Yöntem makalesi

Derili Kardiyomiyositler Kullanarak Kardiyak Fonksiyonun İn Vitro Değerlendirilmesi

6.8K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/60427

⸱

22 Haziran 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Unidade de Investigação Cardiovascular, Departamento de Cirurgia e Fisiologia, Faculdade de Medicina, Universidade do Porto, 2Department of Physiology, Kilimanjaro Christian Medical University College

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Bu protokol, derili kardiyomiyositler kullanılarak kardiyak fonksiyonun ekstraksiyon ve değerlendirilmesi tekniğini adım adım tanımlamayı amaçlamaktadır. Bu metodoloji, farelerden erkeklere kadar farklı kardiyak yerlerden toplanabilen küçük dondurulmuş biyopsiler kullanarak miyofilament fonksiyonunun ölçülmesine ve akut modülasyonuna olanak sağlar.

Özet

Bu makalede, tek bir geçirimli ("derili") kardiyomiyositi izole etmek ve fonksiyonel çalışmalar yapmak için bir kuvvet ölçme aparatı ve bir motora takmak için gereken adımları açıklıyoruz. Bu çalışmalar kardiyomiyosit sertliği ölçümü (pasif kuvvet) ve farklı kalsiyum (Ca2 +)içeren çözeltiler ile belirlenmesine olanak sağlayacak, diğerleri arasında: maksimum kuvvet gelişimi, myofilament Ca2+duyarlılık (pCa50),cooperativity (nHill) ve kuvvet yeniden geliştirme oranı (ktr). Bu yöntem aynı zamanda doğrudan miyofilamentler üzerinde etkili olan ilaçların etkilerinin belirlenmesini ve eksojen rekombinant proteinlerin kardiyomiyositlerin hem aktif hem de pasif özellikleri üzerine ekspresyonunun belirlenmesini sağlar. Klinik olarak, derili kardiyomiyosit çalışmaları birçok miyokardiyal hastalığın patofizyolojisini vurgulamakta ve miyofilamentleri hedef alan terapötik müdahalelerin etkisinin in vitro değerlendirilmesi ne olanak sağlar. Bu teknik, açık kalp veya nakil cerrahisi sırasında elde edilen hayvan modellerinde in vitro ve in vivo parametreleri ile insan dokusu arasındaki korelasyonları araştırarak kardiyak patofizyolojinin açıklığa kavuşturulmasını sağlar.

Giriş

Geleneksel olarak, miyokardiyal mekanik özelliklerin değerlendirilmesi papiller kaslar ve trabekülae1,2gibi çok hücreli preparatlar, çoğunlukla denenmiştir. Çok hücreli kardiyak kas şeritler hücrelerin heterojen bir nüfus içerir, oryantasyon ve kuvvet üretimi bilinmeyen bir desen ile kontraktil kardiyomiyositler de dahil olmak üzere, elektriksel aktivite ve stres / gerinim dağılımları yanı sıra çevreleyen bağ dokusu matris3,4. Kollajen olmadan bir hazırlık ve tek bir kardiyomiyosit içeren çok hassas ve kontrollü bir şekilde sarcomere uzunluğu ve çapraz köprü kontraktil özellikleri ölçümü sağlayacak5,6. Bu nedenle, son kırk yılda, çeşitli metodolojiler tek bir kardiyomiyositmekanik,kontraktil ve gevşeme özellikleri incelenmesine izin geliştirilmiştir 6,7. Bu hücrelerin kontraktil fonksiyonu kuvvetle sarcomere uzunluğu ve çapraz köprü bisiklet kinetikbağlıdır 3. Bu nedenle, sarcomere uzunluğu ve performansının yanı sıra çapraz köprü fonksiyonu ve kontraktil özelliklerinin değerlendirilmesine olanak sağladığı düşünüldüğünde, kas fonksiyonunu doğrudan tek izole kalp hücrelerinde araştırmak istenir. Ancak, μN düzeyinde kuvvet ölçümü kayıt ederken makul bir optik sarcomere çözünürlüğü ile fonksiyonel kardiyomiyositlerin izole edilmesi ve takılması hala zorlu ve gelişmekte olan3,6. Diğer zorluklar, kardiyomiyositleri yeni toplanan biyopsilerden ayırmak için kurulması gereken lojistiktir. Örneğin, insan biyopsilerinin tahmin edilemezliği deneylerin fizibilitesini tehlikeye atabilir.

