Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Yumurtalık Kanseri Dokularından Mitokondri Hazırlanması ve Kantitatif Proteomik Analizi Için Yumurtalık Dokularının Kontrolü

5.4K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/60435

⸱

18 Kasım 2019

 ,  ,  ,  , 
1Key Laboratory of Cancer Proteomics of Chinese Ministry of Health, Xiangya Hospital, Central South University, 2Hunan Engineering Laboratory for Structural Biology and Drug Design, Xiangya Hospital, Central South University, 3State Local Joint Engineering Laboratory for Anticancer Drugs, Xiangya Hospital, Central South University, 4National Clinical Research Center for Geriatric Disorders, Xiangya Hospital, Central South University, 5Department of Obstetrics and Gynecology, Xiangya Hospital, Central South University

Bu makalede

Özet

Bu makalede, insan yumurtalık kanseri dokularından mitokondriyi ayırmak ve kantitatif proteomik analiziçin yumurtalık dokularını kontrol etmek için yoğunluk gradyan santrifüj santrifüjü ile birlikte diferansiyel hız santrifüjü protokolü sunmaktadır. bir insan yumurtalık kanseri mitokondriyal proteom yüksek kaliteli mitokondriyal örnek ve yüksek üretim ve yüksek tekrarlanabilirlik kantitatif proteomik analizi ile sonuçlanan.

Özet

Yumurtalık kanseri yüksek mortalite ama belirsiz moleküler mekanizma ile ortak bir jinekolojik kanserdir. Çoğu yumurtalık kanseri ileri evrede teşhis edilir, hangi ciddi tedavi engellenir. Mitokondriyal değişiklikler insan yumurtalık kanserlerinin bir özelliğidir, ve mitokondri enerji metabolizması merkezleri, hücre sinyalizasyonu, ve oksidatif stres. Yumurtalık kanserlerinde mitokondriyal proteom değişiklikleri içine derinlemesine anlayışlar yumurtalık kanseri moleküler mekanizmalarıderinlez anlaşılması yarar sağlayacaktır, ve etkili ve güvenilir biyobelirteçleri ve terapötik hedeflerin keşfi. İnsan yumurtalık kanserini analiz etmek ve mitokondriyal proteomları kontrol etmek için göreceli ve mutlak nicel (iTRAQ) kantitatif proteomikler için bir isobarik etiketle birleşen etkili bir mitokondriyal preparat yöntemi sunulmuştur. diferansiyel hızlı santrifüj, yoğunluk gradyan santrifüj, mitokondriyal örneklerin kalite değerlendirmesi, tripsin ile protein sindirimi, iTRAQ etiketleme, güçlü katyon değişimi fraksiyonasyonu (SCX), sıvı kromatografi (LC), tandem kütle spektrometresi (MS/ MS), veritabanı analizi ve mitokondriyal proteinlerin kantitatif analizi. Birçok protein başarıyla insan yumurtalık kanseri mitokondriyal proteom kapsama maksimize etmek ve insan yumurtalık kanserlerinde farklı ifade mitokondriyal protein profili elde etmek için tespit edilmiştir.

Giriş

Yumurtalık kanseri yüksek mortalite ama belirsiz moleküler mekanizma ile ortak bir jinekolojikkanserdir 1,2. Yumurtalık kanserlerinin çoğu ileri evrede teşhis edilir, hangi ciddi tedavi engellenir. Mitokondriyal değişiklikler insan yumurtalık kanserlerinin bir özelliği, ve mitokondri enerji metabolizması merkezleri, hücre sinyal, ve oksidatif stres3,4,5,6,7. Yumurtalık kanserlerinde mitokondriyal proteom değişiklikleri içine derinlemesine anlayışlar yumurtalık kanseri moleküler mekanizmalarıderinlez anlaşılması yarar sağlayacaktır, ve etkili ve güvenilir biyobelirteçleri ve terapötik hedeflerin keşfi. Mitokondriyal metabolizma önerilmiştir ve kanser tedavisi için bir hedef olarak kabul, ve antimitokondriyal tedavi sonuçta kanser nüks ve metastaz önlemek için çok yararlı olabilir8. Bireysel metabolik profilleme de zaten kanser tabakalaşma ve tahmin stratejileriiçinyararlı bir araç olarak uygulanmış 9,10.

