerin kolektif olarak hareket edilebisolması için mikroortamın algılanması6esastır. Örneğin, hücreler fizyokimyasal uyaranları algılar lar ve hareketliliği, hücre-substrat etkileşimlerini ve hücre-hücre etkileşimlerini değiştirerek yanıt verirler, bu da kimyasal bir degrade boyunca yön göçüne neden olur7,8, 9,10. Bu bağlantıya dayanarak, hızlı gelişmeler bir chemoattractant11,12,13 gradyanı gibi iyi kontrollü kimyasal mikroortamlar oluşturabilirsiniz lab-on-a-chip teknolojilerinde yapılmıştır . Bu laboratuvar-on-a-çip tabanlı mikroakışkanlar daha önce hücresel topluluk veya hücresel küresel ler14,15,16,17kemotaksis çalışma için kullanılmış olsa da, onlar çoğunlukla tek hücreli geçiş bağlamında kullanılmıştır18,19,20,21. Kimyasal degradeye hücresel kolektif yanıtın altında yatan mekanizmalar hala iyi anlaşılamamıştır14,22,23,24,25,26 . Böylece, çözünen faktörlerin spatiotemporal kontrolü sağlayan bir platform geliştirilmesi yanı sıra hücrelerin biyofiziksel yerinde gözlem kolektif hücre göçü arkasındaki mekanizmaları çözmek için yardımcı olacaktır.

Burada geliştirilen ve açıklanan desenli hücre kümelerinin göç modüle çözünür faktörlerin bir konsantrasyon gradyanı üretimi sağlayan çok kanallı mikroakışkan bir sistemdir. Bu çalışmada Madin-Darby kan böbrek (MDCK) hücrelerinin göç davranışını düzenlemek için hepatosit büyüme faktörü (HGF) seçilmiştir. HGF hücre-hücre bütünlüğünü zayıflatmak ve hücrelerin hareketliliğini artırmak bilinmektedir27,28. Mikroakışkan sistemde, Fourier transform traksiyon mikroskobu ve monolayer stres mikroskobu da dahil edilmiştir, bu da bir HGF'ye yanıt olarak kurucu hücreler tarafından indüklenen hareketlilik, kontraktil kuvvet ve hücreler arası gerilimin analizine olanak sağlar. Degrade. Aynı ada içinde, HGF yüksek konsantrasyonyakınında bulunan hücreler daha hızlı göç ve düşük HGF konsantrasyonu ile tarafında daha düşük hücreler arası stres düzeyleri göstermektedir. Sonuçlar, bu yeni deneysel sistemin çeşitli çözünür faktörlerin kimyasal degradeleri altında kolektif hücresel göçü içeren alanlardaki diğer soruları araştırmak için uygun olduğunu göstermektedir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

NOT: Şablonlar (kalınlık = 250 μm) ve mikrokanal parçaları (kalınlık = 150 μm), cam gravür (derinlik = 100 μm) ve döküm imalatı için SU-8 kalıplarının litografisi, üreticilere bilgisayar destekli tasarım yazılımı kullanılarak tasarımlar gönderilerek dış kaynak tanyapılmıştır.

1. Polidimethylsiloxane (PDMS) şablon ve mikrokanal imalatı

  1. Şablon ve mikrokanalın mikro deseni tasarla.
  2. Silikon gofretler (4" çap) üzerinde SU-8 kalıpları (şablonlar için ~250 μm kalınlık ve mikrokanallar için ~150 μm) imalatı veya dış kaynak.
  3. BAZ elastomerve kür ajanını 10:1 oranında karıştırarak PDMS karışımını hazırlayın.
    1. Baz elastomerin 15 mL'ini 50 mL konik bir tüpe yerleştirin ve 1,5 mL kürleme maddesi ekleyin. Bunlardan iki tane hazırla.
    2. Girdap PDMS karışımı için 5 dk. Centrifuge PDMS karışımı 196 x g 1 dk kabarcıklar kaldırmak için.
  4. PDMS şablonu imal etmek için, PDMS'nin SU-8 sütunlarının kenarına değmesi için SU-8 desenli bölgelerden kaçınırken, pdms karışımının ~1 mL'sini gofrete dökün, ancak SU-8 deseninin üst tarafına değmesin.
    1. Gofret oda sıcaklığında (RT) 30 dakikadan fazla düz bir yüzeye yerleştirin. PDMS'yi 80 °C'de kuru fırında 2 saatin üzerinde bir süre için tedavi edin.
    2. SU-8 kalıbından PDMS'yi dikkatlice soyup 14 mm'lik içi boş bir zımba kullanarak ince PDMS membranını kırpın. Yapışkan bant kullanarak PDMS parçalarının yüzeyindeki tozu çıkarın ve PDMS şablonlarını otoklavlayın.
  5. PDMS mikrokanalını imal etmek için SU-8 kalıbına ~30 mL PDMS karışımı dökün.
    1. Bir vakum odasında 30 dakika için Gaz ve 2 saat üzerinde 80 °C'de kuru bir fırında PDMS tedavi.
    2. PDMS'yi SU-8 kalıbından dikkatlice soyun ve PDMS'yi 24 mm x 24 mm boyutuna kadar kesin. Her PDMS bloğunda, 1 mm biyopsi zımbakullanarak bir çıkış ve üç giriş oluşturun.