Ayrıca, bilimsel prosedürler (3R ilkeleri) için hayvan deneyleri Değiştirme, Azaltma ve Arıtma ile ilgili etik kaygılar hücresel ve doku düzeyinde çalışma değişiklikleri teşvik var, tercihen insan biyopsileri, ya da küçük hayvan örnekleri. Gerçekten de karmaşıklığı daha küçük bir düzeyde in vitro kardiyak fonksiyon değerlendirmek için metodolojilerin ilerici bir arıtma tüm vücuda sonuçların uygun entegrasyonu sağlar ve klinik senaryo7bunları çevirmek . Kardiyomiyosit leri çıkarmak için -80 °C'de saklanan numunelerin kullanılması cazip bir alternatif olabilir.

Miyokardiyal doku küçük parçalar halinde kesilir ve bir havan ve bir havaneli ile homojenize edilir. Bu homojenizasyon sonucu sarkolemal hasar değişen derecelerde derili paketlenmiş ve izole hücrelerin bir süspansiyon, miyoplazm banyo ortamına maruz ve tüm hücresel bileşenlerin yıkanır nerede. Sarkoliden daha uzaktaki miyofibriller gibi yapılar korunur. Böylece, sarcomere kısaltma ve miyofibrillar cihaz ile ilişkili fonksiyonel özellikleri bozulmadan tutulur ve 8kaydedilebilir,9.

Kardiyomiyosit kuvvet ölçüm sistemi, kardiyomiyosit uzunluğunu ayarlamak için kullanılan bir elektromanyetik motor ve izometrik kardiyomiyosit daralmasını ölçen bir kuvvet dönüştürücüden oluşur. Geçirimli veya derili kardiyomiyosit, rahatlatıcı bir solüsyon ([Ca2+] < 10 nM) içeren deneysel bir odaya yerleştirilir ve biri motora, diğeri de kuvvet transdüserine bağlı silikon lu 2 iğneye yapıştırılır. Kardiyomiyosit morfolojisi ve sarcomere uzunluğunu belirlemek için optik sistem kullanılır. Deneysel protokol genellikle farklı Ca2+ konsantrasyonları içeren tampon çözeltiler üzerine bir dizi kuvvet kaydı, aktin-miyozin çapraz köprü kinetiklerinin belirlenmesi ve önceden tanımlanmış sarcomere uzunluklarında atlı kardiyomiyositlerin pasif geriliminin ölçülmesinden oluşur(Şekil 1). Permeabilize kardiyomiyositlerin sıvı nitrojende dondurulmuş miyokardiyal numunelerden (ve daha sonra -80 °C'de depolanan) izolasyonu, kesit alanı başına maksimum Ca2+aktif (aktif) kuvveti (Taktif, kN-m-2), Ca2+-ölçümü için hücresel mekanik ve protein biyokimyası kullanan bir tekniktir. bağımsız(pasif)gerilim (T pasif , kN¡m-2), miyofilamentler Ca2+duyarlılık (pCa50),miyofilamentler cooperativity (nHill), kuvvet yeniden geliştirme oranı (ktr) yanı sıra Taktifsarcomere uzunluk bağımlılıkları , Tpasif, pCa50, nHill ve ktr.

Bu protokolün amacı, kardiyomiyosit kuvvet ölçüm sisteminin potansiyelini, farklı türlerden gelen dondurulmuş numunelerden izole edilmiş tek derili kardiyomiyositlerin fonksiyonel mekanik özelliklerini değerlendirmek için güvenilir bir prosedür olarak göstermek ve özetlemektir.

Protokol

Tüm hayvan deneyleri Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu (NIH Yayın no. 85-23, revize 2011) ve Portekiz hayvan refahı yasasına (DL 129/92, DL 197/96; P 1131/97). Yetkili yerel makamlar bu deneysel protokolü onayladılar (018833).