Bu araştırmanın uzun vadeli amacı, yumurtalık kanseri ve kontrol yumurtalık dokuları arasındaki mitokondriyal proteom değişikliklerinin açıklanması için yumurtalık kanserini incelemek için kantitatif mitokondriyal proteomik bir yöntem geliştirmek ve kullanmaktır. ve sistematik multi-omics açı11moleküler ağ değişiklikleri11 ,12, yumurtalık kanseri moleküler mekanizmalarının açıklanması için mitokondri hedefli moleküler biyobelirteçlerin keşfi neden olacak13, tahmin ve yumurtalık kanseri hastalarının kişiselleştirilmiş tedavi. Bağıl ve mutlak nicelik (iTRAQ) etiketleme için İzobarik etiketler3,4 mitokondriyal protein değişikliklerini ölçmek için etkili bir yöntemdir. İnsan yumurtalık kanseri ve kontrol yumurtalık dokularından yüksek kaliteli mitokondriyal örneklerin hazırlanması mitokondriyal proteomların iTRAQ kantitatif analizi için ön koşuldur3. Mitokondriyal hazırlık iTRAQ kantitatif proteomik ile birleştiğinde başarıyla insan yumurtalık kanseri mitokondriyal proteom hakkında uzun vadeli araştırma programlarında kullanılmıştır, mitokondriyal proteom referans haritaları kurulması da dahil olmak üzere3, diferansiyel ifade mitokondriyal profilleranalizi 4,14 ve post-çevirial değişiklikler, zaten önemli bir keşif sinyali ile sonuçlandı insan yumurtalık kanserlerinde ağ değişiklikleri5, enerji metabolizmasında değişiklikler de dahil olmak üzere4, lipid metabolizması, ve mitophagy yol sistemleri3.

Önceki çalışmalarda yoğunluk gradyan santrifüj santrifüj ile birlikte diferansiyel hız santrifüj insan yumurtalık kanseri ve kontrol yumurtalık dokularından mitokondri izole etmek ve arındırmak için etkili bir yöntem olduğunu bulduk3,4,5,14. Güçlü katyon değişimi (SCX)-sıvı kromatografisi (LC)-tandem kütle spektrometresi (MS/MS) ile birleşen iTRAQ etiketleme, hazırlanan mitokondriyal örneklerdeki proteinleri tespit etmek, tanımlamak ve ölçmek için anahtar tekniktir.

Burada iTRAQ kantitatif proteomikleri ile birleşen mitokondriyal hazırlık için ayrıntılı protokoller açıklanmıştır. Bu başarıyla insan yumurtalık kanseri doku mitokondriyal proteomların analizinde kullanılmıştır. Protokoller, numunelerin hazırlanması, diferansiyel hız santrifüjü, yoğunluk gradyan santrifüjü, mitokondriyal örneklerin kalite değerlendirmesi, tripsin ile protein sindirimi, iTRAQ etiketleme, SCX fraksiyonasyonu, LC, MS/MS, veritabanı aramave mitokondriyal proteinlerin kantitatif analizini içerir. Ayrıca, bu protokol kolayca diğer insan doku mitokondriyal proteomanaliz çevirir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Bu protokol de dahil olmak üzere yumurtalık kanseri dokuları (n = 7) ve normal kontrol yumurtalık dokuları (n = 11) içeren yumurtalık dokusu örnekleri kullanıldı. Mevcut protokol3,4,5 Xiangya Hastanesi Tıbbi Etik Komitesi Merkezi Güney Üniversitesi, Çin tarafından onaylanmıştır.