2. Poliakrilamid (PA) jel ile alt cam hazırlanması

  1. Dikdörtgen saklı camların (24 mm x 24 mm x 1 mm) dikdörtgen mikro kuyulu (6 mm x 12 mm, 100 μm derinlik29)kesme ve gravür lüzumlu camlarının kesilmesi ve gravürle üretilmesi veya dış kaynak üretilmesi.
  2. Bir alt cam yüzeyi Silanize30.
    1. 200 mL deiyonize su (DIW), 80 μL asetik asit ve 50 μL 3-(trimethoxysilyl) propil metakrit (TMSPMA) 1 saat karıştırarak bir bağlama silane çözeltisi hazırlayın.
      DİkKAT: TMSPMA yanıcı bir sıvıdır. Malzeme güvenliği veri sayfalarındaki önerileri uygulayın. Sadece kimyasal duman kaputunda kullanın.
    2. Yapışkan bant ile cam yüzeyinden toz çıkarın ve cam otoklav.
    3. Alt camın kazınmış yüzeyini 100 μL'lik bağlama çözeltisi ile kapatın ve camı RT'de 1 saat bekletin.
    4. DIW 3x ile camı durulayın ve camın ortam havası sıcaklığında veya hava üfleyerek kurumasına izin verin.
  3. PA jel31için bir jel çözeltisi hazırlayın.
    1. % 0.5 (w/v) amonyum persülfat (APS) taze bir çözelti hazırlayın DIW 1 mL IÇINDE 5 mg APS eriterek.
    2. 138 μL %40 akrilamid çözeltisi, 101 μL %2 bis-akrilamid çözeltisi, 5 μL floresan partikül çözeltisi (0,2 μm) ve 655°L DIW'den oluşan PA jel çözeltisini hazırlayın.
      DİkKAT: Akrilamid ve bisakrrilamid çözeltileri toksiktir. Koruyucu eldiven, giysi ve göz koruması giyin. Floresan parçacıklar içeren PA jel çözeltisini ışıktan koruyun.
      NOT: Girdap floresan boncuk çözeltisi toplu başına floresan boncuk tek tip bir sayı elde etmek için pipetting önce.
    3. APS çözeltisinin 100 μL'si ve 1 μL tetrametiletilendiamin (TEMED) ekledikten sonra, 10 μL karışık jel çözeltisini dikdörtgen mikro kuyuya aktarın ve üzerine dairesel bir kapak kaydırığa (18 mm) yerleştirin.
      NOT: Kabarcıklar olmadan PA jel ile alt cam doldurmak için, alt cam oluk yeterli jel çözeltisi yerleştirin, dikkatle jel çözeltisi üzerinde coverslip slayt ve herhangi bir aşırı jel çözeltisi kaldırın.
      DİkKAT: Jel yavaş yavaş yaklaşık 40 dakika boyunca tedavi edilir. Santrifüj jelleri için aşağıdaki prosedür mümkün olan en kısa sürede yapılmalıdır.
    4. PA jel üst tabakasına floresan parçacıklar getirmek için 96 x g 10 dakika için özel cam, jel çözeltisi ve coverslip montaj çevirin.
    5. Tertibatı santrifüjden çıkarın ve kapak kayması aşağı bakacak şekilde düz yüzeye yerleştirin.
      NOT: Adım 2.3.6 ile başlayarak, numuneleri biyogüvenlik kabininde ele alın.
    6. 30 dakika sonra, montajı çevirin ve 35 mm'lik petri kabına yerleştirin, 2 mL DIW ile doldurun ve (forceps kullanarak) bir tarafa kaydırarak kapağı hafifçe çıkarın.
      NOT: Kürlü PA jel 1 ay DIW saklanabilir. Ancak, kollajen PA jel kaplı bir kez, 1 gün içinde bir deneyde kullanılmalıdır.
  4. PA jel üzerinde Coat kollajen.
    1. 1 mg/mL sulfosuccinimidil 6-(4'-azido-2'-nitrofenilmino) hekzanoat (sulfo-SANPAH) sıcak 50 mM HEPES tamponunda çözün. Çözeltinin 200 μL'sini jel yüzeyine bırakın ve 10 dakika uv ışığı (365 nm dalga boyu) ile etkinleştirin.
      NOT: Sulfo-SANPAH'ı ışıktan koruyun.
    2. Jeli 0,1 M [4-(2-hidroksietil)-1-piperazineetanesülfonik asitle durula; HEPES] tampon 2x ve PBS 1x ile.
    3. Bir gecede 4 °C'de kollajen solüsyonu (PBS'de 100 μg/mL, sıçan kuyruğu kollajen tip I) ile PA jeli kaplayın. Ertesi gün PBS 3x ile yıkayın.

