Travmatik Beyin Hasarı Murine Modelinde İntranazal Doğum sonrası MRG kullanarak Süperparamanyetik Demir Oksit etiketli Mezenkimal Kök Hücrelerin Takibi

Mezenkimal kök hücreler (MSC) insanlarda merkezi sinir sistemi (CNS) bozuklukları ve yaralanmalarının tedavisinde kök hücre bazlı tedaviler için cazip adaylardır. Ayrıca, MSCs yaralanma sitelerinde terapötik proteinlerin teslimi için bir araç olarak kullanılmıştır^1,2. Son yıllarda, cns bozukluklarının kök hücre temelli tedavileri için 1) hücre tesliminin yeni yollarını ve 2) hücre takibini sağlamak için umut verici yenilikler geliştirilmiştir. Kök hücrelerin beyne intranazal olarak verilmesi, hücrelerin kribriform plakayı atlayıp parenkim yolu üzerinden kısmen koku alma ampulüne girme yeteneğine bağlıdır³. Spio nano partikülleri manyetik rezonans görüntüleme (MRG) için güvenli problar olduğundan ve MRI^3,4,5tarafından MSC'lerin non-invaziv hassas uzunlamasına izleme izin, intranazal doğum ve süperparamanyetik demir oksit (SPIO) nano tanecikleri ile MSCs etiketleme kombinasyonu, CNS bozukluklarının tedavisinde MSCs klinik uygulamalar için umut verici bir yaklaşım temsil eder . Ayrıca intranazal doğum, kısa bir süre içinde tekrarlanan bir uygulama sağlayan güvenli ve non-invaziv bir yoldur.

Bu makalede, SPIO etiketli hücreler ve MRG kullanan travmatik beyin hasarı (TBI) bir fare modelinde vivo post-intranazal doğumda MSC'leri izlemek için son derece hassas ve non-invaziv bir teknik açıklanmaktadır. SPIO etiketlemenin önemli bir avantajı da, hücrelerin etkin ve non-invaziv olarak izlenmesini mümkün kılan, MRG ile dokudaki SPIO'nun hassas tespitidir. Burada kullanılan SPIO nano tanecikleri ticari olarak mevcuttur ve bir floresan izotiyoyanat ile etiketlenmiş (FITC) florofor, hangi immünboyama veya ek işleme olmadan dokuda SPIO tespiti için izin verir. Ayrıca, uzunlamasına gerçek zamanlı izleme yapmak ve teslim MSCs biyodağılımı araştırmak mümkündür.

Bu protokolde hayvanları içeren tüm prosedürler Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylandı, Taipei Tıp Üniversitesi hayvan kullanımı için Etik Komitesi onayı ile (onay no. BAĞ-2018-0574; 15.03.2019).