1. İnsan yumurtalık kanseri dokularından mitokondri hazırlanması

  1. 210 mM mannitol, 70 mM sakaroz, 100 mM potasyum klorür (KCl), 50 mM Tris-HCl, 1 mM diamin tetraasetik asit (EDTA), 0,1 mM etilen glikol bis(2-etil eter)tetratik asit (EA), masase, 70 mM sakaroz karıştırılarak mitokondriyal izolasyon tamponunun 250 mL'sini hazırlayın fenilmesulfonil florür (PMSF) proteaz inhibitörü, 2 mM sodyum ortamazat (V) ve %0.2 büyükbaş hayvan serum albumini (BSA), pH 7.4.
  2. Temiz bir cam çanak yumurtalık kanseri dokularının ~ 1.5 g yerleştirin.
  3. Doku yüzeyinden 3x kan hafifçe yıkamak için önceden soğutulmuş mitokondriyal izolasyon tampon 2 mL ekleyin.
  4. Yaklaşık 1 mm3 adet dokuyu tamamen kıymak için temiz oftalmik makas kullanın ve kıymalı dokuları 50 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın.
  5. 0,2 mg/mL nagarse içeren 13,5 mL mitokondriyal izolasyon tamponu ekleyin ve sonra kıyma dokuları (2 dk, 4 °C) homojenleştirmek için elektrikli bir homojener kullanın (kullanım ölçeği 2, 10 s 6x, aralık 10 s)
  6. Doku homojenates içine mitokondriyal izolasyon tampon başka 3 mL ekleyin ve pipetleme tarafından iyice karıştırın.
  7. Hazırlanan doku homojen (1.300 x g,10 dk, 4 °C) santrifüj. Ham nükleer fraksiyonu çıkarın (yani, pelet) ve supernatant tutun.
  8. Recentrifuge supernatant (10.000 x g, 10 dk, 4 °C). Mikrozomları çıkarın (yani, supernatant) ve pelet tutun.
  9. 2 mL mitokondriyal izolasyon tamponu ekleyin ve hafif pipetleme ile peleti iyice askıya alın.
  10. Pelet süspansiyonuna santrifüj (7.000 x g,10 dk, 4 °C). Supernatant atın ve ham mitokondri (yani, pelet) tutmak.
  11. Çıkarılan ham mitokondriyi yeniden askıya almak için %25 yoğunluk gradyan ortamının (yani Nycodenz) 12 mL'sini ekleyin.
  12. Bir tüpü %34 5 mL, %30'luk 8 mL, %25'lik 12 mL (1.11 adımdan itibaren ham mitokondriyi içeren), %23'lük 8 mL ve %20 yoğunlukgradient orta 3 mL ile alttan yukarıdoğru bir tüp doldurarak kesintisiz bir yoğunluk degradesi yapın ve (52.000 x g, 90 min, 4 C) yapın.
  13. Temiz bir tüp içine% 25 ve% 30 yoğunluk gradyan orta arasında arayüz saflaştırılmış mitokondri toplamak için uzun ve künt bir şırınga kullanın.
  14. Toplanan mitokondri içine mitokondriyal izolasyon tampon ekleyin üç kat hacimde seyreltmek için. Santrifüj (15.000 x g, 20 dk, 4 °C) ve supernatant atın.
  15. Peleti yeniden askıya almak için 2 mL mitokondriyal izolasyon tamponu ekleyin ve santrifüj (15.000 x g,20 dk, 4 °C) ekleyin. Supernatant atın ve pelet tutun.
  16. Son peleti (yani saflaştırılmış mitokondri) toplayın ve -20 °C'de saklayın.
    NOT: Kantitatif proteomik analiz için mitokondri örneği olarak yumurtalık kanseri dokusundan tüm saflaştırılmış mitokondriyi birleştirin.

2. İnsan kontrol yumurtalık dokularından mitokondri hazırlanması

  1. Adım 1.1'de açıklandığı gibi mitokondriyal izolasyon tamponunun 250 mL'sini hazırlayın.
  2. Temiz bir cam çanak normal kontrol yumurtalık dokularının ~ 1,5 g yerleştirin.
  3. Doku yüzeyinden 3x kan hafifçe yıkamak için önceden soğutulmuş mitokondriyal izolasyon tampon 2 mL ekleyin.
  4. Yaklaşık 1 mm3 adet dokuyu tamamen kıymak için temiz oftalmik makas kullanın ve kıymalı dokuları 50 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın.
  5. 8 mL 0.05% trypsin/20 mM EDTA fosfat tamponlu salin (PBS) kıyma kontrol dokularına ekleyin ve sindirmek (30 dk, oda sıcaklığında), hangi doku ve hücreleri lyse ve mitokondri serbest yardımcı olur. Sonra santrifüj (200 x g, 5 dk). Supernatant atın ve dokular ve hücreleri tutmak.
  6. 0,2 mg/mL nagarse içeren 13,5 mL mitokondriyal izolasyon tamponu ekleyin ve sonra kıyma dokuları (2 dk, 4 °C) homojenleştirmek için elektrikli bir homojener kullanın (kullanım ölçeği 2, 10 s 6x, aralık 10 s)
  7. Doku homojenates içine mitokondriyal izolasyon tampon başka 3 mL ekleyin ve pipetleme tarafından iyice karıştırın.
  8. Hazırlanan doku homojen (1.300 x g,10 dk, 4 °C) santrifüj. Ham nükleer fraksiyonu çıkarın (yani, pelet) ve supernatant tutun.
  9. Recentrifuge supernatant (10.000 x g, 10 dk, 4 ° C). Mikrozomları çıkarın (yani, supernatant) ve pelet tutun.
  10. Hafif borulama ile pelet iyi askıya almak için mitokondriyal izolasyon tampon 2 mL ekleyin.
  11. Pelet süspansiyonuna santrifüj (7.000 x g,10 dk, 4 °C). Supernatant atın ve ham mitokondri (yani, pelet) tutmak.
  12. Çıkarılan ham mitokondriyi yeniden askıya almak için %25 yoğunluk gradyan ortamının 12 mL'sini ekleyin.
  13. Bir tüpü aşağıdan yukarıya %38 8 mL ile doldurarak kesintili bir yoğunluk degradesi yapın, %34'ün 5 mL'si, %30'unun 8 mL'si, %25'inin 12 mL'si (2.12'den itibaren ham mitokondriyi içeren), %23'ün 8 mL'si ve %20 yoğunlukgradient ortamının 3 mL'si ve santrifüj (52.000 x g, 90 dk, 4 °C).
  14. Temiz bir tüp içine% 34 ve% 38 arasında arayüz% 25 ve% 30 arasında aralığında saflaştırılmış mitokondri toplamak için uzun ve künt bir şırınga kullanın.
  15. Toplanan mitokondri içine mitokondriyal izolasyon tampon ekleyin üç kat hacimde seyreltmek için. Santrifüj (15.000 x g, 20 dk, 4 °C) ve supernatant atın.
  16. Peleti yeniden askıya almak için 2 mL mitokondriyal izolasyon tamponu ekleyin ve santrifüj edin (15.000 x g,20 dk, 4 °C). Supernatant atın ve pelet tutun.
  17. Son peleti (yani saflaştırılmış mitokondri) toplayın ve -20 °C'de saklayın.
    NOT: Tüm saflaştırılmış mitokondriyi kontrol yumurtalık dokusundan kantitatif proteomik analiz için mitokondriyal örnekler olarak birleştirin.