1. Stok çözeltisi hazırlama (Tablo 1)

  1. Tablo 2'dekitalimatları izleyerek kardiyomiyositlerin izolasyonu (RELAX-ISO) için 1.000 mL rahatlatıcı çözelti hazırlayın. Yukarıdaki reaktifi ≈500 mL olarak eritin ve koh ile pH'ı 7.0'a ayarlayın. Son hacmi 1000 mL'ye ayarlayın.
    1. RELAX-ISO'yi 50 mL tüplerhalinde dağıtın. -20 °C'de saklayın.
  2. Tablo 3'tekiyönergeleri izleyerek 250 mL etkinleştirme çözeltisi hazırlayın. Yukarıdaki reaktifleri 100 mL ≈ ultra saf suda çözün. 15 °C'de 5 M KOH ile pH'ı 7,1'e ayarlayın.
    NOT: Genellikle istenilen pH'a ulaşmak için önemli miktarda KOH eklemek gerekir. Çözeltiyi 15 °C'ye kadar soğutmak için hacimbaliyi buzlu bir kutuya koyun.
    1. Son hacmi 250 mL'ye ayarlayın. Bu çözeltiyi rahatlatıcı çözeltiile karıştırma anına kadar manyetik karıştırıcı ile sürekli olarak karıştırın.
  3. Tablo 4'tekitalimatları izleyerek 100 mL rahatlatıcı çözelti hazırlayın. Yukarıdaki reaktifleri 50 mL ≈ ultra saf suda çözün. 15 °C'de KOH 5 M ile pH'ı 7,1'e ayarlayın.
    NOT: Genellikle, 7.1 bir pH ulaşmak için KOH önemli miktarda eklemek için gereklidir. Çözeltiyi 15 °C'ye kadar soğutmak için hacimbaliyi buz dolu bir kutuya yerleştirin. Ölçümler sırasında kullanılan çözeltilerin iyonik mukavemeti 180 mM olarak hesaplandı.
    1. Son hacmi 100 mL'ye ayarlayın. Bu çözeltiyi aktive solüsyonu yla karıştırma anına kadar manyetik karıştırıcı ile sürekli olarak karıştırın.
  4. 5.0 ile 6.0 arasında pCa çözeltisi elde etmek için Tablo 5'te sunulan oranlarda etkinleştirme ve rahatlatıcı çözümleri karıştırın.
    1. Her ikisini de karıştırırken her zaman rahatlatıcı ve aktive edici çözümler tutun.
    2. Aliquot her karışımı 2 mL mikrotüpler için. Tüm mikrotüpleri -20 °C'de saklayın.
  5. Her protokol için farklı bir pCa çözeltisi (4,5 ila 6,0) hazırlayın.

2. Kuvvet transdüserinin kalibrasyonu

NOT: Kuvvet dönüştürücüsünün kalibrasyonu, birkaç ayda bir veya kalibre edilmemiş olduğundan şüphelenilen rutin bir işlemdir. Kuvvet dönüştürücüsi son derece hassastır ve kolayca kırılır. Kalibrasyon, kardiyomiyosit yapıştırma ve temizlik dahil olmak üzere kullanımının her aşamasında nazikçe ele alınmalıdır.

  1. Kuvvet dönüştürücüsünün diğer cihazdan ayrılması.
  2. Bir kelepçe yardımıyla, kuvvet transdüserini yatay olarak, iğnenin aşağıya doğru, kardiyomiyositin kuvvet geliştireceği yöne doğru işaret edecek şekilde yerleştirin. Bu bilinen ağırlıkları (elastik bant, dikiş veya pin) ile kitlelerin bir dizi asılı kolaylaştıracaktır.
    NOT: Ölçek faktörünün [mg/volt] kontrol etmek ve transdüser üzerinde aşırı ağırlıktan kaçınmak için bu adıma geçmeden önce kuvvet transdüserinin özelliklerini kontrol edin. Kuvvet transdüser modeli için, ölçek faktörü 50 (50 mg 1 volta karşılık gelir) ve biz 12.5 ve 250 mg arasında 5 ağırlıkkullanın.
  3. Kuvvet dönüştürücü açın ve 30 dakika boyunca ısınmaya bırakın.
  4. Kuvvet transdüserinin üzerine daha hafif kütleyi asarak ve FORCE OUT'ta ölçülen ilgili voltajı kaydederek başlayın.
    1. Bu yordamı en fazla beş ağırlık için tekrarlayın.
  5. Kuvvet transdüserine (yük) uygulanan çizim kuvveti gerilime karşı ve doğrusalolup olup olup olduğunu kontrol edin.
  6. Doğrusallık yoksa, sıfırı ayarlayın ve transdüserin devre kartında potansiyometre kazanın. Daha fazla bilgi için kendi özel yönergesini kontrol edin.
    1. Çıkış gerilimi 0,0 V okuyana kadar sıfır potansiyometreyi çevirin.
    2. Transdüser iğneüzerinde orta ağırlık tave ilgili voltajı okumak için kazanç potansiyometresini ayarlayın (örneğin, 50 mg 1 V'e karşılık gelir). Ağırlığı çıkarın ve sıfır potansiyometresini 0,0'a yeniden ayarlayın.
    3. 2.6.2 adımını ağırlıklı ve ağırlıksız çıkış doğru olana kadar tekrarlayın.
  7. Kuvvet dönüştürücüsi aparata geri monte edin.