1. SPIO Nano tanecikleri ile MSC'lerin etiketlemesi

1. MSC'leri SPIO ile etiketlemek için, 6 mL etiketleme ortamı (Dulbecco'nun modifiye Eagle ortamında (DMEM'de 25 μg/mL SPIO) fetal sığır serumu olmadan [FBS]) MSC içeren bir T75 şişesine (%80 birleşme) ekleyin.
2. Hücreleri etiketleme ortamıyla bir CO₂ kuluçka makinesinde (37 °C, %5 CO₂₎titremeden kuluçkaya yatırın. 24 saat sonra, vakuma bağlı plastik uçlu steril bir Pasteur pipeti kullanarak etiketleme ortamını nazikçe çıkarın. Hücreleri monolayer 2x 6 mL fosfat tamponlu salin (PBS) ile yıkayın.
   1. Hücrelerin başarılı bir şekilde etiketlenip etiketlenmediğini belirlemek için, flüoresan mikroskobu nisbeten veya konfokal mikroskop altında etiketlenmiş hücreleri kontrol edin, SPIO bir florofor la etiketlendi mi (yani, burada kullanılanlar gibi); Şekil 1B,C). Alternatif olarak, hücreler için Prusya mavisi boyama gerçekleştirin (bkz. boyama protokolü için 6.2-6.4 adımlarını).
3. 3 mL tripsin ve 37 °C'de inkübün ile tedavi ile yapışık hücreleri hasat edin. 5 dakika kuluçkadan sonra, trypsinin inaktive etmek için %10 FBS (v/v) ile 7 mL önceden ısıtılmış DMEM ortam ekleyin. 15 mL konik tüp içine bir pipet kullanarak hücre süspansiyon toplayın.
4. Hücre süspansiyonuna 300 x g'de 5 dk. Süpernatant'ı atın ve PBS'deki hücre peletini yeniden askıya alın. Trypan mavi boya ve hemositometre kullanarak canlı hücreleri sayın.
   NOT: Etiketli hücrelerin hücre peleti demir yüklemesi nedeniyle koyu renk olarak görünür (Şekil 1D). Bu protokol MSC etiketleme ve MRGörüntüleme için geçerlidir. MSC etiketleme 6 yordamı^için yordam daha önce optimize edilmiş ve in vivo izleme etiketli MSC'ler hazırlamak için sadece adımlar burada yer almaktadır, in vivo izleme odak noktası olduğundan. Diğer hücre türlerinin kültüre alınması ve etiketlemesi için protokol araştırmacı tarafından optimize edilmelidir.
5. PBS kullanarak hücre konsantrasyonu 18 μL PBS (veya intranazal doğum prosedüründe kullanılacak toplam hacim) 150.000 hücre (veya yeterli MRG sinyali ile sonuçlanan bir sayı) ayarlayın.
   NOT: PBS'nin 150.000 hücre/18 μL'den daha yüksek bir hücre konsantrasyonunun hücre agregasyonuna yol açtığı ve intranazal doğumun verimliliğini etkileyebileceği fark edilmiştir. İntranazal doğum için daha fazla sayıda hücre gerekiyorsa, intranazal uygulama non-invaziv bir işlem olduğu için hücre süspansiyonunun toplam hacmini artırın ve intranazal yönetimlerin sayısını artırın ve birden fazla dozlama mümkündür.

2. Kontrollü Kortikal Etki (CCI) Yaralanması

NOT: Bu protokolde erkek C57 BL/6 fareler (7-8 haftalık) 12/12 h açık/karanlık bir döngü içinde tutuldu ve reklam libitum gıda ve suya erişim sağladı.