3. Saflaştırılmış doku mitokondriyal örneklerinin kalitesinin doğrulanması

  1. Elektron mikroskobu (EM) ile doğrulama için saflaştırılmış mitokondriyal örnekler (yani, adım 1.16 ve adım 2.17 gelen kontrol yumurtalık dokularından yumurtalık kanseri dokularından pelet) bir tüp alın.
    NOT: Ayrıntılı protokol daha önce15,16açıklanmıştır.
  2. 8 M üre, 2 M tiourea, 40 mM Tris, 1 mM EDTA, 130 mM dithiothreitol (DTT) ve %4(w:v) 3-(3-cholamidopropyl) dimethylammonio)-1-propanesulfonate (CHAPS) karıştırılarak mitokondriyal protein ekstraksiyon tamponu hazırlayın. pH'ı 8,52'ye ayarlayın.
  3. Saflaştırılmış mitokondriyal örneklerden (yani, adım 1.16'daki yumurtalık kanseri dokularından gelen peletleri ve 2.17 adımdaki kontrol yumurtalık dokularından) bir tüp alın ve mitokondriyal protein ekstraksiyon tamponu (protein çıkarma tamponuna mitokondriyal örnekler, 1:5) ekleyin peleti yeniden askıya alın. Numuneleri sıvı nitrojen 3x'te dondurun ve oda sıcaklığında 2 saat saklayın.
  4. 12.000 x g, 30 dk, 4 °C'de santrifüj, supernatant (yani, çıkarılan mitokondriyal protein örneği) toplayın ve protein içeriğini bikonkosinik asit (BCA) protein test kiti ile ölçün.
  5. 9,08 g Tris ve 40 mL ddH2O'yu karıştırarak, pH'ı HCl kullanarak 8,8'e ayarlayarak ve ddH2O'yu 50 mL'lik son bir hacme ekleyerek 1,5 M Tris-HCl'nin (pH 8,8) 50 mL'sini hazırlayın. 4 °C'de saklayın.
  6. 6,06 g Tris ve 40 mL ddH2O'yu karıştırarak, pH'ı HCl kullanarak 6,8'e ayarlayarak ve ddH2O'yu 50 mL'lik son bir hacme ekleyerek 1 M Tris-HCl'nin 50 mL'sini (pH 6,8) hazırlayın. 4 °C'de saklayın.
  7. 29 g akrilamid, 1 g bis-akrilamid ve 80 mL ddH2O'nun karıştırılması ve 100 mL'lik son hacmine ddH2O ekleyerek 100 mL%30 akrilamid-bis çözeltisi hazırlayın. 4 °C'de kahverengi bir şişede saklayın.
  8. 29 g glisin, 58 g Tris, 3,7 g sodyum dodecil sülfat (SDS) ve 800 mL ddH2O'yu karıştırarak 10x tris-glisin elektroforez tamponunun 1.000 mL'sini hazırlayın ve 1.000 mL'lik son hacme ddH2O ekleyerek hazırlayın.
  9. 2 mL gliserin, 0,02 g bromofenol mavisi, 0,4 g SDS, 2 mL Tris-HCl pH 6.8 ve 7 mL ddH 2 O'nun ddH2O'unu karıştırarak ve ddH2O'nun son hacmine 10 mL'lik son hacmi ekleyerek 10 mL yükleme tamponunu hazırlayın.
  10. 10 mL %10 sodyum dodecyl sülfat-poliakrilamid jel elektroforez (SDS-PAGE) 4 mL ddH2O karıştırılarak jel ilerler, 3.3 mL %30 akrilamid-Bis çözeltisi, 2.5 mL 1.5 M Tris-HCl (pH 8.8), 0.1 mL %10 SDS, 0.1 mL % 10 amonyum persülfat ve 0.004 mL tetrametilenediamin (TEMED). SDS-PAGE çözümlü jel çözeltisini cam plakalar arasındaki plakaya tarakın alt seviyesine dökün. Üstüne 2 mL izopropil alkol ekleyin. 30 dakika bekletin.
  11. Izopropil alkolü çıkarın ve üstte ddH2O 3x ile yıkayın. 4.1 mL ddH2O, 1.0 mL %30 akilamid-bis çözeltisi içeren %5 konsantrasyon jel çözeltisini dökün, 1 M Tris-HCl 0.75 mL (pH 6.8), 0.06 mL %10 SDS, 0.06 mL %10 amonyum perülfat ve 0.006 mL TEMED. Hemen konsantrasyon jeli çözeltisi içine tarak takın, 30 dakika bekletin ve sonra tarak çıkarmak.
