Yöntem makalesi

Travmatik Beyin Hasarı Murine Modelinde İntranazal Doğum sonrası MRG kullanarak Süperparamanyetik Demir Oksit etiketli Mezenkimal Kök Hücrelerin Takibi

DOI:

10.3791/60450

⸱

21 Kasım 2019

 ,  ,  , 
1Ph.D. Program for Neural Regenerative Medicine, College of Medical Science and Technology, Taipei Medical University and National Health Research Institutes, 2Center for Neurotrauma and Neuroregeneration, Taipei Medical University, 3TMU Neuroscience Research Center, Taipei Medical University, 4Department of Neurosurgery, Taipei Medical University Hospital, 5Department of Surgery, School of Medicine, College of Medicine, Taipei Medical University

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada sunulan non-invaziv mezenkimal kök hücre için bir protokol (MSC) teslim ve travmatik beyin hasarı bir fare modeli nde izleme. Süperparamanyetik demir oksit nano partikülleri, msc etiketlemesi için manyetik rezonans görüntüleme (MRG) prob ve gerçek zamanlı MRG kullanılarak intranazal doğumdan sonra invaziv in vivo izleme için non-invaziv in vivo izleme olarak kullanılır.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Travmatik beyin hasarı (TBI) gibi beyin yaralanmaları için kök hücre bazlı tedaviler klinik çalışmalar için umut verici bir yaklaşımdır. Ancak, invaziv hücre iletimi ve düşük transplantasyon verimliliği ile izleme gibi teknik engeller, çevirisel kök tabanlı tedavide zorluklar olmaya devam etmektedir. Bu makalede, süperparamanyetik demir oksit (SPIO) nano partikülleri ile mezenkimal kök hücrelerin (MSCs) etiketleme dayalı kök hücre etiketleme ve izleme için ortaya çıkan bir teknik açıklanmıştır, yanı sıra etiketli MSCs intranazal teslim. Bu nano tanecikleri floresan izotiyoyanat (FITC) gömülü ve güvenli MSCs etiketlemek için, daha sonra intranazal rota ile TBI kaynaklı farelerin beyinteslim edilir. Daha sonra gerçek zamanlı manyetik rezonans görüntüleme (MRG) ile non-invaziv in vivo izlenir. Hücre etiketlemesi ve intranazal doğum için SPIO'yu birleştiren bu tekniğin önemli avantajları arasında (1) non-invaziv, uzun takip sürelerinde doğumdan sonra in vivo MSC takibi, (2) non-invaziv nedeniyle birden fazla dosing rejimi olasılığı MSC teslimat yolu ve (3) insanlar için olası uygulamalar, SPIO güvenliği nedeniyle, MRG ile hücre izleme yönteminin non-invaziv doğası, ve yönetim yolu.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mezenkimal kök hücreler (MSC) insanlarda merkezi sinir sistemi (CNS) bozuklukları ve yaralanmalarının tedavisinde kök hücre bazlı tedaviler için cazip adaylardır. Ayrıca, MSCs yaralanma sitelerinde terapötik proteinlerin teslimi için bir araç olarak kullanılmıştır1,2. Son yıllarda, cns bozukluklarının kök hücre temelli tedavileri için 1) hücre tesliminin yeni yollarını ve 2) hücre takibini sağlamak için umut verici yenilikler geliştirilmiştir. Kök hücrelerin beyne intranazal olarak verilmesi, hücrelerin kribriform plakayı atlayıp parenkim yolu üzerinden kısmen koku alma ampulüne girme yeteneğine bağlıdır3. Spio nano partikülleri manyetik rezonans görüntüleme (MRG) için güvenli problar olduğundan ve MRI3,4,5tarafından MSC'lerin non-invaziv hassas uzunlamasına izleme izin, intranazal doğum ve süperparamanyetik demir oksit (SPIO) nano tanecikleri ile MSCs etiketleme kombinasyonu, CNS bozukluklarının tedavisinde MSCs klinik uygulamalar için umut verici bir yaklaşım temsil eder . Ayrıca intranazal doğum, kısa bir süre içinde tekrarlanan bir uygulama sağlayan güvenli ve non-invaziv bir yoldur.

Bu makalede, SPIO etiketli hücreler ve MRG kullanan travmatik beyin hasarı (TBI) bir fare modelinde vivo post-intranazal doğumda MSC'leri izlemek için son derece hassas ve non-invaziv bir teknik açıklanmaktadır. SPIO etiketlemenin önemli bir avantajı da, hücrelerin etkin ve non-invaziv olarak izlenmesini mümkün kılan, MRG ile dokudaki SPIO'nun hassas tespitidir. Burada kullanılan SPIO nano tanecikleri ticari olarak mevcuttur ve bir floresan izotiyoyanat ile etiketlenmiş (FITC) florofor, hangi immünboyama veya ek işleme olmadan dokuda SPIO tespiti için izin verir. Ayrıca, uzunlamasına gerçek zamanlı izleme yapmak ve teslim MSCs biyodağılımı araştırmak mümkündür.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokolde hayvanları içeren tüm prosedürler Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylandı, Taipei Tıp Üniversitesi hayvan kullanımı için Etik Komitesi onayı ile (onay no. BAĞ-2018-0574; 15.03.2019).