3. Hücre adalarının mikro desenlemi

  1. PBS'de F-127(Malzeme Tablosu)çözeltisini [%2 (w/v) hazırlayın ve otoklavlı PDMS şablonunu F-127 çözeltisindeki batırın. 37 °C'lik bir kuluçka makinesinde 1 saat bekletin.
  2. Hücre çözeltisi (2 x 106 hücre/mL) hücre kültürü medyada: Dulbecco'nun modifiye Kartal ortamı (DMEM) %10 fetal sığır serumu (FBS) ve %1 antibiyotik antimikotik (AA) ile hazırlayın.
  3. PDMS şablonunu PBS 3x ile yıkayın ve hem PDMS şablonundan hem de PA jelden sıvı çıkarın. PDMS şablonunu PA jelin üzerine yerleştirin ve şablona PBS ekleyin.
  4. PDMS şablonundaki kabarcıkları yavaşça borulayarak çıkarın. Kabarcıkları çıkardıktan sonra PBS'yi PDMS şablonunun yüzeyinden çıkarın.
  5. PDMS şablonuna 200 μL hücre çözeltisi koyduktan sonra, hücrelerin PA jele bağlanması için PA jeli 1 saat boyunca bir kuvözde tutun.
  6. Hücre çözümcã1/4nÃ1/4 hücre kÃ1/4ltÃ1/4r çã¶zÃ1/4mÃ1/4nÃ1/4 hücre kızıntısı ile hafifçe temizle, PDMS şablonunu kaldırın ve daha fazla hücre kà Bir mikroskop altında hücre adalarının oluşumunu kontrol edin.

4. PDMS mikrokanal ile PA jel montajı

  1. Yapışkan bant kullanarak PDMS mikrokanalındaki tozu çıkarın, ardından otoklav.
  2. PDMS mikrokanalının yüzeyini 30 s oksijen plazması (80 W, 50 kHz) ile tedavi edin.
  3. PA jel dolu alt cam üzerinde herhangi bir sıvı çıkardıktan sonra, alt cam üstüne PDMS mikrokanal yerleştirin ve özel cam tutucu montaj koymak.
  4. Mikro kanalı hücre kültürü ortamıyla doldurun.
    DİkKAT: Sıcak ortamı pipetle hafifçe yıkarak kanallarda sıkışıp kalan tüm kabarcıkları çıkardıktan emin olun. Ayrıca, kabarcıklar kaldırırken, mikro desenli hücre adaları ayırmak için değil emin olun.