3. Deneysel aparatın ayarlanması

  1. Aktive edici, 4.5, 5.0, 5.2, 5.4, 5.6, 5.8, 6.0 ve rahatlatıcı çözeltilerin her birinin bir şişesini eritin ve buzüzerinde saklayın.
    NOT: ATP ve PCr soğuk sıcaklıklarda muhafaza edilmesi gereken labile bileşiklerdir.
  2. Mikroskobu, test cihazlarını ve ilgili bilgisayarı kullanıma hazırlayın (Şekil 1).
  3. Sıcaklığı, oda içi termometrenin 15 °C'yi okuyuyacak şekilde ayarlayın. Kiaz ve fosfataz kuluçkaları (20 °C) dışında tüm deneyleri bu sıcaklıkta gerçekleştirin.
  4. Kuvvet dönüştürücüve motoru açın.

4. Derili kardiyomiyositlerin çıkarılması ve permeabilizasyonu

  1. RELAX-ISO çözeltisinin 50 mL'lik buzunu çözün.
  2. Santrifüju açın ve 4 °C'ye kadar hızlı bir şekilde soğutun.
  3. 2,5 mL RELAX-ISO çözeltisi içeren petri kabında 3-5 μg miyokardiyal numunenin çözülmesi.
  4. Bir neşter bıçak(Şekil 2)ile küçük parçalar halinde doku kesin. Gereksiz hücre hasarını önlemek için numuneyi kesin bir şekilde kesin olarak kesin olarak kesin.
  5. Relax-ISO çözeltisinin 2,5 mL'lik kısmını, kesilmiş pipet ucu kullanarak bir Potter-Elvehjem camına aktarın.
  6. Mekanik 30-40 rpm bir dönüş hızında bir öğütücü ile doku bozabilir. Iyi bir hücre süspansiyonu elde etmek için 2'şer s'lik için 3 kez dokuya basın.
  7. RELAX-ISO çözeltisinde Triton (250 μL Triton, 2,25 mL RELAX-ISO) 15 mL'lik bir tüpte hazırlayın ve bu çözümü hücre süspansiyonuna ekleyin.
  8. Tüpü 3 kez ters çevirerek hafifçe karıştırın.
  9. 1 dk ve buz üzerinde 4 dakika oda sıcaklığında kuluçka.
  10. 15 mL'lik tüpün tepesine RELAX-ISO ekleyerek Triton'u yıkayın; yavaşça karıştırma (tüpün 3 katı ters çevirme) ve son olarak hücreleri açılı bir santrifüjde (348 x g'de1 dk) aşağı doğru döndürür. Hücre peletinin üzerinde 3 mL'ye kadar süpernatantı çıkarın.
    NOT: Hücre peletini rahatsız etmemek için süpernatant'ı hafifçe çıkarın. Yine de, supernatant bazı hücreler kaçınılmaz olarak kaybolur.
  11. Adım 4.10'u en az 4 kez veya Triton artıkları tarafından üretilen kabarcıklar gözlenenekadar tekrarlayın.
    NOT: Daha fazla yıkama adımları yapılır, daha fazla hücre atılır supernatant ile kaybolur.
  12. Son yıkamada, 5-10 mL hücre süspansiyonuna kadar süpernatantı çıkarın.