1. SPIO Nano tanecikleri ile MSC'lerin etiketlemesi

  1. MSC'leri SPIO ile etiketlemek için, 6 mL etiketleme ortamı (Dulbecco'nun modifiye Eagle ortamında (DMEM'de 25 μg/mL SPIO) fetal sığır serumu olmadan [FBS]) MSC içeren bir T75 şişesine (%80 birleşme) ekleyin.
  2. Hücreleri etiketleme ortamıyla bir CO2 kuluçka makinesinde (37 °C, %5 CO2)titremeden kuluçkaya yatırın. 24 saat sonra, vakuma bağlı plastik uçlu steril bir Pasteur pipeti kullanarak etiketleme ortamını nazikçe çıkarın. Hücreleri monolayer 2x 6 mL fosfat tamponlu salin (PBS) ile yıkayın.
    1. Hücrelerin başarılı bir şekilde etiketlenip etiketlenmediğini belirlemek için, flüoresan mikroskobu nisbeten veya konfokal mikroskop altında etiketlenmiş hücreleri kontrol edin, SPIO bir florofor la etiketlendi mi (yani, burada kullanılanlar gibi); Şekil 1B,C). Alternatif olarak, hücreler için Prusya mavisi boyama gerçekleştirin (bkz. boyama protokolü için 6.2-6.4 adımlarını).
  3. 3 mL tripsin ve 37 °C'de inkübün ile tedavi ile yapışık hücreleri hasat edin. 5 dakika kuluçkadan sonra, trypsinin inaktive etmek için %10 FBS (v/v) ile 7 mL önceden ısıtılmış DMEM ortam ekleyin. 15 mL konik tüp içine bir pipet kullanarak hücre süspansiyon toplayın.
  4. Hücre süspansiyonuna 300 x g'de 5 dk. Süpernatant'ı atın ve PBS'deki hücre peletini yeniden askıya alın. Trypan mavi boya ve hemositometre kullanarak canlı hücreleri sayın.
    NOT: Etiketli hücrelerin hücre peleti demir yüklemesi nedeniyle koyu renk olarak görünür (Şekil 1D). Bu protokol MSC etiketleme ve MRGörüntüleme için geçerlidir. MSC etiketleme 6 yordamıiçin yordam daha önce optimize edilmiş ve in vivo izleme etiketli MSC'ler hazırlamak için sadece adımlar burada yer almaktadır, in vivo izleme odak noktası olduğundan. Diğer hücre türlerinin kültüre alınması ve etiketlemesi için protokol araştırmacı tarafından optimize edilmelidir.
  5. PBS kullanarak hücre konsantrasyonu 18 μL PBS (veya intranazal doğum prosedüründe kullanılacak toplam hacim) 150.000 hücre (veya yeterli MRG sinyali ile sonuçlanan bir sayı) ayarlayın.
    NOT: PBS'nin 150.000 hücre/18 μL'den daha yüksek bir hücre konsantrasyonunun hücre agregasyonuna yol açtığı ve intranazal doğumun verimliliğini etkileyebileceği fark edilmiştir. İntranazal doğum için daha fazla sayıda hücre gerekiyorsa, intranazal uygulama non-invaziv bir işlem olduğu için hücre süspansiyonunun toplam hacmini artırın ve intranazal yönetimlerin sayısını artırın ve birden fazla dozlama mümkündür.

2. Kontrollü Kortikal Etki (CCI) Yaralanması

NOT: Bu protokolde erkek C57 BL/6 fareler (7-8 haftalık) 12/12 h açık/karanlık bir döngü içinde tutuldu ve reklam libitum gıda ve suya erişim sağladı.