1. CcI yaralanması için her fare hazırlamak için, zolazepam (50 mg / kg) ve ksilazin (20 mg / kg) intraperitoneal (i.p.) enjeksiyon (1 mL / kg) ile anestezi kokteyl uygulayın. Anestezi derinliğinin, parmak ucuyanıtı eksikliğinden yeterli olduğundan emin olun. Alternatif olarak, 60 s için% 2-4 izofluran ile birlikte bir odaya fareyerleştirin.
2. Elektronik bir saç makası kullanarak kulakların arasındaki kafatasının sırt yüzeyinin kürktıraş. İyotla ıslatılmış steril pamuklu bir bez kullanarak tıraş alanını birkaç kez temizleyin. İyot temizlemek için % 70 etanol batırılmış bir pamuklu bez kullanın.
3. Anestezili fareyi stereotaktik çerçeveye yerleştirin ve kulak çubukları ve burun çubuklarını kullanarak fareyi sabittutun. Kafatası yüzeyine erişmek için steril makas kullanarak traş deride bir midsagittal kesi (yaklaşık 2,5 cm) olun.
4. Kafatası ortaya çıkarmak için bir pamuk ped kullanarak kemik doku çıkarın. Kafatası yüzeyini %3 H₂O_2'ye batırılmış bir pamuk lu bez kullanarak 10 s'ye temizleyin, ardından kuru bir pamuk pedle temizleyin.
   NOT: Kafatası dikişleri ve hem bregma ve lambda artık kolayca tespit edilebilir.
5. CCI yaralanması için kafatası yüzeyinde tercih edilen koordinatları belirleyin ve bir kalem veya uygun marker kullanarak koordinatların etrafına bir daire (4 mm çapında) çizin.
   NOT: Bu protokolde CCI indüksiyonu için anteeroposterior (AP) -2.0 mm ve mediolateral (ML) +1.5 mm koordinatları kullanıldı.
6. İşaretli dairedeki kafatasını inceltmek için mikro matkap ve yuvarlak çapak (0,5 mm çapında) kullanın. Delme sırasında basınç uygulamaktan kaçının, kemik yoluyla delme beyin parankim hasara neden olabilir gibi. Temiz ve kuru pamuklu bir bez kullanarak kemik tozunu temizleyin.
7. Dura mater'i sağlam tutarken ortaya çıkarmak için steril ince terlikler kullanarak kemik kapağını hafifçe çıkarın. Fareyi yaralanma öncesi hazırlık için kullanılan stereotaktik çerçeveden çıkarın ve CCI aygıtının stereotaktik çerçevesine yerleştirin.
8. Kulak çubuklarını ve burun çubuklarını kullanarak farenin başını stabilize edin. Farenin başının rostral-kaudal yönde düz olduğundan emin olun ve gerekirse burun çubuklarını ayarlayın.
9. Kontrol kutusundaki talimatları uygulayın ve darbe ucunu açık kortikal yüzeye sıfırlayın. Darbeci ucun, darbecinin tabanındaki X ve Y kontrol tekerlekleri kullanılarak etkilenecek istenilen korteks koordinatlarının hemen üzerinde hizalandığından emin olun.
10. Farede hafif yaralanmalara neden olmak için kontrol kutusunu 5 m/s hız, 250 ms çalışma süresi ve 1 mm yaralanma derinliği ile deneme parametrelerini ayarlayın.
11. Kontrol kutusundaki ''impact'' düğmesine basarak yaralanmaya neden olun. Steril pamuklu bir bez kullanılarak oluşan herhangi bir kanamayı temizle.
12. Fareyi stereotaktik çerçeveden çıkarın ve ipek cerrahi dikişleri kullanarak kesikapatın. Fare MRI için manyetik alana maruz kalacağı için cerrahi alanı kapatmak için metal klipsler kullanmayın.
13. Enfeksiyonları önlemek için topikal antibiyotikler (bacitracin neomisin) cerrahi bölgeye uygulayın. Fareyi ısıtma yastığında tutun ve kurtarma aşamasında yakından izleyin.
14. Ketoprofen uygulaması çalışma hedefleri ile çelişmediği sürece, ameliyattan sonra 3 gün boyunca her gün ketoprofen (2.5 mg/kg, IP) uygulayın.

3. İntranazal Doğum

1. CCI sonrası 1 gün indüksiyonda, i.p. enjeksiyonu ile zolazepam (50 mg/kg) ve ksilazin (20 mg/kg) anestezi kokteylini uygulayın. Farenin, parmak kıstırma yanıtı eksikliği nden derinden anestezi yaptığından emin olun.
2. Hyaluronidaz tedavisi ile MSCs intranazal teslim için fare hazırlayın.
   1. Farenin scruff kapmak ve kafatası hareketsiz iken sıkıca sırtını açın. Steril PBS'de hyaluronidaz içeren bir pipetin ucunu farenin burun deliğini 45° açıyla yakınına yerleştirin.
   2. Her burun deliğinde 3 μL hyaluronidase süspansiyon uygulayın. Fareyi hareketsiz ve 5 dakika boyunca temiz bir ped üzerinde yukarı bakacak şekilde tutun. Hyaluronidaz tedavisini 4x (toplam 100 U hyaluronidase süspansiyonu) tekrarlayın.
3. Hyaluronidase tedavisinden sonra, tedavi edilen fareyi 30 dk kadar bakan temiz bir ped üzerinde tutun.
4. MSC'leri beyne teslim etmek için fareyi adım 3.2.1'de açıklandığı gibi sıkıca tutun. 3 s aralıklı 3 μL/burun deliği MSC süspansiyonuyguluyor. Örnek damlatamamen kaybolana kadar fareyi 30 s boyunca aynı pozisyonda tutun.
   NOT: Uygulama sırasında hava kabarcıkları oluşturmaktan kaçının.
5. 3x'e kadar 2 dk arayla yönetimi tekrarlayın.
   NOT: Teslim edilecek toplam hücre sayısı 150.000'dir, böylece hücre süspansiyonunun 18 μL'si her burun deliği için 3 μL dozda, her biri 3 kat daha fazla dozda teslim edilebilir.
6. Fareyi kafesine geri döndürün ve anesteziden tamamen iyileşene kadar yakından izleyin.