5. Derili kardiyomiyositseçimi ve yapıştırma

  1. Mikroskop kaydırağı tutucusundaki cam bir kaydıranın üzerine bir kapak kapağına hücre süspansiyonu damlası koyun (Şekil 1).
  2. İyi bir striation desen ve boyutu ile tek bir çubuk şeklinde kardiyomiyosit seçin(Şekil 2).
  3. Ters mikroskobun en düşük büyütmesini kullanarak kuvvet dönüştürücünün ve motorun iğne uçlarını bulun.
  4. Kapak kaymasını seçili kardiyomiyositi yatay olarak konumlandıracak şekilde döndürün, böylece uçları kuvvet transdüserinin ve motorun iğnesiyle hizalanır(Şekil 2).
  5. Bir bez ucu yardımı ile kapak kapağının yan tarafına ince bir tutkal hattı yerleştirin(Şekil 2).
  6. Her iki uç etrafında bir tutkal hale oluşturmak için kuvvet transdüser ve motor tutkal hattı içine iğne uçları batırın.
    NOT: 5.6 - 5.10 adımları motorlu mikropozisyonerlerin dikkatli kullanımı ile gerçekleştirilir.
  7. İğne uçlarını kardiyomiyositin odak düzlemine yakın bir şekilde hareket ettirin.
  8. Kuvvet transdüserinin iğne ucunu aşağı doğru hareket ettirin, böylece kardiyomiyositin bir kenarına yapıştırın.
  9. Motorucu ucu ve hücrenin diğer ekstremite ile bu işlemi tekrarlayın.
    NOT: Tutkal çok hızlı kür başlar gibi bu işlem az 2-3 dakika sürmelidir.
  10. 5-8 dk sonra, hücreyi kapak kaymasına yapıştırmaktan kaçınmak için iğneleri ≈ 15 μm kaldırın. Bu aynı anda her iki mikromanipülörler yukarı hareket ederek yapılır.
  11. Tutkal tedavi etsin. Bu işlem tutkal türüne bağlı olarak 15 ila 45 dakika sürebilir. Bizim durumumuzda, kardiyomiyosit yeterli 15 dakika ≈ sonra yapıştırılmış.

6. Aktif, pasif ve Ca2+ hassasiyetinin kayıt kuvveti ölçümleri

  1. İlk deneysel kuyuyu rahatlatıcı solüsyon (deneysel cihazda 55-100 μL) ve ikinci deneysel kuyuyu da etkinleştirme solüsyonu ile doldurun.
  2. Kamera yazılımını kullanarak, ilgi alanını (ROI) kardiyomiyositin açık bir striasyon deseni ile bir alana yerleştirin.
    NOT: Kardiyak miyositlerde ameliyat sarcomere uzunluğu 1,8 ile 2,2 μm arasında değişir ve optimal sarcomere uzunluğu 2,15 μm civarındadır.
  3. Optimal sarcomere uzunluğu ayarlandıktan sonra kardiyomiyositin iki uç noktası arasındaki mesafeyi (motordan transdüser tutkal halesine, Şekil 3)ölçün (2,2 μm). Değeri yazılımdaki miyosit uzunluğu olarak kaydedin.
  4. Ölçü kardiyomiyosit genişliği ve derinliği, hücreye dik yerleştirilen bir prizma ayna yardımı ile ikinci.
    NOT: Prizma yoluyla hücreyi görselleştirmek için güçlü, harici bir ışık kaynağı gerekir. Prizma olmaması ve kardiyak hücrelerin eliptik bir şekle sahip olduğu varsayılsa kardiyomiyosit derinliği kardiyomiyosit genişliğinin p'i olarak çıkarılabilir.
  5. Kardiyomiyositin eliptik bir şeklini varsayarak kesit alanını (CSA, mm2)hesaplayın.
    figure-protocol-1
  6. Mikroskop aşamasını yavaşça hareket ettirin, böylece hücre kapak kaymasından sahne nin arkasında rahatlatıcı bir çözüm içeren kuyuya hareket eder.
    NOT: Bu yordam hücreye kolayca zarar verebilir. Hücreyi hareket ettirmeden önce iğneleri hafifçe biraz daha yukarı doğru hareket ettirin. Hücreyi çözeltiden çıkarmaktan kaçının.
  7. Hücre Ca2+











Sonuçlar

Fonksiyonel permeabilize kardiyomiyositler tüm deney boyunca düzgün ve tutarlı bir striation desen ile görünmelidir. Uzun süren deneylerden sonra belli bir derecede bozulma ve kuvvet azalması beklenmese de, aktif gerilim değerleri nispeten sabit olmalıdır. Belirgin striasyon kaybı veya önemli kuvvet azalması belirtileri gösteren hücreler (< 15 kN-m-2

figure-results-1

figure-results-2

figure-results-3

figure-results-4

figure-results-5

figure-results-6

figure-results-7

figure-results-8



Tartışma

Derili kardiyomiyositler kullanılarak kardiyak fonksiyonun in vitro değerlendirilmesi, fizyolojik (örn. esneme) ve patolojik bağlamda (örneğin, iskemi) kardiyomiyosit düzeyinde meydana gelen değişiklikleri açıklığa kavuşturmak için önemli bir tekniği temsil eder. Bu metodoloji, çözülmüş numunelerden elde edilen kardiyomiyositlerde fonksiyonu değerlendirmek için az miktarda miyokard igerektirecek gibi çeşitli avantajları vardır; türlerin geniş bir yelpazede kardiyomiyositler kullanarak (fareler13, sıçan1,14,15, tavşan16, domuz17, köpek18, kobay19 ve insan20) ve farklı kardiyak yerler, atria dahil, sol ve sağ ventriküller veya enfarktüs kalp belirli bir bölge. Ayrıca, bu teknik, kendi doğal yapılandırmasında düzenleyici ve kontraktil yapıların işlevini ölçerken Ca2 + ve enerji (ATP) belirli konsantrasyonları teslim sağlar.