  1. CcI yaralanması için her fare hazırlamak için, zolazepam (50 mg / kg) ve ksilazin (20 mg / kg) intraperitoneal (i.p.) enjeksiyon (1 mL / kg) ile anestezi kokteyl uygulayın. Anestezi derinliğinin, parmak ucuyanıtı eksikliğinden yeterli olduğundan emin olun. Alternatif olarak, 60 s için% 2-4 izofluran ile birlikte bir odaya fareyerleştirin.
  2. Elektronik bir saç makası kullanarak kulakların arasındaki kafatasının sırt yüzeyinin kürktıraş. İyotla ıslatılmış steril pamuklu bir bez kullanarak tıraş alanını birkaç kez temizleyin. İyot temizlemek için % 70 etanol batırılmış bir pamuklu bez kullanın.
  3. Anestezili fareyi stereotaktik çerçeveye yerleştirin ve kulak çubukları ve burun çubuklarını kullanarak fareyi sabittutun. Kafatası yüzeyine erişmek için steril makas kullanarak traş deride bir midsagittal kesi (yaklaşık 2,5 cm) olun.
  4. Kafatası ortaya çıkarmak için bir pamuk ped kullanarak kemik doku çıkarın. Kafatası yüzeyini %3 H2O2'ye batırılmış bir pamuk lu bez kullanarak 10 s'ye temizleyin, ardından kuru bir pamuk pedle temizleyin.
    NOT: Kafatası dikişleri ve hem bregma ve lambda artık kolayca tespit edilebilir.
  5. CCI yaralanması için kafatası yüzeyinde tercih edilen koordinatları belirleyin ve bir kalem veya uygun marker kullanarak koordinatların etrafına bir daire (4 mm çapında) çizin.
    NOT: Bu protokolde CCI indüksiyonu için anteeroposterior (AP) -2.0 mm ve mediolateral (ML) +1.5 mm koordinatları kullanıldı.
  6. İşaretli dairedeki kafatasını inceltmek için mikro matkap ve yuvarlak çapak (0,5 mm çapında) kullanın. Delme sırasında basınç uygulamaktan kaçının, kemik yoluyla delme beyin parankim hasara neden olabilir gibi. Temiz ve kuru pamuklu bir bez kullanarak kemik tozunu temizleyin.
  7. Dura mater'i sağlam tutarken ortaya çıkarmak için steril ince terlikler kullanarak kemik kapağını hafifçe çıkarın. Fareyi yaralanma öncesi hazırlık için kullanılan stereotaktik çerçeveden çıkarın ve CCI aygıtının stereotaktik çerçevesine yerleştirin.
  8. Kulak çubuklarını ve burun çubuklarını kullanarak farenin başını stabilize edin. Farenin başının rostral-kaudal yönde düz olduğundan emin olun ve gerekirse burun çubuklarını ayarlayın.
  9. Kontrol kutusundaki talimatları uygulayın ve darbe ucunu açık kortikal yüzeye sıfırlayın. Darbeci ucun, darbecinin tabanındaki X ve Y kontrol tekerlekleri kullanılarak etkilenecek istenilen korteks koordinatlarının hemen üzerinde hizalandığından emin olun.
  10. Farede hafif yaralanmalara neden olmak için kontrol kutusunu 5 m/s hız, 250 ms çalışma süresi ve 1 mm yaralanma derinliği ile deneme parametrelerini ayarlayın.
  11. Kontrol kutusundaki ''impact'' düğmesine basarak yaralanmaya neden olun. Steril pamuklu bir bez kullanılarak oluşan herhangi bir kanamayı temizle.
  12. Fareyi stereotaktik çerçeveden çıkarın ve ipek cerrahi dikişleri kullanarak kesikapatın. Fare MRI için manyetik alana maruz kalacağı için cerrahi alanı kapatmak için metal klipsler kullanmayın.
  13. Enfeksiyonları önlemek için topikal antibiyotikler (bacitracin neomisin) cerrahi bölgeye uygulayın. Fareyi ısıtma yastığında tutun ve kurtarma aşamasında yakından izleyin.
  14. Ketoprofen uygulaması çalışma hedefleri ile çelişmediği sürece, ameliyattan sonra 3 gün boyunca her gün ketoprofen (2.5 mg/kg, IP) uygulayın.

3. İntranazal Doğum

  1. CCI sonrası 1 gün indüksiyonda, i.p. enjeksiyonu ile zolazepam (50 mg/kg) ve ksilazin (20 mg/kg) anestezi kokteylini uygulayın. Farenin, parmak kıstırma yanıtı eksikliği nden derinden anestezi yaptığından emin olun.
  2. Hyaluronidaz tedavisi ile MSCs intranazal teslim için fare hazırlayın.
    1. Farenin scruff kapmak ve kafatası hareketsiz iken sıkıca sırtını açın. Steril PBS'de hyaluronidaz içeren bir pipetin ucunu farenin burun deliğini 45° açıyla yakınına yerleştirin.
    2. Her burun deliğinde 3 μL hyaluronidase süspansiyon uygulayın. Fareyi hareketsiz ve 5 dakika boyunca temiz bir ped üzerinde yukarı bakacak şekilde tutun. Hyaluronidaz tedavisini 4x (toplam 100 U hyaluronidase süspansiyonu) tekrarlayın.
  3. Hyaluronidase tedavisinden sonra, tedavi edilen fareyi 30 dk kadar bakan temiz bir ped üzerinde tutun.
  4. MSC'leri beyne teslim etmek için fareyi adım 3.2.1'de açıklandığı gibi sıkıca tutun. 3 s aralıklı 3 μL/burun deliği MSC süspansiyonuyguluyor. Örnek damlatamamen kaybolana kadar fareyi 30 s boyunca aynı pozisyonda tutun.
    NOT: Uygulama sırasında hava kabarcıkları oluşturmaktan kaçının.
  5. 3x'e kadar 2 dk arayla yönetimi tekrarlayın.
    NOT: Teslim edilecek toplam hücre sayısı 150.000'dir, böylece hücre süspansiyonunun 18 μL'si her burun deliği için 3 μL dozda, her biri 3 kat daha fazla dozda teslim edilebilir.
  6. Fareyi kafesine geri döndürün ve anesteziden tamamen iyileşene kadar yakından izleyin.