4. In Vivo Manyetik Rezonans Görüntüleme

NOT: Beyin dokusunun histolojik boyama daha önce intranazal uygulama dan sonra kök hücrelerin başarılı doğum onaylamak için kullanılmıştır. Ancak, bu yöntem sadece bir çalışmanın bitiş noktası olarak kullanılabilir, longitudinally değil. Terapötik kök hücreleri etiketlemek için MRG probları kullanmak, MRG kullanarak hücrelerin uzunlamasına, non-invaziv, in vivo takibine olanak sağlayacaktır. Daha da önemlisi, bu protokol gerekli hayvan sayısını etkin bir şekilde azaltır. Bu protokolde, MSC'lerin 1, 7 ve 14'ü doğum sonrası 1, 7 ve 14'te MRG taraması yapıldı.

1. Fareyi MRG taraması için hazırlamak için fareyi izoflurane ile anestezi edin (indüksiyon için 1 L/dk O_2'de %5 izofluran, bakım için %1,5-2 izofluran). Farenin gerekli anestezi düzeyine ulaştığından emin olmak için bir parmak ucutu yapın.
2. Fareyi görüntüleme tutucunun üzerine yerleştirin ve musluklar veya başka bir uygun yöntem kullanarak konumunu sabittutun. Tutucuyu MR bobininin (7 T/40 cm mıknatıs) merkezine taşıyın ve izleme bağlantısını bağlayın.
3. Spin-echo dizisi kullanarak T2*ağırlıklı taramalar elde etmek için tekrarlama süresini (TR) 1500 ms'e, yankı süresini (TE) 2,8 ms'e ayarlayın.
4. 16 mm x 16 mm görüş alanı (FOV), 128 x 128 satın alma matrisi (MTX) ve dilim kalınlığını dört sinyal ortalaması ve 90° çevirme açısı (FA) ile 0,75 x 0,8 mm² kullanın.
5. Taramaları tamamladıktan sonra fare tutucuyu MRBobin merkezinden geri çekin. Fareyi kafesine geri döndürün ve anesteziden tamamen iyileşene kadar yakından izleyin.
6. T2*ağırlıklı görüntülerde etiketli MSC'leri izlemek ve ölçmek için ITK-SNAP yazılımını (sürüm 3.8.0)⁷kullanın.
   1. MRI taramasının ham verilerini MRI makinesinin bilgisayarından DICOM (tıpta dijital görüntüleme ve iletişim) formatında analiz için kullanılan bilgisayara aktarın.
   2. ITK-SNAP yazılımını çalıştırın ve Dosya düğmesine tıklayarak MR görüntülerini yükleyin. Ardından menüde Ana Resmi Aç'a tıklayın. Ekran penceresindeki Resmi Aç düğmesine basın ve Gözat düğmesini kullanarak MR görüntülerini bulun ve açın.
      NOT: MR görüntülerinde etiketli hücrelerin görselleştirilmesi hipoyoğun alanlar olarak görünecektir. Görüntü kontrastı ayarlanması gerekiyorsa, Araçlar | Görüntü Kontrastı.
   3. Segmentasyon etiketleri bölümünde Active Label'ı seçerek hipoyoğun alanların ve lezyonun veya diğer beyin parçalarının segmentasyonlarını oluşturun. Farklı segmentler için farklı etiket renkleri kullanın (birden fazla parçanın segmentasyonu gerekiyorsa).
   4. SPIO etiketli MSC'leri temsil eden hipoyoğun alanların etrafını çizmek için Ana Araç Çubuğu'ndaki Çokgen aracını kullanın. MRI görüntüsünün altında bulunan Kabul Et'iseçin. Parçalı alanlar, belirli bir kesime atanan etkin etiketin aynı rengi olarak görünür. Tüm MR Dilimleri için bu segmentasyon adımLarını tekrarlayın.
   5. ITK-SNAP araç kutusunun altındaki Segmentasyon Etiketleri bölümünde bulunan 3B Araç Çubuğu'nunaltındaki Neşter Aracı'nı seçerek tüm beyindeki MSC dağılımını temsil edecek segmentli alanların 3B haritasını geliştirin. Ardından, oluşturulan 3B haritanın altındaki Kabul et'e basın.
   6. Etiketli hücreleri temsil eden parçalı hipoyoğun alanların nicel analizini (hacim ve yoğunluk ortalaması) gerçekleştirmek için, üst paneldeki Segmentasyon düğmesine basın ve Birim ve İstatistik'iseçin.