Bu tekniğin basitliğine rağmen, bazı kritik adımlar vardır. Örnek toplama da dahil olmak üzere, başlangıçtan itibaren her adımın kalitesini garanti etmek esastır. Miyofilament proteinleri proteazlara duyarlıdır21. Bu nedenle numuneleri alındıktan hemen sonra sıvı nitrojende depolamak zorunludur. Daha önce dondurulmamış olan taze numuneler önemli ölçüde daha yüksek kuvvetler geliştirecektir, bu nedenle taze ve dondurulmuş numunelerde yapılan ölçümlerin aynı protokolde karıştırılması tavsiye edilmez. İkinci en kritik adım kardiyomiyositlerin çıkarılmasıdır. Bu işlem sırasında, çoğu zaman buz üzerinde örnek tutmak için çok önemlidir. Bir proteaz inhibitör kokteyl ekstraksiyon / permeabilizasyon sırasında protein bozulması riskini azaltmak için kullanılabilir22. Üçüncü olarak, bu adım göz ardı edildiğinde düşük kaliteli kardiyomiyositler belirttiğimiz için, numuneler hassas neşter hareketleri kullanılarak daha küçük parçalar halinde kesilmelidir. Triton yıkama arasında doğru dengeye sahip zor olduğu için başka bir kritik adım kardiyomiyosit yıkama olduğunu (hücre permeabilize ama ungluing teşvik) ve supernatant mümkün olduğunca çok sayıda hücre tutmak. Öncelikle her örnek, tür veya protokol için ekstraksiyon ve yıkama sayısını denemek önemlidir. Örneğin, elimizde, biz ZSF1 obez sıçan dokusu çıkarmalar yapıştırma sırasında bu hücreleri daha kaygan ama ölçmek için daha zor değil yapılan bir "yağlı" yönü olduğunu kaydetti. Bu sorunu aşmanın yolu, hayvan başına makul sayıda hücreye sahip olmak için daha fazla deney yapmaktı. Ayrıca, tutkal için iyi bir hücre seçmek için çok önemlidir, yani iyi bir striation ve makul uzunluğu ile. Kardiyomiyosit bu özelliklere sahip değilse, çoğunlukla iğne uçlarından kopacak veya no/düşük kuvvet geliştirecektir. Ayrıca kardiyomiyosit eki için doğru tutkal kullanmak önemlidir, yapıştırma zamanı ve iğne hücre yapıştırmak için etkinliğini göz önünde bulundurularak. Elimizde, silikon tutkal(Malzeme Tablosu)hızlı (10-15 dk) ve yeterince güçlü tedavileri. Son olarak, son kritik adım dikkatle hücre yapıştırma sonra kardiyomiyosit 5 dk kaldırma ile ilgilidir (coverslip hücre yapıştırma önlemek için) ve kuyulara taşımadan önce (mikroskop aşaması tarafından sürüklenen hücre önlemek için). Tablo 7, bu teknikle ilişkili sorun giderme olayını, altta yatan nedenleri ve sık karşılaşılan sorunların üstesinden gelmek için olası çözümleri özetler.

Bu yöntemin en önemli sınırlaması, miyofilament kontraktürünün ne kadar hızlı aktivhale/devre dışı bırakılamadığı gibi tüm soruları yanıtlayamamasıdır. In vivo ayarında, membran depolarizasyonu, hücre içi Ca2+ artışı ve miyofilamentlere difüzyonunun miyositlerin kasılması için gerçekleşmesi gerekirken, derili kardiyomiyositlerde Ca2+ miyofilamentlere difüzyon hücre Ca2+ çözeltisine batırıldığında hemen gerçekleşir. Ca2 + difüzyon Bu hızlı oranı aktivasyon / deaktivasyon analizi23miyofilamentler önyargı olacaktır.

Bu deneyler sıcaklık, çözelti pH, mekanik pertürbasyon (bolluk-re-stretch vs bolluk) ve hücre eki prosedürleri (pin kravat vs tutkal), tüm bu değişkenlerin ktr vekuvvetsarcomere uzunluğuna bağlı artış açısından literatür farklılıkları için muhasebe dahil olmak üzere farklı faktörler, etkilenir 4,12.