  12. 10x Tris-glisin elektroforez tamponunun 100 mL'sini 900 mL ddH2O ile seyrelterek 1x Tris-glisin elektroforez tamponu hazırlayın ve elektroforetik tanka dökün.
  13. Yumurtalık kanserinden gelen 30 μg mitokondriyal proteinleri karıştırın ve 3.4 adımdan kontrol yumurtalık dokularını yükleme tamponu ile 20 μL'lik son bir hacme ulaşın. Karışımı 5 dk kaynatın, sonra 100 V sabit voltaj kullanarak %10 SDS-PAGE çözme jeli ile ayırın. Bromfenol mavisi dibe ulaştığında elektroforezi durdurun.
  14. 150 mL 10x Tris-glisin elektroforez tamponu, 1.050 mL ddH2O ve 300 mL metanol karıştırarak elektroforetik transfer tamponunun 1,5 L'sini hazırlayın.
  15. PVDF membranı 10 dakika boyunca %100 metanol ve elektroforetik transfer tamponunda en az 5 dakika bekletin.
  16. Proteinleri içeren SDS-PAGE jelini alın ve 10 dakika boyunca elektroforetik transfer tamponuna batırın.
  17. Beyaz plaka, ıslak filtre kağıdı üç yaprak, PVDF membran, proteinler, ıslak filtre kağıdı iki yaprak ve ıslak sünger aşağıdan üste ıslak sünger ile ıslak bir sünger yerleştirerek bir transfer kaset olun. Herhangi bir kabarcıklar kaçının.
  18. Transfer kasetini elektroforetik tanka yerleştirin, elektroforetik transfer tamponunu dökün ve 2 saat boyunca sabit 200 mA akım altında aktarın.
  19. 12.114 g Tris, 29.22 g NaCl'i karıştırarak ve 500 mL'lik son hacme ddH2O ekleyerek 10x Tris tamponlu salin (TBS) stok çözeltisini hazırlayın. 10x TBS'nin 200 mL'si, 2 mL'si Tween-20 ve 1.798 mL ddH2O'nun karıştırılarak 100 mL'lik blokaj çözeltisini 100 mL ve 5 g BSA'yı karıştırarak 1x TBST'nin 2 L'sini hazırlayın.
  20. Aktarımdan sonra, PVDF membranını alın, 5 dk TBST'de hafifçe yıkayın, ardından oda sıcaklığında 1 saat boyunca bloklama çözeltisinde engelleyin.
  21. PVDF membranını (4 °C) lamin B (hücre çekirdeği; keçi anti-insan antikor1: 1.000 bloklama çözeltisi), flotillin-1 (tavşan anti-insan) dahil olmak üzere farklı hücre altı organellerine özgü farklı primer antikorlarla kuluçkaya yatırın antikor 1:500 blokaj çözeltisi), COX4I1 (mitokondrion; tavşan anti-insan 1:1,000 engelleme solüsyonu), GM130 (Golgi aparatı; fare anti-insan antikor 1:1,000 bloklama çözeltisi), katalaz (peroksizom; tavşan anti-insan antikor 1:1,000 engelleme çözeltisi) ve cathepsin B (lizom; tavşan anti-insan antikor 1:1.000 engelleme çözeltisi). TBST'de 5 dk 3x hafifçe yıkayın.
  22. PVDF membranı oda sıcaklığında 1 saat boyunca ilgili ikincil antikorlarla (tavşan anti-keçisi, keçi anti-tavşanı veya keçi anti-faresi) kuluçkaya yatırın. TBST'de 5 dk 3x hafifçe yıkayın. Elektromilüminesans (ECL) ile görselleştirin.

4. iTRAQ-SCX-LC-MS/MS analizi

NOT: Bölüm 4 için ayrıntılı prosedürler iTRAQ talimatlarına(Malzeme Tablosu)bakınız.