4. In Vivo Manyetik Rezonans Görüntüleme

NOT: Beyin dokusunun histolojik boyama daha önce intranazal uygulama dan sonra kök hücrelerin başarılı doğum onaylamak için kullanılmıştır. Ancak, bu yöntem sadece bir çalışmanın bitiş noktası olarak kullanılabilir, longitudinally değil. Terapötik kök hücreleri etiketlemek için MRG probları kullanmak, MRG kullanarak hücrelerin uzunlamasına, non-invaziv, in vivo takibine olanak sağlayacaktır. Daha da önemlisi, bu protokol gerekli hayvan sayısını etkin bir şekilde azaltır. Bu protokolde, MSC'lerin 1, 7 ve 14'ü doğum sonrası 1, 7 ve 14'te MRG taraması yapıldı.

  1. Fareyi MRG taraması için hazırlamak için fareyi izoflurane ile anestezi edin (indüksiyon için 1 L/dk O2'de %5 izofluran, bakım için %1,5-2 izofluran). Farenin gerekli anestezi düzeyine ulaştığından emin olmak için bir parmak ucutu yapın.
  2. Fareyi görüntüleme tutucunun üzerine yerleştirin ve musluklar veya başka bir uygun yöntem kullanarak konumunu sabittutun. Tutucuyu MR bobininin (7 T/40 cm mıknatıs) merkezine taşıyın ve izleme bağlantısını bağlayın.
  3. Spin-echo dizisi kullanarak T2*ağırlıklı taramalar elde etmek için tekrarlama süresini (TR) 1500 ms'e, yankı süresini (TE) 2,8 ms'e ayarlayın.
  4. 16 mm x 16 mm görüş alanı (FOV), 128 x 128 satın alma matrisi (MTX) ve dilim kalınlığını dört sinyal ortalaması ve 90° çevirme açısı (FA) ile 0,75 x 0,8 mm2 kullanın.
  5. Taramaları tamamladıktan sonra fare tutucuyu MRBobin merkezinden geri çekin. Fareyi kafesine geri döndürün ve anesteziden tamamen iyileşene kadar yakından izleyin.
  6. T2*ağırlıklı görüntülerde etiketli MSC'leri izlemek ve ölçmek için ITK-SNAP yazılımını (sürüm 3.8.0)7kullanın.
    1. MRI taramasının ham verilerini MRI makinesinin bilgisayarından DICOM (tıpta dijital görüntüleme ve iletişim) formatında analiz için kullanılan bilgisayara aktarın.
    2. ITK-SNAP yazılımını çalıştırın ve Dosya düğmesine tıklayarak MR görüntülerini yükleyin. Ardından menüde Ana Resmi Aç'a tıklayın. Ekran penceresindeki Resmi Aç düğmesine basın ve Gözat düğmesini kullanarak MR görüntülerini bulun ve açın.
      NOT: MR görüntülerinde etiketli hücrelerin görselleştirilmesi hipoyoğun alanlar olarak görünecektir. Görüntü kontrastı ayarlanması gerekiyorsa, Araçlar | Görüntü Kontrastı.
    3. Segmentasyon etiketleri bölümünde Active Label'ı seçerek hipoyoğun alanların ve lezyonun veya diğer beyin parçalarının segmentasyonlarını oluşturun. Farklı segmentler için farklı etiket renkleri kullanın (birden fazla parçanın segmentasyonu gerekiyorsa).
    4. SPIO etiketli MSC'leri temsil eden hipoyoğun alanların etrafını çizmek için Ana Araç Çubuğu'ndaki Çokgen aracını kullanın. MRI görüntüsünün altında bulunan Kabul Et'iseçin. Parçalı alanlar, belirli bir kesime atanan etkin etiketin aynı rengi olarak görünür. Tüm MR Dilimleri için bu segmentasyon adımLarını tekrarlayın.
    5. ITK-SNAP araç kutusunun altındaki Segmentasyon Etiketleri bölümünde bulunan 3B Araç Çubuğu'nunaltındaki Neşter Aracı'nı seçerek tüm beyindeki MSC dağılımını temsil edecek segmentli alanların 3B haritasını geliştirin. Ardından, oluşturulan 3B haritanın altındaki Kabul et'e basın.
    6. Etiketli hücreleri temsil eden parçalı hipoyoğun alanların nicel analizini (hacim ve yoğunluk ortalaması) gerçekleştirmek için, üst paneldeki Segmentasyon düğmesine basın ve Birim ve İstatistik'iseçin.