5. Fare Beyninin Fiksasyonu ve Kriyodinasyon

1. Fare beynini düzeltmek için, daha önce açıklandığı gibi, son MRI taraması sonrasında% 4 paraformaldehit (PFA) ile transkardiyak perfüzyon gerçekleştirmek⁸.
   1. Kafasını kes ve^beyni8. Beyni 4 °C'de en az 48 saat boyunca %4 PFA ile düzeltin.
   2. Beyin çözeltinin dibine banına kadar 4 °C'de %30 sakaroz çözeltisine daldırarak beyni kurutun.
2. Beyni en uygun kesme sıcaklığına (OCT) solüsyonuna gömün ve -20 °C'de donun. 14 μm kalınlığında dilimler halinde bir kriyostat mikrotom ile bölüm beyin ve slaytlar üzerine monte. Bölümleri slaytları daha fazla kullanıma kadar -20 °C'de saklayın.

6. Prusya Mavi boyama

NOT: Prusya mavisi boyama genellikle SPIO etiketli hücrelerde demir içeriğini tespit etmek için kullanılır. Burada, Prusya mavisi boyama, MR Görüntüleri'ndeki hipoyoğun sinyallerin, eserlere değil SPIO etiketli MSC'lere karşılık geldiğini doğrulamak için kullanılır. Prusya mavisi boyama dokularda demir tespit etmek için kullanılan en hassas histokimyasal yöntemlerden biridir ve hücrelerde demir bile tek bir granül tanımlamak için kullanılabilir.

1. 5 dakika boyunca distile su ile beyin bölümleri slaytlar yıkayın.
2. Eşit parça hidroklorik asit (%10) içeren boyama çözeltisi, 30 dakika boyunca slaytlar batırarak Prusya mavisi boyama gerçekleştirin ve potasyum ferrosid (%10) kullanıma hemen önce hazırlanır.
3. Her biri 5 dakika boyunca 3x distile su ile yıkayın. 5 dakika boyunca nükleer hızlı kırmızı ile karşı lekeler ilerler.
4. Slaytları %95 ve %100 alkolle 2'şer dakika ya da %100'e batırarak bölümleri kademeli olarak kurutun. Rekenatli montaj ortamı ile coverslip ekleyin.
5. Beyin bölümlerinde lekeli hücreleri tespit etmek için bir ışık mikroskop kullanın.
   NOT: Etiketli hücrelerdeki demir mavi renkli tortular olarak görünür.