  1. Saflaştırılmış mitokondriyal numunelere (yani, 1.16.adımdan yumurtalık kanseri dokularından gelen peletlere ve 2.17.adımdan kontrol yumurtalık dokularına) SDT tamponu (%4 SDS, 100 mM Tris-HCl pH 7.6 ve 100 mM DTT) ekleyin. Görünür çökelti olmayana kadar örneği girdap.
    NOT: SDT tampon oranına mitokondriyal örnek 1:5 olmalıdır.
  2. 5 dakika için SDT ile tedavi örnek kaynatın, buz üzerinde örnek soğumave sonra santrifüj (2.000 x g, 2 dk).
  3. Eksiten mitokondriyal protein örnekleri olarak supernatant toplayın ve bca protein test kiti ile protein içeriğini ölçün.
  4. Azaltma, alkillenme, tripsin ile sindirim, tuzdan arındırma ve liyofilizasyon için SDT-ekstrakte mitokondriyal proteinler (her örnek200 μg) alın3,4. Her örnek için üç çoğaltma yapın.
  5. 100 mM tetraetil amonyum bromür çözeltisi (pH 8.5) ile adım 4.4 den triptik peptidler (her örnek 100 μg) tedavi ve talimatlarına göre 6-pleks iTRAQ reaktifler biri ile triptik peptidler etiket3,4. Her örneği 3x etiketle.
  6. Mix eşit etiketli 6 triptik peptid örnekleri (yumurtalık kanseri dokularından üç ve kontrol yumurtalık dokularından üç), ve bir vakum konsantratörü ile kuru.
  7. Karışık iTRAQ etiketli peptidleri SCX kromatografisi ile 60 kesir (1 dk başına bir kesir) olarak kesirlendirin, sonra her iki fraksiyonu SCX fraksiyonlu örnek olarak birleştirin (n = 30).
  8. Ms/MS verilerini elde etmek için 60 dk'lık LC ayırma gradyanı içinde nano LC sistemi ile birleştiğinde kütle spektrometresi3,4 üzerinde LC-MS/MS analizine her SCX-fraksiyonlu örnek konu.
  9. Arama motoru(Malzeme Tablosu)ile proteinleri tanımlamak için MS/MS verilerini arayın.
  10. Her proteini ölçmek ve mitokondriyal farklılaştırıcı proteinleri (mtDEP) >1.5 veya <-1.5 kat ve p < 0.05'i değiştirmek için iTRAQ muhabiri-iyon yoğunluklarını kullanın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Yumurtalık kanseri dokuları ve kontrol yumurtalık dokuları mitokondri hazırlanmasında bir fark vardı. Bu çalışmada, yumurtalık kanseri dokularından mitokondri hazırlamak için çok daha kolay olduğunu bulundu kontrol yumurtalık dokularından daha3,4. Kontrol yumurtalık dokularından mitokondri hazırlanması için protokolde bazı iyileştirmeler yapılması gerekiyordu. İlk olarak doku homojenizasyonundan önce kıymalı kontrol dokularına ekl...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Mitokondriyal değişiklikler yumurtalık kanserinin bir özelliğidir. Büyük ölçekli kantitatif proteomikler için insan yumurtalık kanseri ve kontrol dokularından yüksek kaliteli mitokondriyal örneklerin hazırlanması yumurtalık kanseri patogenezi ve mitokondriyal moleküler ağ değişiklikleri mitokondriyal fonksiyonun derinlemesine anlaşılması yarar ve mitokondri 4 dayalı hedef tedavi ve etkili biyobelirteçleri sonraki keşif için moleküler mekanizmasını açıklığa kavuşturmak yardımcı olur ,