5. Fare Beyninin Fiksasyonu ve Kriyodinasyon

  1. Fare beynini düzeltmek için, daha önce açıklandığı gibi, son MRI taraması sonrasında% 4 paraformaldehit (PFA) ile transkardiyak perfüzyon gerçekleştirmek8.
    1. Kafasını kes vebeyni8. Beyni 4 °C'de en az 48 saat boyunca %4 PFA ile düzeltin.
    2. Beyin çözeltinin dibine banına kadar 4 °C'de %30 sakaroz çözeltisine daldırarak beyni kurutun.
  2. Beyni en uygun kesme sıcaklığına (OCT) solüsyonuna gömün ve -20 °C'de donun. 14 μm kalınlığında dilimler halinde bir kriyostat mikrotom ile bölüm beyin ve slaytlar üzerine monte. Bölümleri slaytları daha fazla kullanıma kadar -20 °C'de saklayın.

6. Prusya Mavi boyama

NOT: Prusya mavisi boyama genellikle SPIO etiketli hücrelerde demir içeriğini tespit etmek için kullanılır. Burada, Prusya mavisi boyama, MR Görüntüleri'ndeki hipoyoğun sinyallerin, eserlere değil SPIO etiketli MSC'lere karşılık geldiğini doğrulamak için kullanılır. Prusya mavisi boyama dokularda demir tespit etmek için kullanılan en hassas histokimyasal yöntemlerden biridir ve hücrelerde demir bile tek bir granül tanımlamak için kullanılabilir.

  1. 5 dakika boyunca distile su ile beyin bölümleri slaytlar yıkayın.
  2. Eşit parça hidroklorik asit (%10) içeren boyama çözeltisi, 30 dakika boyunca slaytlar batırarak Prusya mavisi boyama gerçekleştirin ve potasyum ferrosid (%10) kullanıma hemen önce hazırlanır.
  3. Her biri 5 dakika boyunca 3x distile su ile yıkayın. 5 dakika boyunca nükleer hızlı kırmızı ile karşı lekeler ilerler.
  4. Slaytları %95 ve %100 alkolle 2'şer dakika ya da %100'e batırarak bölümleri kademeli olarak kurutun. Rekenatli montaj ortamı ile coverslip ekleyin.
  5. Beyin bölümlerinde lekeli hücreleri tespit etmek için bir ışık mikroskop kullanın.
    NOT: Etiketli hücrelerdeki demir mavi renkli tortular olarak görünür.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İntranazal doğumdan 24 saat sonra, SPIO etiketli MSC'ler, T2*ağırlıklı görüntülerde(Şekil 2B)kortikal yaralanmaya orta lıkta güçlü hipoyoğun alanlar olarak saptandı ve SPIO'nun yaralanma bölgesine hedefli geçişini gösteriyordu. Hipoyoğun sinyallerin bu süre boyunca önemli bir azalma olmaksızın görülebildiğinden, bu göç doğum sonrası 14 güne kadar görünür kalmıştır(Şekil 2B). PBS ile tedavi edilen yaralı hayvanlarda hipoyoğun alanlar görülmedi, gözlenen hipoyoğun alanların SPIO etiketli MSC'lere karşılık geldiğini ve objeleri işaret etmediğini belirterek (Şekil 2A) MRG ile invivo olarak gözlenen etiketli MSC'lerin biyodağılımı 3D rekonstrüksiyon kullanılarak görüntülendi (Şekil 2C,D). MsC'lerin yaralı kortekse geçişi, prusya mavisi boyama ve FITC etiketli SPIO'nun etiketli MSC'lerde histolojik olarak doğrulanmasıyla doğrulandı (Şekil 3A,B).