İntranazal doğumdan 24 saat sonra, SPIO etiketli MSC'ler, T2*ağırlıklı görüntülerde(Şekil 2B)kortikal yaralanmaya orta lıkta güçlü hipoyoğun alanlar olarak saptandı ve SPIO'nun yaralanma bölgesine hedefli geçişini gösteriyordu. Hipoyoğun sinyallerin bu süre boyunca önemli bir azalma olmaksızın görülebildiğinden, bu göç doğum sonrası 14 güne kadar görünür kalmıştır(Şekil 2B). PBS ile tedavi edilen yaralı hayvanlarda hipoyoğun alanlar görülmedi, gözlenen hipoyoğun alanların SPIO etiketli MSC'lere karşılık geldiğini ve objeleri işaret etmediğini belirterek (Şekil 2A) MRG ile invivo olarak gözlenen etiketli MSC'lerin biyodağılımı 3D rekonstrüksiyon kullanılarak görüntülendi (Şekil 2C,D). MsC'lerin yaralı kortekse geçişi, prusya mavisi boyama ve FITC etiketli SPIO'nun etiketli MSC'lerde histolojik olarak doğrulanmasıyla doğrulandı (Şekil 3A,B).

Şekil 1: Protokolün şematik akış şeması ve MSC'ler tarafından SPIO alımının in vitro onayı. (A) MSC'ler etiketleme için 24 saat spio ile kuluçkaya yatırıldı. Daha sonra, etiketli MSC'ler intranazal (IN) rotası üzerinden TBI fare modeline teslim edildi. Etiketli MSC'lerin SPIO tarafından yeterli etiketlendiğinin doğrulanması için farklı zaman noktalarında MRG uygulandı. (B) floresan mikroskobu ve (C) confokal mikroskopi ile FITC kanalı kullanılarak sağlandı, çünkü SPIO nano tanecikleri FITC ile etiketlendi. (D) Etiketli MSC'lerin hücre peleti demir yüklemesi nedeniyle koyu renkte göründü. FITC = floresan isotiyosiyanat; SPIO = demir oksit süperparamanyetik parçacıklar; MSCs = mezenkimal kök hücreler; MRI = manyetik rezonans görüntüleme; IN = intranazal; TBI = travmatik beyin hasarı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Gerçek zamanlı MRG, TBI'ye bağlı farelerin beyinlerinde bulunan yaralanma bölgelerine spio etiketli MSC göçünün saptanmasını ve izlenmesini sağlar. (A) Fareler TBI'ye maruz kaldı, ardından PBS veya SPIO etiketli MSC'ler ile tedavi edildi ve yaralanmadan 24 saat sonra intranazal bir yol ile uygulandı. T2*ağırlıklı görüntülerin koronal bölümleri, 1, 7 ve 14 gün sonra yaralanma bölgesinin kenarında (anahatlı alan) hipoyoğun bir alan (ok ucu) olarak etiketlenmiş MSC'leri gösterdi. PBS ile tedavi edilen farelerde hipoyoğun bir bölge görülmez. (B) Koronal T2*-MRG görüntülerine dayalı yaralanma alanının (yeşil) ve etiketli MSC'lerin (kırmızı) segmentasyon süreci. (C) Fare beyin tedavisinin 3Boyutlu rekonstrüksiyonu, doğumdan 14 gün sonra beyindeki SPIO etiketli MSC'lerin biyodağılımını gösteren T2*ağırlıklı görüntülere dayalı olarak yapılır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Histolojik analiz, tedavi edilen hayvanların beyinlerinde SPIO etiketli MSC'lerin varlığını doğrular. PBS (kontrol) ve(C)farespi etiketli MSC'ler ile tedavi edilen a(A)farenin beyin bölümlerinin prusya mavisi boyanması, MSC ile tedavi edilen farede (kutulu hücreler, mavi) tespit edilirken, kontrol faresi 14 gün sonra doğum sonrası korteksteki yaralanma yerinde pozitif hücre göstermedi ve MRI gözlemlerini doğruladı. PBS ve (D) fare spio etiketli MSCs ile tedavi edilen a (B) kontrol faresinin korteksin floresan mikroskopi analizi doğumdan 14 gün sonra yapıldı. Analiz, MSC ile tedavi edilen faredeki yaralı kortekste FITC etiketli SPIO pozitif hücrelerin (kutulu hücreler, yeşil) varlığını ortaya çıkardı, ancak PBS ile tedavi edilen farenin korteksinde FITC sinyali gözlenmedi. Ölçek çubukları = 50 μm, aksi belirtilmedikçe. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.