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Teşekkürler

Bu çalışma Hunan Provincial Hundred Talent Plan (X.Z.), Xiangya Hastanesi Yetenek Giriş Fonları (XZ), Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (Grant No. 81572278 ve 81272798 XZ), Çin hibe "863" Planı tarafından desteklendi Proje (Hibe No. 2014AA020610-1 XZ için) ve Çin Hunan İl Doğa Bilimleri Vakfı (Grant No. 14JJ7008 XZ için). X.Z. bu makalenin konseptini tasarladı, mitokondri örneklerinin iTRAQ kantitatif proteomik verilerini elde etti, el yazması yazdı ve revize etti, ilgili çalışmayı koordine etti ve finansal destekten ve buna karşılık gelen Çalışma. H.L. mitokondri örnekleri hazırladı. S.Q. kısmi çalışmaya katıldı. X.H.Z İngilizce'nin yazımına ve editörlüğünü aldı. N.L. iTRAQ proteomics verilerini analiz etti. Tüm yazarlar son taslağı onayladı.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
BCA protein tahlil kitiVazymeE112BCA protein tahlil kiti, seyreltik protein çözeltilerinin (0,5 ila 20 mikrogram / ml) toplam protein konsantrasyonunu (A562nm) ölçmek için optimize edilmiş, popüler BCA reaktiflerimizin özel 3 bileşenli bir versiyonudur.
Sığır serum albümini (BSA)SolarbioA8020-5GIsı şoku fraksiyonu, Avustralya kökenli, proteaz içermez, düşük yağ asidi, düşük IgG, pH 7, ≥ % 98
SantrifüjXiangYiTDZ4 - WS
CHAPSSigmaC9426-5GBioReagent, elektroforez için uygun, vb; %98 (HPLC) (Sigma-Aldrich)
Diamin tetraasetik asit (EDTA)Sigma798681-100GSusuz, serbest akışlı, Redi-Dri, vb; % 98
DTTSigma101977770011,4-Dithiothreitol
Easy nLCProxeon Biosystems (şimdi Thermo Fisher Scientific)
Etilen glikol bis (2-aminoetil eter) tetraasetik asit (EGTA)SigmaE0396-10GBioXtra, &; %97 .0
HomojenizatörSilentShakeHYQ-3110
iTRAQ reaktif kitiUygulamalı Biyosistemler Uygulamalı BiyosistemleriTRAQ Reaktifleri– Kimya Başvuru Kılavuzu, P/N 4351918A
Düşük sıcaklık süper hızlı santrifüjleyiciEppendorf5424R
MannitolMacklinM813424-100GMannitol, tatlandırıcı, nemlendirici ve hacim arttırıcı madde olarak işlev gören fruktozdan hidrojenasyondan üretilen bir polioldür (polihidrik alkol). Düşük higroskopikliğe ve zayıf yağ çözme yeteneğine sahiptir.
MASCOT arama motoruMatrix Science, Londra, İngiltere; sürüm 2.2
NagarseSolarbioP9090
N-hidroksisüksinamid (SDT)Sigma56480-25GPurum, & ge; %97,0 (T)
NycodenzAlere/Axis-Shield1002424-1
Fenilmetansülfonil florür (PMSF) proteaz inhibitörüSolarbioP0100-1MLPMSF, tripsin, kimotripsin, trombin ve papain'i inhibe etmek için serin kalıntıları ile reaksiyona giren bir proteaz inhibitörüdür.
Potasyum klorürMacklinP816354-25GPotasyum muriate ve sylvite olarak da bilinen potasyum klorür, KCI, 776 ° C'de eriyen tuzlu bir tada sahip renksiz kristal bir katıdır; C (1420 ARASINDA). Suda çözünür, ancak alkolde çözünmez. Potasyum klorür gübrelerde, ilaçlarda, fotoğrafçılıkta ve tuz yerine kullanılır.
Proteome Discover 1.4Matrix Science, Londra, İngiltere
PVDF membranMillipore053171 rulo, 26,5 cm x 1,875 m, 0,45 & m gözenek boyutu, batı lekeleme için düşük arka plan floresansına sahip hidrofobik PVDF transfer membranı. Görünür ve kızılötesi floresan problarla uyumludur.
Q Eksaktif kütle spektrometresiThermo Fisher Scientific
SCX sütunuSigma589975-μ m parçacık boyutu, uzunluk 5cm ve kez; iç çap 4.6mm (Supelco).
Sodyum ortovanadat (V)MacklinS817660-25GSodyum ortovanadat (Vanadat), protein fosfotirozil fosfatazlar için genel bir rekabetçi inhibitördür. Sodyum ortovanadat ile inhibisyon, EDTA ilavesi veya seyreltme ile geri dönüşümlüdür.
SucroseMacklinS824459-500GVetec reaktif sınıfı, %99
ThioureaSigma62-56-6ACS reaktifi, & ge; %99.0
Tris bazlıSigma10708976001TRIS bazı, 7.0-9.0 pH aralığında faydalıdır. 25 ° C'de 8.1'lik bir pKa'ya sahiptir.
Tripsin (hücre kültürü kullanımı)Gibco25200-056Tripsinin bu sıvı formülasyonu EDTA ve fenol kırmızısı içerir. Gibco Tripsin-EDTA, domuz pankreasından türetilen ışınlanmış bir proteaz karışımı olan tripsin tozundan yapılır. Sindirim gücü nedeniyle tripsin, hücre ayrışması, rutin hücre kültürü geçişi ve birincil doku ayrışması için yaygın olarak kullanılmaktadır.
UreaSigmaU5378-100Gtozu, BioReagent, moleküler biyoloji için, hücre kültürü için uygun