Tekniğin gelecekteki ilerlemesi, permeabilize kardiyomiyositler yerine sağlam fonksiyonel çalışmalar yapmayı içerir. Bu teknik kardiyomiyositler taze izole (daha önce dondurulmuş değil) güvenme dezavantajı vardır. Doğrudan bu metodoloji ile ilgili olmayan bir diğer önemli konu, ancak önemli ölçüde etkileyebilecek örnek dondurulmuş depolama maksimal dönemi ile ilgilidir. Özellikle, depo süresi boyunca miyofilament bozulma derecesini belirlemek zorunludur (yani, çıkarılan kardiyomiyositlerden elde edilen kaliteli fonksiyonel verileri sağlamak için dondurulmuş numunelerin ne kadar süreyle depolanabileceği).

Açıklamalar

Yazarların çıkar çatışması yok.

Teşekkürler

Yazarlar Portekiz Bilim ve Teknoloji Vakfı (FCT), Avrupa Birliği, Quadro de Referência Estratégico Nacional (QREN), Fundo Europeu de Desenvolvimento Regional (FEDER) ve Programa Operacional Factores de Competitividade'ye (COMPETE) UnIC (UID/IC/00051/2013) araştırma birimini finanse ettiği için teşekkür ediyor. Bu proje FEDER tarafından COMPETE 2020 - Programa Operacional Competitividade E Internacionalização (POCI), DocNET (NORTE-01-0145-FEDER-000003), Norte Portugal bölgesel operasyonel programı (NORTE 2020) tarafından desteklenen, Portekiz 2020 ortaklık anlaşması kapsamında desteklenmiştir, Avrupa Bölgesel Kalkınma Fonu (ERDF), PROJE NETDIAMOND (POCI-01-0145-FEDER-016385), Avrupa Yapısal Ve Yatırım Fonları, Lizbon bölgesel operasyonel programı 2020 tarafından desteklenen. Patrícia Rodrigues FCT (SFRH/BD/96026/2013) ve João Almeida-Coelho tarafından finanse edildi Universidade do Porto/FMUP ve FSE-Fundo Social Europeu, NORTE 2020-Programa Operacional Regional do Norte, (NORTE-08-5369-FSE-000024-Programas Doutorais).

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
AsetonSigma34580
Adenozin 5'-trifosfat disodyum tuzu hidrat (Na2ATP)SigmaA2383
Kalsiyum karbonat (CaCO3)Merck1.02067.0500
İmidazolVWR24720.157
Magnezyum klorür hekzahidrat (MgCl2.6H2O)Merck1.05833.0250
Magnezyum klorür çözeltisi (MgCl2 1M)SigmaM1028
N, N-Bis (2-hidroksietil) taurin (BES)SigmaB9879
Fosfokreatin dissodyum tuzu hidrat (Na2PCr)SigmaP7936
Potasyum klorür (KCl)Merck1.04936.1000
Potasyum hidroksit (KOH)Merck8.14353.1000
Propiyonik asit (C3H6O2)Merck8.00605.0500
Silikon Sıkma TüpüMarineland31003
Tritiplex (EGTA)Merck1.08435.0025
Triton & reg; X-100 %10Merck648463
Doku homojenleştirici (GKH GT Motor Kontrolü)Terre Haute Glas-col
Uzunluk Kontrol Cihazı (Model 315C-I)Aurora Bilimsel
Kuvvet Dönüştürücü (Model 403 A)Aurora Scientific
Software ASI 600AAurora Scientific
Sotware VSL (Model 900B)Aurora Bilimsel Ters
Mikroskop (IX51)Olympus

