Otomasyon, hücre üretiminde yükseltme ve maliyet yönetiminin anahtarıdır. Bu el yazması, küçük ölçekli biyoişleme için arabellek değişimi ve hücre konsantrasyonu adımlarını otomatikleştirmek için bir karşı akış santrifüj hücre işleme cihazının kullanımını açıklar.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Küçük Ölçekli Hücre İşleme için Otomatik Karşı Akım Santrifüj Sistemi
Bu makalede
Özet
Özet
Gen ve hücre bazlı tedavilerin başarılı bir şekilde ticarileştirilmesi, uygun maliyetli ve ölçeklenebilir üretim süreçleri gerektirir. Tampon değişimi ve ürün konsantrasyonu çoğu üretim süreci için gerekli bileşenlerdir. Ancak, ürün geliştirmenin erken aşamalarında, bu adımlar genellikle el ile gerçekleştirilir. Tampon değişimi için manuel çıkmaz santrifüj emek yoğun, pahalı ve ölçeklenebilir değildir. Kapalı otomatik bir sistem bu zahmetli adımı etkili bir şekilde ortadan kaldırabilir, ancak uygulama zor olabilir. Burada, küçük ve orta ölçekli hücre işleme için uygun olan ve manuel işleme ve büyük ölçekli otomasyon arasındaki boşluğu kapatmayı amaçlayan yeni geliştirilmiş bir hücre işleme cihazını tanımlıyoruz. Bu protokol, akış hızı ve santrifüj hızını değiştirerek çeşitli hücre tiplerine ve süreçlerine kolayca uygulanabilir. Protokolümüz, manuel işlemle karşılaştırıldığında daha kısa işlem süreleriyle yüksek hücre kurtarmasını gösterdi. Otomatik işlemden kurtarılan hücreler de çoğalma oranlarını korudu. Cihaz, arabellek değişimi, hücre formülasyonu ve kriyopreservation gibi adımları karşılamak için kapalı bir üretim sürecinde modüler bir bileşen olarak uygulanabilir.
Giriş
Modern tıbbın manzarası gen ve hücre temelli tedavilerdeki (GCT) son gelişmelerle hızla değişmiştir. Çeviri araştırmalarında en hızlı büyüyen alanlardan biri olan GCT sektörü, benzersiz ve eşi görülmemiş zorluklarla da karşı karşıyadır. Sağlam klinik sonuçlara ek olarak, verimli ve uygun maliyetli üretim süreçleri GCT ticari başarı için gereklidir, özellikle küçük ölçekli üretim elde etmek zordur1. Zaman maliyeti, işçilik, ve kalite güvenceleri hücrelerin her toplu sadece yüz veya binlerce yerine bir hasta için birkaç doz üretir büyütülür. Üretim süreçlerinin antikor ve rekombinant protein üretimine daha çok benzediği allojen hücre tedavilerind....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
1. Tampon değişimi için reaktiflerin ve hücrelerin hazırlanması
- Sınıf 2 laminar akış başlığında arabellekleri hazırlayın (Bkz. Malzeme Tablosu). Şırınga ve iğne tertibatı kullanarak, 500 mL tuzlu torbadan 50 mL tuzlu çözelti çıkarın. Bunu %20 insan serum albumininin (HSA) 50 mL'si ile değiştirin ve %2 hsa'yı tuzlu da yapın ve bu da yıkama tamponu görevi göreceksiniz.
- Hücreleri kültür damarlarından çıkarın ve trypan mavisi hariç tutularak başlangıç hücre miktarını ve canlılığını belirlemek için bir hücre sayısı gerçekleştirin. Hücreleri bir aktarım torbasına yükleyin.