5. Entegre mikroakışkan sistem

  1. Boruları bağlayın.
    1. İğnelerin ucunu (18 G) kırparak ve 90° bükerek konektörleri hazırlayın.
    2. Üç giriş ve bir çıkış için boru hatları hazırlayın.
      1. Giriş boruları için, kesilmiş iğneyi ve 30 cm'lik mini hacimli hattı üç yönlü stopcock ile bağlayın. Bunlardan üç tane hazırla.
      2. Çıkış borusu için, kesilmiş iğneyi ve 75 cm'lik mini hacimli hattı üç yönlü stopcock ile bağlayın. Bunlardan birini hazırla.
      3. Boru hatlarını önceden ısıtılmış ortamla doldurun.
        DİkKAT: Sıcak ortamı şırınga ile hafifçe yıkarak boru hatlarında sıkışmış tüm kabarcıkları çıkardıktan emin olun.
    3. Şırıngalardan dalan ve giriş boru hatlarını birbirine bağlayarak rezervuarları hazırlayın.
    4. Her boru hattının iğne konektörlerini üç girişe ve mikroakışkan cihazın bir çıkışına takın.
  2. Rezervuarları her biri 3 mL taze orta veya şartlı orta ile doldurun.
    1. Degrade testi için, hücre kültürü ortamında sol giriş haznesini 20 ng/mL HGF ile doldurun.
    2. Konsantrasyon gradyanının görselleştirilmesi için sol giriş haznesine 200 μg/mL floresan boya (rhodamine B-dextran, 70 kDa) ekleyin.
    3. Çıkış boru hattını şırınga pompasına bağlayın.
      NOT: Şırınga pompasının çalışma modu "çekilme"dir. Şırınganın kapasitesine ve şırınga pompasının çalışma hızına göre akış hızı değiştirilir.
  3. Entegre mikroakışkan sistemi geleneksel epifloresan mikroskobun sahnesine yerleştirin.
    DİkKAT: Mikroakışkan kanalda yumuşak bir HGF degradesi oluşturmak için akış hızı 0,1 μL/dk kadar yavaş olmalıdır. Bu, 2 saat stabilizasyon gerektirmesi için yeterince hassastır ve deney sırasında fiziksel bozulmayı önlemek için dikkatli olunmalıdır.

6. Görüntü edinimi

  1. Bir kuluçka makinesinde bulunan otomatik bir mikroskop kullanarak 24 saate kadar her 10 dakikada bir görüntü alın. Her zaman diliminde, hücre göçünü görselleştirmek için faz görüntüsü, PA jel'e gömülü floresan boncukları görselleştirmek için yeşil floresan görüntü ve görselleştirmek için kırmızı floresan görüntü dahil olmak üzere üç farklı kanalda 4x nesnel lens kullanarak bir dizi görüntü alın bir kimyasalın konsantrasyon gradyanı.
  2. Hızlandırılmış görüntüler aldıktan sonra, PA jel hücreleri ayırmak için mikrokanallar içine% 0.25 tripsin-EDTA çözeltisi infüzyon. Jel hücreleri tamamen çıkardıktan sonra, çekiş mikroskopisi için bir referans görüntü olarak kullanılmak üzere yeşil floresan görüntü almak.

7. Veri analizi

NOT: Veri analizi için özel bir kod MATLAB kullanılarak geliştirilmiştir ve ayrıntılar başka bir yerde32,33,34,35,36olarak tanımlanmıştır.