figure-results-1
Şekil 1: Protokolün şematik akış şeması ve MSC'ler tarafından SPIO alımının in vitro onayı. (A) MSC'ler etiketleme için 24 saat spio ile kuluçkaya yatırıldı. Daha sonra, etiketli MSC'ler intranazal (IN) rotası üzerinden TBI fare modeline teslim edildi. Etiketli MSC'lerin SPIO tarafından yeterli etiketlendiğinin doğrulanması için farklı zaman noktalarında MRG uygulandı. (B) floresan mikroskobu ve (C) confokal mikroskopi ile FITC kanalı kullanılarak sağlandı, çünkü SPIO nano tanecikleri FITC ile etiketlendi. (D) Etiketli MSC'lerin hücre peleti demir yüklemesi nedeniyle koyu renkte göründü. FITC = floresan isotiyosiyanat; SPIO = demir oksit süperparamanyetik parçacıklar; MSCs = mezenkimal kök hücreler; MRI = manyetik rezonans görüntüleme; IN = intranazal; TBI = travmatik beyin hasarı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-2
Şekil 2: Gerçek zamanlı MRG, TBI'ye bağlı farelerin beyinlerinde bulunan yaralanma bölgelerine spio etiketli MSC göçünün saptanmasını ve izlenmesini sağlar. (A) Fareler TBI'ye maruz kaldı, ardından PBS veya SPIO etiketli MSC'ler ile tedavi edildi ve yaralanmadan 24 saat sonra intranazal bir yol ile uygulandı. T2*ağırlıklı görüntülerin koronal bölümleri, 1, 7 ve 14 gün sonra yaralanma bölgesinin kenarında (anahatlı alan) hipoyoğun bir alan (ok ucu) olarak etiketlenmiş MSC'leri gösterdi. PBS ile tedavi edilen farelerde hipoyoğun bir bölge görülmez. (B) Koronal T2*-MRG görüntülerine dayalı yaralanma alanının (yeşil) ve etiketli MSC'lerin (kırmızı) segmentasyon süreci. (C) Fare beyin tedavisinin 3Boyutlu rekonstrüksiyonu, doğumdan 14 gün sonra beyindeki SPIO etiketli MSC'lerin biyodağılımını gösteren T2*ağırlıklı görüntülere dayalı olarak yapılır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-3
Şekil 3: Histolojik analiz, tedavi edilen hayvanların beyinlerinde SPIO etiketli MSC'lerin varlığını doğrular. PBS (kontrol) ve(C)farespi etiketli MSC'ler ile tedavi edilen a(A)farenin beyin bölümlerinin prusya mavisi boyanması, MSC ile tedavi edilen farede (kutulu hücreler, mavi) tespit edilirken, kontrol faresi 14 gün sonra doğum sonrası korteksteki yaralanma yerinde pozitif hücre göstermedi ve MRI gözlemlerini doğruladı. PBS ve (D) fare spio etiketli MSCs ile tedavi edilen a (B) kontrol faresinin korteksin floresan mikroskopi analizi doğumdan 14 gün sonra yapıldı. Analiz, MSC ile tedavi edilen faredeki yaralı kortekste FITC etiketli SPIO pozitif hücrelerin (kutulu hücreler, yeşil) varlığını ortaya çıkardı, ancak PBS ile tedavi edilen farenin korteksinde FITC sinyali gözlenmedi. Ölçek çubukları = 50 μm, aksi belirtilmedikçe. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada açıklanan protokol, MSC'lerin SPIO etiketlemesi ve SPIO etiketli MSC'lerin intranazal sonrası doğumun MRI takibi için genel prosedürleri temsil eder. Protokol, non-invaziv bir yöntem kullanarak beyinde in vivo in-in-in MSC'lerin göç ve biyodağıtım çalışma fırsatı sağlar.

MsCs CNS bozuklukları ve yaralanmalar için kök hücre tabanlı tedaviler için cazip adaylar nedeniyle trofik faktörleri salgılama yeteneği nedeniyle 1) nörorestoratif süreçleri tetiklemek ve 2) nörokoruma sağlamak, yaralanma alanı içinde anti-inflamatuar etkileri nedeniyle9,10,11,12. SPIO etiketli MSC'lerin uzun süreli MRG takibi ve saptanması hücre bölünmesi ile hücreler arası SPIO seyreltilmesi nedeniyle sınırlı olsa da, etiketli hücreler hayvan modellerinin beyinlerinde transplantasyon sonrası birkaç haftaya kadar tespit edilebilir13.

Ayrıca burada transfeksiyon ajanları olmadan dextran ile kaplanmış SPIO nano tanecikleri ile MSCs etiketleme protokolü açıklanmıştır. Diğer protokoller literatürde kullanılmıştır14,15,16. Ancak, her durumda, bu protokoller hücre tipi, SPIO boyutu, kuluçka süresi ve SPIO konsantrasyonu için ayarlanmalıdır. MSC'lerin kondrojenik farklılaşma potansiyelini bozmuş olduğu, ancak SPIO etiketlemesi üzerine adipojenik farklılaşma olmadığı gösterilmiştir17. Bu nedenle SPIO'nun kök hücrelerin farklılaşma gücü üzerindeki etkisini değerlendirmek için kök hücre dağıtımından önce farklılaşma tözlerinin yapılması tavsiye edilir. Bir önceki çalışmada, burada kullanılan aynı SPIO tipi ve konsantrasyonu ile MSC etiketleme mscs osteojenik veya adipojenik farklılaşma potens etkilemediği gösterilmiştir6.