Kaynaklar

  1. Leite-Moreira, A. M., et al. Stretch-induced compliance: a novel adaptive biological mechanism following acute cardiac load. Cardiovascular Research. 114 (5), 656-667 (2018).
  2. Falcao-Pires, I., Fontes-Sousa, A. P., Lopes-Conceicao, L., Bras-Silva, C., Leite-Moreira, A. F. Modulation of myocardial stiffness by β-adrenergic stimulation - its role in normal and failing heart. Physiological Research. 60 (4), 599-609 (2011).
  3. Cokkinos, D. V. Introduction to Translational Cardiovascular Research. , Springer International Publishing. 371-387 (2015).
  4. van der Velden, J., Stienen, G. J. M. Cardiac Disorders and Pathophysiology of Sarcomeric Proteins. Physiological Reviews. 99 (1), 381-426 (2019).
  5. Garnier, D. Attachment procedures for mechanical manipulation of isolated cardiac myocytes: a challenge. Cardiovascular Research. 28 (12), 1758-1764 (1994).
  6. Brady, A. J. Mechanical properties of isolated cardiac myocytes. Physiological Reviews. 71 (2), 413-428 (1991).
  7. Falcao-Pires, I., Leite-Moreira, A. F. Chapter 20. Introduction to Translational Cardiovascular Research. Cokkinos, D. V. 20, Springer, Cham. 371-387 (2015).
  8. Liang, W. Teaching calcium-induced calcium release in cardiomyocytes using a classic paper by Fabiato. Advances Physiology Education. 32 (1), 1-10 (2008).
  9. Roche, S. M., Gumucio, J. P., Brooks, S. V., Mendias, C. L., Claflin, D. R. Measurement of Maximum Isometric Force Generated by Permeabilized Skeletal Muscle Fibers. Journal of Visualized Experiments. (100), e52695(2015).
  10. Huxley, A. F. Muscle structure and theories of contraction. Progress Biophysics and Biophysical Chemistry. 7, 255-318 (1957).
  11. Sequeira, V., et al. Synergistic role of ADP and Ca(2+) in diastolic myocardial stiffness. Journal Physiology. 593 (17), 3899-3916 (2015).
  12. Edes, I. F., et al. Rate of tension redevelopment is not modulated by sarcomere length in permeabilized human, murine, and porcine cardiomyocytes. American Journal Physiology Regulatory Integrative Comparative Physiology. 293 (1), R20-R29 (2007).
  13. King, N. M., et al. Mouse intact cardiac myocyte mechanics: cross-bridge and titin-based stress in unactivated cells. Journal General Physiology. 137 (1), 81-91 (2011).
  14. Hamdani, N., et al. Myocardial titin hypophosphorylation importantly contributes to heart failure with preserved ejection fraction in a rat metabolic risk model. Circulation Heart Failure. 6 (6), 1239-1249 (2013).
  15. Miranda-Silva, D., et al. Characterization of biventricular alterations in myocardial (reverse) remodelling in aortic banding-induced chronic pressure overload. Scientific Reports. 9 (1), 2956(2019).
  16. Rodrigues, P. G., et al. Early myocardial changes induced by doxorubicin in the nonfailing dilated ventricle. American Journal Physiology Heart Circulatory Physiology. 316 (3), H459-H475 (2019).
  17. van der Velden, J., et al. Alterations in myofilament function contribute to left ventricular dysfunction in pigs early after myocardial infarction. Circulation Research. 95 (11), e85-e95 (2004).
  18. Wakili, R., et al. Multiple potential molecular contributors to atrial hypocontractility caused by atrial tachycardia remodeling in dogs. Circulation: Arrhythmia Electrophysiology. 3 (5), 530-541 (2010).
  19. Ait Mou, Y., le Guennec, J. Y., Mosca, E., de Tombe, P. P., Cazorla, O. Differential contribution of cardiac sarcomeric proteins in the myofibrillar force response to stretch. Pflugers Archiv. 457 (1), 25-36 (2008).
  20. Falcao-Pires, I., et al. Diabetes mellitus worsens diastolic left ventricular dysfunction in aortic stenosis through altered myocardial structure and cardiomyocyte stiffness. Circulation. 124 (10), 1151-1159 (2011).
  21. Lim, C. C., et al. Anthracyclines induce calpain-dependent titin proteolysis and necrosis in cardiomyocytes. Journal Biology Chemistry. 279 (9), 8290-8299 (2004).
  22. Woulfe, K. C., et al. A Novel Method of Isolating Myofibrils From Primary Cardiomyocyte Culture Suitable for Myofibril Mechanical Study. Frontiers Cardiovascular Medicine. 6, 12(2019).
  23. Ait Mou, Y., Bollensdorff, C., Cazorla, O., Magdi, Y., de Tombe, P. P. Exploring cardiac biophysical properties. Global Cardiology Science Practice. 2015, 10(2015).

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Kardiyak Fonksiyon De erlendirmesiMiyofilaman FonksiyonuKalsiyum Duyarl lKuvvet l mKardiyomiyosit zolasyonuPermeabilize Edilmi H crelerTriton UygulamasKuvvet TransduseriSarkomer Uzunlu u
Derili Kardiyomiyositler Kullanarak Kardiyak Fonksiyonun İn Vitro Değerlendirilmesi
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.