  1. Faz-görüntü analizi için, parçacık görüntü velocimetry36kullanarak iki ardışık faz görüntüleri deplasmanları hesaplamak.
  2. Fourier transform trtroskopi için, her yeşil floresan görüntüyü referans görüntüsüyle karşılaştırın ve parçacık görüntüsü velocimetry36kullanarak her görüntüdeki yer değiştirmeleri hesaplayın. Deplasmanlardan, Fourier transform traksiyon mikroskobu kullanarak PA jel üzerinde hücreler tarafından yapılan çekiş kurtarmak33,34,37.
  3. Çekiş verilerinden, sonlu elemanlaryöntemlerinedayalı monolayer stres mikroskobu kullanarak hücre adasının monolayer içinde stres hesaplamak 32,34,38.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kimyasal bir degrade altında kolektif göçü araştırmak için, mikroakışkan bir sistem çekiş mikroskobu ile bütünleşmiştir(Şekil 1). Entegre sistemi oluşturmak için, poliakrilamid (PA) jel özel kesim cam üzerine atıldı ve MDCK hücreleri bir PDMS şablon tarafından yapılan mikro desenli adalar içinde tohumlu edildi. Bu deney için, MDCK hücrelerinden oluşan on iki ada (üç sütuna dört sıra, çapı ~700 μm) oluşturuldu. PA jellere bağlı hücrelerden sonra, toplu göç başlatmak için PDMS şablonu kaldırıl...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kurucu hücrelerin kolektif göçü geliştirme ve rejenerasyon sırasında önemli bir süreçtir ve göç yönü genellikle büyüme faktörlerinin kimyasal degrade tarafından yönlendirilir4,23. Toplu geçiş sırasında hücreler komşu hücrelerle ve altta yatan alt tabakalarla etkileşime devam eder. Bu tür mekanik etkileşimler durotaksis42, plithotaxis33ve kenotaxis43gibi acil fenomenlere yol açar. Ancak bu ara...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarları olduğunu beyan.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma Kore Hükümeti (MSIP) (No) tarafından finanse edilen Kore Ulusal Araştırma Vakfı (NMG) hibe tarafından desteklenmiştir. NRF-2017R1E1A1A01075103), Kore Üniversitesi Hibeve BK 21 Plus programı. Ayrıca Ulusal Sağlık Enstitüleri (U01CA202123, PO1HL120839, T32HL007118, R01EY019696) tarafından desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
% 0.25 tripsin-EDTA (1X)Gibco25200-056
1 M HEPES tampon çözeltisiGibco15630-056
1 mm Biyopsi zımbasıIntegra Miltex33-31AA-P / 25
100 mm petri kaplarıSPL10100100 mm çap, 15 mm yükseklik
14 mm içi boş zımbaILJIN124-0571
18 mm & Oslash; LamelMarienfeld-Superior111580Dairesel 18 mm, kalınlık No. 1 (0,13 ila 0,16 mm)
%2 bis-akrilamid çözeltisiBio-Rad1610142Koruyucu eldiven, giysi ve göz koruması kullanın.
3- (Trimetoksisilil) propil metakrilat (TMSPMA)Sigma-Aldrich440159-500ML
3 muslukHyupsungHS-T-61NDİKKAT: daha önce açılmışsa kullanmayın. 30 cm minimum hacim hattını yeniden sterilize etmeyin veya yeniden kullanmayın
(pediatrik için)HyupsungHS-MV-30DİKKAT: daha önce açılmışsa kullanmayın.
35 mm hücre kültürü kabınıyeniden kullanmayın Corning Belediyesi
430165 %40 Akrilamid SolüsyonuBio-Rad1610140Koruyucu eldiven, giysi ve göz koruması kullanın.
75 cm minimum hacim hattı (pediatrik için)HyupsungHS-MV-75DİKKAT: Daha önce açılmışsa kullanmayın. Asetik asidi yeniden sterilize etmeyin veya yeniden kullanmayın
JT BakerJT9508-03
Amonyum persülfat (APS)Bio-Rad1610700
Antibiyotik-AntimikotikGibco15240-062
Alt cam çipMicroFIT24 x 24 x 1 mm, ısmarlama, dikdörtgen oluk (6 x 12 mm, derinlik: 100 μ m)
Kollajen tip I, Sıçan kuyruğuCorning354236
Özel cam tutucuHan-Gug Mekatronikısmarlama
Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı (DMEM)WelgeneLM 001-11
Dulbecco'nun Fosfat Tamponlu Tuzlu Suyu (PBS)BiowestL0615-500Magnezyum, Kalsiyum
Fetal sığır serumu (FBS)Gibco26140-179
FluoSpheres amin modifiyeli mikro kürelerInvitrogenF87640.2 ve mikro; m, sarı-yeşil floresan (505/515)
Hepatosit Büyüme Faktörü (HGF)Sigma-AldrichH1404-5UGrekombinant, insan
JuLI aşaması canlı hücre görüntüleme sistemiNanoEnTek Otomatikİnkübatör uyumlu (37 ° C ve %5 CO2)
Madin-Darby Köpek Böbreği (MDCK) hücretipi II
Oksijen plazma sistemiFemto ScienceCUTE-MPR
Pluronic F-127Sigma-AldrichP2443-250G
Rhodamine B izotiyosiyanat – dextranSigma-AldrichR9379-100MG70 kDa, mikroakışkan kanalda HGF'nin uzay-zamansal dağılımını tahmin etmek için kullanılır
Steril hipodermik iğne 18 GKOVAXİğnenin ucunu kesin ve ses hattı ile giriş/çıkış portlarını bağlamak için 90 derece bükün
Yapışkan bant3M/Scotch810D33 m x 19 mm
SU-8 ana kalıplarMicroFIT4 inç çapı, ısmarlama
sülfosüksinimidil 6- (4'-azido-2'-nitrofenilamino) heksanoat (Sulfo-SANPAH)Thermo Scientific22589-20 ° C'de saklayın Nem ve ışıktan koruyarak saklayın.
Sylgard 184 Elastomer KitiDow CorningPDMS
Şırınga pompasıChemyx Inc.model fusion 720sıvı çekme
ŞırıngalarıKOVAX1, 3, 5, 10 veya 50 cc giriş rezervuarı veya çıkış şırınga pompası
tetrametetilendiamin (TEMED)Bio-Rad1610800Koruyucu eldiven, giysi ve göz koruması kullanın.
Ultraviyole (UV) lambaUVP LLC95-0248-02365 nm dalga boyu
yeniden sterilize etmeyin veya XYZ aşamasında ve florsent görüntülemede