Beyin bozuklukları ve yaralanmalar için terapötik kök hücre tesliminin intranazal yolu kök hücrelerin klinik uygulaması için umut verici bir yaklaşımdır. Ancak, burun boşluğundaki kök hücrelerin davranışlarını belirleyen içsel ve moleküler mekanizmalar belirsizliğini korumaktadır. İntranazal yol küçük moleküllerin teslimi için yaygın olarak araştırılsa da, terapötik sapın büyüklüğü ve biyodağılım davranışı küçük moleküllerden farklıdır. Mevcut protokol, MSC'lerin intranazal doğumdan sonra yaralanma bölgesine doğru göç etme eğiliminde olduğunu göstermektedir.

Burada, SPIO etiketli MSC'leri izlemek için T2*ağırlıklı görüntüler kullanılmıştır. Diğer raporlarde degrade yankı görüntüleme kullanılmıştır. Ancak, septiyer SPIO nedeniyle gradyan eko görüntülemede genellikle duyarlılık görülür. Mevcut protokolde, T2*ağırlıklı görüntülerde SPIO etiketli MSC'leri temsil eden hipoyoğun alanların konumu histolojik inceleme ile saptanan beyin kesitlerinde SPIO'nun konumuyla aynıydı(Şekil 3). Bu, beyindeki SPIO etiketli MSC takibi için T2*ağırlıklı spin eko görüntülemenin yeterli hassasiyetini gösterir.

Özetle, açıklanan protokol beyin yaralanmaları ve bozukluklarının in vivo kök hücre takibi çalışmaları için yararlıdır. In vivo kök hücrelerinin uzunlamasına takibi geleneksel olarak hayvanların birden fazla zaman noktasında kurban edilerek gerçekleştirilmiştir. Mevcut protokol, klinik ortamlarda beyin yaralanmaları ve bozuklukları için kök hücre tabanlı tedavi için potansiyel bir prosedürü temsil eden MSC'lerin doğum ve takibi için non-invaziv ve verimli bir yaklaşım sağlamaktadır.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma Bilim ve Teknoloji Bakanlığı hibe, tarafından desteklenmiştir Tayvan (EN FAZLA 104-2923-B-038-004 -MY2, EN 107-2314-B-038-063 ve MOST 107-2314-B-038-042) ve Taipei Tıp Üniversitesi (TMU 105-AE1-B03, TMU 106-5400-004-T04, 400 106-5310-001-400, DP2-107-21121-01-N-05 ve DP2-108-21121-01-N-05-01).

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Hücre kültürü malzemeleri (Plastikler)ThermoFisher ScientificDeğişirHerhangi bir kaynakla değiştirilebilir
Tek kullanımlık Mikrotom BıçağıVWR95057-832
D-MEM/F-12 (1x) GlutaMAXGIBCO10565-018
Donmuş doku örnekleri için gömme ortamı (O. C. T.)Sakura Finetek4583
Fetal Sığır Serumu (FBS)GIBCO12662-029
Floresan Vahşi Alan MikroskobuOlympusOlympus BX43
ForceptGüzel Bilim Araçları11293-00Cerrahi
Gentamisin (10 mg/mL)GIBCO15710-064
Saç kesme makinesiPet ClubPC-400
Kafa Travması Kontüzyon cihazıHassas Sistemler ve Enstrümantasyon ModeliTBI-0310
Sığır testislerinden HyaluronidazMilliporeSigmaH3506
ITK-SNAP YazılımıPennsylvania Üniversitesi'ndeki Penn Görüntü Hesaplama ve Bilim Laboratuvarı (PICSL) ve Utah Üniversitesi'ndeki Bilimsel Hesaplama ve Görüntüleme Enstitüsü (SCI)ITK-SNAP 3.8.0
Ketamin ( Ketavet)Pfizer778-551
FarelerUlusal Laboratuvar Hayvanları Merkezi, TayvanC57BL6Çalışmada kullanılan vahşi tip fare suşu
MicrodrillNakanishiNE50Kemik penceresini oluşturmak için Çapaklarla birleştirin
MikrotomLeicaRM2265
Fare (C57BL/6) Mezenkimal Kök HücrelerGIBCOS1502-100
MRI tarayıcıBruker Biospec
Fosfat Tampon Salin (PBS)Corning Cellgro / ThermoFisher21-031-CV
Povidon-iyot 7.5Purdue ürünü LPCerrahi ovma
Prusya Mavi LekeAbcamab150674
MakasGüzel Bilim Araçları14084-08Cerrahi
Stereotaksik çerçeveKopf InstrumentsModel 900
Süperparamanyetik demir oksit (SPIO) nanopartiküllerBioPALMolday ION EverGreen, CL-50Q02-6A-51MRI kullanarak in vivo izleme için kök hücre etiketleme
Sütür monofilamentEthiconG697Sütür
ZamanlayıcıWisewindHerhangi bir kaynakla değiştirilebilir
TrypLEGIBCO12604-013
Xylazine (Rompun)BayerQN05 cm92
ile%