NOT: Bu protokolde Jurkat hücreleri RPMI'de kültürlenmiş ve Ms....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Bu protokolde, otomatik arabellek değişim sürecini göstermek için Jurkat hücreleri ve MSC'leri temsili örnekler olarak kullandık. İşlem sırasında Jurkat hücreleri ve MSC'ler aynı işlem adımlarını, akış hızını kontrol eden santrifüj kuvvet ve pompa hızı farklılıkları ile paylaşmış(Tablo 1). Şekil 2, tampon değişim işlemi sırasında akışkan hücre yatağının nasıl görünebileceğine kamera tarafından çekilen temsili görüntüleri gösterir. Tipik olarak, akışkan hücre yatağı
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Açıklanan otomatik arabellek değiştirme protokolü basit ve kullanıcı dostudur. Yine de, bu protokolde kritik ve özellikle dikkat gerektiren birkaç önemli adım vardır. Deneyimlerimize göre, MSC'ler (ortalama çap 10-15 μm) gibi daha büyük hücreleri işlerken her çalışmada en az 1 x 107 hücre içermelidir(Şekil 4B). Jurkat hücreleri (ortalama ~10 μm çap) gibi daha küçük hücrelerin işlenmesi, kararlı bir akışkan hücre yatağı elde etmek için yaklaşık 3 x 107 h.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
SW, IF ve DJ COO, CTO ve CEO'su Scinogy Pty. Ltd vardır. CFC cihazına erişim de Scinogy tarafından sağlanmıştır.
Teşekkürler
Bu çalışma Viktorya Hükümeti'nin Operasyonel Altyapı Destek Programı ve Ekonomik Kalkınma, İşler, Ulaştırma ve Kaynaklar Bakanlığı tarafından sağlanan Viktorya Hükümeti Teknoloji Fişi tarafından desteklenir. RL Ulusal Sağlık ve Tıbbi Araştırma Konseyi Kariyer Geliştirme Bursu alıcıdır. AL, Avustralya Lisansüstü Ödülü'nü kazanmıştır.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 20 ml Luer kilitli şırıngalar | BD | 302830 | |
| %20 İnsan serum albümini (HSA) | CSL Behring | AUST R 46283 | |
| 4- (Dimetilamino) benzaldehit | Sigma-Aldrich | 156477-25g | |
| 500ml IV tuzlu su torbası | Fresenius Kabi | K690521 | |
| Antibiyotik-Antimikotik | Thermo Fisher Scientific | 15240112 | |
| Otomatik hücre sayacı (Kontes) | Thermo Fisher Scientific | N/A | |
| Hücre sayma odası slaytları | Thermo Fisher Scientific | C10228 | |
| Hücre stimülasyon kokteyli (500x) | Thermo Fisher Scientific | 00-4970-93 | |
| Hücre transfer torbaları | Terumo | T1BBT060CBB | |
| CellTiter AQueous Tek Çözeltili Hücre Proliferasyon Testi (MTS) | Promega | G3582 | |
| Santrifüj | Eppendorf | 5810R | |
| DMEM: F12 ortamı | Thermo Fisher Scientific | 11320082 | |
| EnVision plaka Okuyucu | Perkin Elmer | N/A | |
| Fetal sığır serumu (FBS) | Thermo Fisher Scientific | 10099141 | |
| İnsan İnterlökin 2 (IL2) Kiti | Perkin Elmer | Al221C | |
| Luer (dişi) bağlantı parçaları, | CPC | LF41 | |
| PC, dizüstü bilgisayar veya PC, tablet cihazı | ASUS, | N/A | |
| Plaka okuyucu (SpectraMax i3) | Moleküler Cihaz | , N/A | |
| Rekombinant İnsan IFN-&gama; | PeproTech | 300-02 | |
| Rotea ters akışlı santrifüj hücre işleme cihazı | Scinogy | N/A | |
| Rotea tek kullanımlık işleme kiti | Scinogy | N/A | |
| RPMI ortamı | Thermo Fisher Scientific | 11875119 | |
| Cerrahi makas | ProSciTech | 420SS | |
| Trikloroasetik asit | Sigma-Aldrich | T6399-250g | |
| Tripan Mavi leke | Thermo Fisher Scientific | T10282 | |
| Tripsin sindirim enzimi (TrypLE Express Enzimi) | Thermo Fisher Scientific | 12604013 |
Kaynaklar
- Lopes, A. G., Sinclair, A., Frohlich, B. Cost Analysis of Cell Therapy Manufacture: Autologous Cell Therapies, Part 1. BioProcess International. 16 (3), (2018).
- Hampson, B., Ceccarelli, J. Factories of the future: Can Patient-Sp....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