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Reig, G., Pulgar, E., Concha, M. L. Cell migration: from tissue culture to embryos. Development. 141 (10), 1999-2013 (2014).
  2. Luster, A. D., Alon, R., von Andrian, U. H. Immune cell migration in inflammation: present and future therapeutic targets. Nature Immunology. 6 (12), 1182-1190 (2005).
  3. Liang, C. C., Park, A. Y., Guan, J. L. In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro. Nature Protocols. 2 (2), 329-333 (2007).
  4. Friedl, P., Gilmour, D. Collective cell migration in morphogenesis, regeneration and cancer. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (7), 445-457 (2009).
  5. Mayor, R., Etienne-Manneville, S. The front and rear of collective cell migration. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (2), 97-109 (2016).
  6. DuFort, C. C., Paszek, M. J., Weaver, V. M. Balancing forces: architectural control of mechanotransduction. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 12 (5), 308-319 (2011).
  7. Vogel, V. Mechanotransduction involving multimodular proteins: converting force into biochemical signals. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 35, 459-488 (2006).
  8. Roca-Cusachs, P., Sunyer, R., Trepat, X. Mechanical guidance of cell migration: lessons from chemotaxis. Current Opinion in Cell Biology. 25 (5), 543-549 (2013).
  9. Weber, G. F., Bjerke, M. A., DeSimone, D. W. A mechanoresponsive cadherin-keratin complex directs polarized protrusive behavior and collective cell migration. Developmental Cell. 22 (1), 104-115 (2012).
  10. Ingber, D. E. Cellular mechanotransduction: putting all the pieces together again. FASEB Journal. 20 (7), 811-827 (2006).
  11. Ricart, B. G., Yang, M. T., Hunter, C. A., Chen, C. S., Hammer, D. A. Measuring traction forces of motile dendritic cells on micropost arrays. Biophysical Journal. 101 (11), 2620-2628 (2011).
  12. Garcia, S., et al. Generation of stable orthogonal gradients of chemical concentration and substrate stiffness in a microfluidic device. Lab on a Chip. 15 (12), 2606-2614 (2015).
  13. Zhang, Z., et al. Scalable Multiplexed Drug-Combination Screening Platforms Using 3D Microtumor Model for Precision Medicine. Small. 14 (42), 1703617(2018).
  14. Ayuso, J. M., et al. Study of the Chemotactic Response of Multicellular Spheroids in a Microfluidic Device. PLoS ONE. 10 (10), 0139515(2015).
  15. McCutcheon, S., et al. In vitro formation of neuroclusters in microfluidic devices and cell migration as a function of stromal-derived growth factor 1 gradients. Cell Adhesion & Migration. 11 (1), 1-12 (2017).
  16. Ellison, D., et al. Cell-cell communication enhances the capacity of cell ensembles to sense shallow gradients during morphogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (6), 679-688 (2016).
  17. Fujimori, T., Nakajima, A., Shimada, N., Sawai, S. Tissue self-organization based on collective cell migration by contact activation of locomotion and chemotaxis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (2019).
  18. Li Jeon, N., et al. Neutrophil chemotaxis in linear and complex gradients of interleukin-8 formed in a microfabricated device. Nature Biotechnology. 20 (8), 826-830 (2002).
  19. Saadi, W., Wang, S. J., Lin, F., Jeon, N. L. A parallel-gradient microfluidic chamber for quantitative analysis of breast cancer cell chemotaxis. Biomedical Microdevices. 8 (2), 109-118 (2006).
  20. Abhyankar, V. V., Lokuta, M. A., Huttenlocher, A., Beebe, D. J. Characterization of a membrane-based gradient generator for use in cell-signaling studies. Lab on a Chip. 6 (3), 389-393 (2006).
  21. Bersini, S., et al. A microfluidic 3D in vitro model for specificity of breast cancer metastasis to bone. Biomaterials. 35 (8), 2454-2461 (2014).
  22. Rorth, P. Whence directionality: guidance mechanisms in solitary and collective cell migration. Developmental Cell. 20 (1), 9-18 (2011).