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Pelled, G., et al. Smad8/BMP2-engineered mesenchymal stem cells induce accelerated recovery of the biomechanical properties of the Achilles tendon. Journal of Orthopedic Research. 30 (12), 1932-1939 (2012).
  2. Shahror, R. A., et al. Transplantation of Mesenchymal Stem Cells Overexpressing Fibroblast Growth Factor 21 Facilitates Cognitive Recovery and Enhances Neurogenesis in a Mouse Model of Traumatic Brain Injury. Journal of Neurotrauma. , (2019).
  3. Danielyan, L., et al. Intranasal delivery of cells to the brain. European Journal of Cell Biology. 88 (6), 315-324 (2009).
  4. Karussis, D., et al. Safety and immunological effects of mesenchymal stem cell transplantation in patients with multiple sclerosis and amyotrophic lateral sclerosis. Archives in Neurology. 67 (10), 1187-1194 (2010).
  5. Danielyan, L., et al. Intranasal delivery of bone marrow-derived mesenchymal stem cells, macrophages, and microglia to the brain in mouse models of Alzheimer's and Parkinson's disease. Cell Transplant. 23, Suppl 1 123-139 (2014).
  6. Shahror, R. A., Ali, A. A. A., Wu, C. C., Chiang, Y. H., Chen, K. Y. Enhanced Homing of Mesenchymal Stem Cells Overexpressing Fibroblast Growth Factor 21 to Injury Site in a Mouse Model of Traumatic Brain Injury. International Journal of Molecular Science. 20 (11), (2019).
  7. Yushkevich, P. A., et al. User-guided 3D active contour segmentation of anatomical structures: significantly improved efficiency and reliability. Neuroimage. 31 (3), 1116-1128 (2006).
  8. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564(2012).
  9. Li, Y., Chopp, M. Marrow stromal cell transplantation in stroke and traumatic brain injury. Neuroscience Letters. 456 (3), 120-123 (2009).
  10. Aertker, B. M., Bedi, S., Cox, C. S. Strategies for CNS repair following TBI. Experimental Neurology. 275, Pt 3 411-426 (2016).
  11. Ohtaki, H., et al. Stem/progenitor cells from bone marrow decrease neuronal death in global ischemia by modulation of inflammatory/immune responses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (38), 14638-14643 (2008).
  12. Mahmood, A., Lu, D., Chopp, M. Intravenous administration of marrow stromal cells (MSCs) increases the expression of growth factors in rat brain after traumatic brain injury. Journal of Neurotrauma. 21 (1), 33-39 (2004).
  13. Hoehn, M., et al. Monitoring of implanted stem cell migration in vivo: a highly resolved in vivo magnetic resonance imaging investigation of experimental stroke in rat. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (25), 16267-16272 (2002).
  14. Reddy, A. M., et al. In vivo tracking of mesenchymal stem cells labeled with a novel chitosan-coated superparamagnetic iron oxide nanoparticles using 3.0T MRI. Journal of Korean Medical Science. 25 (2), 211-219 (2010).
  15. Roeder, E., et al. Dose-response of superparamagnetic iron oxide labeling on mesenchymal stem cells chondrogenic differentiation: a multi-scale in vitro study. PLoS ONE. 9 (5), e98451(2014).
  16. Schafer, R., et al. Labeling of human mesenchymal stromal cells with superparamagnetic iron oxide leads to a decrease in migration capacity and colony formation ability. Cytotherapy. 11 (1), 68-78 (2009).
  17. Kostura, L., Kraitchman, D. L., Mackay, A. M., Pittenger, M. F., Bulte, J. W. Feridex labeling of mesenchymal stem cells inhibits chondrogenesis but not adipogenesis or osteogenesis. NMR in Biomedicine. 17 (7), 513-517 (2004).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Manyetik Rezonans G r nt lemeH cre EtiketlemeFloresan MikroskopiKontroll Kortikal DarbeT2 Y ld z A rl klPrusya Mavisi Boyama

İlgili makaleler