Kaynaklar

  1. Sakhuja, S., Yun, H., Pisu, M., Akinyemiju, T. Availability of healthcare resources and epithelial ovarian cancer stage of diagnosis and mortality among Blacks and Whites. Journal of Ovarian Research. 10, 57(2017).
  2. Gadducci, A., et al. Surveillance procedures for patients treated for epithelial ovarian cancer: a review of the literature. International Journal of Gynecological Cancer. 17, 21-31 (2007).
  3. Li, N., Li, H., Cao, L., Zhan, X. Quantitative analysis of the mitochondrial proteome in human ovarian carcinomas. Endocrine-Related Cancer. 25, 909-931 (2018).
  4. Li, N., Zhan, X., Zhan, X. The lncRNA SNHG3 regulates energy metabolism of ovarian cancer by an analysis of mitochondrial proteomes. Gynecologic Oncology. 150, 343-354 (2018).
  5. Li, N., Zhan, X. Signaling pathway network alterations in human ovarian cancers identified with quantitative mitochondrial proteomics. EPMA Journal. 10, 153-172 (2019).
  6. Deng, P., Haynes, C. M. Mitochondrial dysfunction in cancer: Potential roles of ATF5 and the mitochondrial UPR. Semin Cancer Biology. 47, 43-49 (2017).
  7. Georgieva, E., et al. Mitochondrial dysfunction and redox imbalance as a diagnostic marker of "free radical diseases". Anticancer Research. 37, 5373-5381 (2017).
  8. Sotgia, F., et al. A mitochondrial based oncology platform for targeting cancer stem cells (CSCs): MITO-ONC-RX. Cell Cycle. 17, 2091-2100 (2018).
  9. Lee, J. H., et al. Individualized metabolic profiling stratifies pancreatic and biliary tract cancer: a useful tool for innovative screening programs and predictive strategies in healthcare. EPMA Journal. 9, 287-297 (2018).
  10. Zhan, X., Long, Y., Lu, M. Exploration of variations in proteome and metabolome for predictive diagnostics and personalized treatment algorithms: Innovative approach and examples for potential clinical application. Journal of Proteomics. 188, 30-40 (2018).
  11. Lu, M., Zhan, X. The crucial role of multiomic approach in cancer research and clinically relevant outcomes. EPMA Journal. 9, 77-102 (2018).
  12. Hu, R., Wang, X., Zhan, X. Multi-parameter systematic strategies for predictive, preventive and personalised medicine in cancer. EPMA Journal. 4, 2(2013).
  13. Cheng, T., Zhan, X. Pattern recognition for predictive, preventive, and personalized medicine in cancer. EPMA Journal. 8, 51-60 (2017).
  14. Zhan, X., Zhou, T., Li, N., Li, H. The differentially mitochondrial proteomic dataset in human ovarian cancer relative to control tissues. Data in Brief. 20, 459-462 (2018).
  15. McMillan, J. D., Eisenback, M. A. Transmission electron microscopy for analysis of mitochondria in mouse skeletal muscle. Bio-protocol. 8, e2455(2018).
  16. Paul, P. K., et al. Targeted ablation of TRAF6 inhibits skeletal muscle wasting in mice. Journal of Cell Biology. 191, 1395-1411 (2010).
  17. Pascual-Ahuir, A., Manzanares-Estreder, S., Proft, M. Pro- and antioxidant functions of the peroxisome-mitochondria connection and its impact on aging and disease. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2017, 9860841(2017).
  18. Schrader, M., Costello, J., Godinho, L. F., Islinger, M. Peroxisome-mitochondria interplay and disease. Journal of Inherited Metabolic Disease. 38, 681-702 (2015).
  19. Bartolák-Suki, E., Imsirovic, J., Nishibori, Y., Krishnan, R., Suki, B. Regulation of mitochondrial structure and dynamics by the cytoskeleton and mechanical factors. International Journal of Molecular Sciences. 18, 1812(2017).
  20. Rezaul, K., Wu, L., Mayya, V., Hwang, S., Han, D. A systematic characterization of mitochondrial proteome from human T leukemia cells. Molecular & Cellular Proteomics. 4, 169-181 (2005).
  21. Zhan, X., et al. How many proteins can be identified in a 2DE gel spot within an analysis of a complex human cancer tissue proteome? Electrophoresis. 39, 965-980 (2018).
  22. Zhan, X., Li, N., Zhan, X., Qian, S. Revival of 2DE-LC/MS in proteomics and its potential for large-scale study of human proteoforms. Med One. 3, e180008(2018).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Mitokondriyal İzolasyonOver Kanseri DokusuDiferansiyel Hız SantrifügasyonuYoğunluk Gradyanı SantrifügasyonuiTRAQ ProteomiğiProtein SindirimiGüçlü Katyon DeğişimiSıvı KromatografisiTandem Kütle SpektrometrisiMitokondriyal Proteom
Yumurtalık Kanseri Dokularından Mitokondri Hazırlanması ve Kantitatif Proteomik Analizi Için Yumurtalık Dokularının Kontrolü
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.