  23. Rorth, P. Collective guidance of collective cell migration. Trends in Cell Biology. 17 (12), 575-579 (2007).
  24. McCutcheon, S., et al. In vitro formation of neuroclusters in microfluidic devices and cell migration as a function of stromal-derived growth factor 1 gradients. Cell Adhesion & Migration. 11 (1), 1-12 (2017).
  25. Rorth, P. Whence directionality: guidance mechanisms in solitary and collective cell migration. Developmental Cell. 20 (1), 9-18 (2011).
  26. Rorth, P. Collective guidance of collective cell migration. Trends in Cell Biology. 17 (12), 575-579 (2007).
  27. Farrell, J., et al. HGF induces epithelial-to-mesenchymal transition by modulating the mammalian hippo/MST2 and ISG15 pathways. Journal of Proteome Research. 13 (6), 2874-2886 (2014).
  28. Wang, T. W., Zhang, H., Gyetko, M. R., Parent, J. M. Hepatocyte growth factor acts as a mitogen and chemoattractant for postnatal subventricular zone-olfactory bulb neurogenesis. Molecular and Cellular Neuroscience. 48 (1), 38-50 (2011).
  29. Lin, Y. C., et al. Mechanosensing of substrate thickness. Physical Review. E, Statistical, Nonlinear and Soft matter Physics. 82, 4 Pt 1 041918(2010).
  30. Serra-Picamal, X., Conte, V., Sunyer, R., Munoz, J. J., Trepat, X. Mapping forces and kinematics during collective cell migration. Methods in Cell Biology. 125, 309-330 (2015).
  31. Denisin, A. K., Pruitt, B. L. Tuning the Range of Polyacrylamide Gel Stiffness for Mechanobiology Applications. ACS Applied Materials & Interfaces. 8 (34), 21893-21902 (2016).
  32. Jang, H., et al. Traction microscopy with integrated microfluidics: responses of the multi-cellular island to gradients of HGF. Lab on a Chip. 19 (9), 1579-1588 (2019).
  33. Tambe, D. T., et al. Collective cell guidance by cooperative intercellular forces. Nature Materials. 10 (6), 469-475 (2011).
  34. Jang, H., et al. Homogenizing cellular tension by hepatocyte growth factor in expanding epithelial monolayer. Scientific Reports. 8, 45844(2017).
  35. Trepat, X., et al. Physical forces during collective cell migration. Nature Physics. 5 (6), 426(2009).
  36. Tolic-Norrelykke, I. M., Butler, J. P., Chen, J., Wang, N. Spatial and temporal traction response in human airway smooth muscle cells. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 283 (4), 1254-1266 (2002).
  37. Butler, J. P., Tolic-Norrelykke, I. M., Fabry, B., Fredberg, J. J. Traction fields, moments, and strain energy that cells exert on their surroundings. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 282 (3), 595-605 (2002).
  38. Tambe, D. T., et al. Monolayer stress microscopy: limitations, artifacts, and accuracy of recovered intercellular stresses. PLoS ONE. 8 (2), 55172(2013).
  39. Dembo, M., Wang, Y. L. Stresses at the cell-to-substrate interface during locomotion of fibroblasts. Biophysical Journal. 76 (4), 2307-2316 (1999).
  40. Wang, N., et al. Cell prestress. I. Stiffness and prestress are closely associated in adherent contractile cells. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 282 (3), 606-616 (2002).
  41. Notbohm, J., et al. Cellular Contraction and Polarization Drive Collective Cellular Motion. Biophysical Journal. 110 (12), 2729-2738 (2016).
  42. Sunyer, R., et al. Collective cell durotaxis emerges from long-range intercellular force transmission. Science. 353 (6304), 1157-1161 (2016).
  43. Kim, J. H., et al. Propulsion and navigation within the advancing monolayer sheet. Nature Materials. 12 (9), 856-863 (2013).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Traction MicroscopyMicrofluidic ChipChemotactic MigrationCollective Cell MigrationMonolayer Stress MicroscopyHepatocyte Growth FactorMadin Darby Canine Kidney CellsPDMS StencilPolyacrylamide GelFluorescent Beads

İlgili makaleler