Yöntem makalesi

Murin Nörogenezi Sırasında Çentik Sinyal Dinamiğinin Gerçek Zamanlı Biyolüminesans Görüntülemesi

6.4K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/60455

⸱

12 Aralık 2019

 , 
1Institute for Frontier Life and Medical Sciences, Kyoto University, 2Institute for Integrated Cell-Material Sciences (iCeMS), Kyoto University, 3Kyoto University Graduate School of Medicine, 4Kyoto University Graduate School of Biostudies

Bu makalede

Özet

Nöral kök/progenitor hücreleri, hücresel olayların farklı sonuçlarına yol açan Çentik sinyal bileşenlerinin çeşitli ifade dinamiklerini sergilerler. Bu tür dinamik ifade, gen ekspresyonlarında hızlı değişimlerin görselleştirilmesini sağlayan son derece hassas biyolüminesans görüntüleme sistemi kullanılarak statik analizle değil, gerçek zamanlı izleme ile ortaya çıkabilir.

Özet

Çentik sinyalizasyonu, nöral kök/progenitor hücrelerinin hücre-hücre etkileşimleri tarafından bakımını düzenler. Notch sinyalbileşenleri dinamik bir ifade sergiler. Çentik sinyal efektörü Hes1 ve Notch ligand Delta-like1 (Dll1) nöral kök/progenitor hücrelerinde salınımlı bir şekilde ifade edilir. Bu genlerin salınım lı ekspresyon süresi çok kısa olduğundan (2 saat), döngüsel ekspresyonlarını izlemek zordur. Gen ekspresyonundaki veya protein dinamiğindeki bu kadar hızlı değişimleri incelemek için hızlı yanıt muhabirleri gereklidir. Hızlı olgunlaşma kinetiği ve yüksek duyarlılığı nedeniyle, biyolüminesans muhabiri luciferase canlı hücrelerdeki hızlı gen ekspresyonu değişikliklerini izlemek için uygundur. Organizatör aktivitesini izlemek için dengesi bozulmuş bir luciferase muhabiri ve protein dinamiklerini tek hücre çözünürlükte görselleştirmesi için luciferase-erimiş bir muhabir kullandık. Bu biyolüminesans muhabirleri hızlı ciro göstermek ve çok zayıf sinyaller üretmek; bu nedenle, bu tür silik sinyalleri tespit etmek için son derece hassas bir biyolüminesans görüntüleme sistemi geliştirdik. Bu yöntemler, canlı hücre ve dokularda çeşitli gen ekspresyonu dinamiklerini izlememizi sağlar, bunlar gerçek hücresel durumları anlamamıza yardımcı olacak önemli bilgilerdir.

Giriş

Memeli beyin nöronlar ve glial hücrelerin çeşitli çok sayıda oluşur. Tüm hücreler nöral kök / progenitor hücreleri (NPCs), ilk sayılarını genişletmek için çoğalır, sonra nöronlar içine ayırt etmeye başlar ve nihayet glialhücrelereneden oluşturulur 1,2,3,4,5. Hücreler nöronlara farklılaştıktan sonra çoğalamazlar veya sayılarını artıramazlar ve bu nedenle ndc'lerin daha sonraki aşamalara kadar sürdürülmesi önemlidir. Hücre-hücre etkileşimleri ile çentik sinyal6,7NPCs korunmasında önemli bir rol oynar. Çentik ligandları, komşu hücrelerin yüzeyinde ki membran proteini Çentik ile etkileşime girer ve Çentik proteinini aktive eder. Aktivasyon dan sonra, Notch proteinproteozis oluşur, bu nedenle çekirdekiçinehücre zarından Notch (NICD) hücre içi etki alanı serbest 8,9,10. Çekirdekte NICD, Hes1 ve Hes5 'in(Hes1/5)promotör bölgelerine bağlanır ve bu genlerin ekspresyonunu aktive eder. Hes1/5 pronöral genlerin ekspresyonunu bastırmak Ascl1 ve Neurogenin1 (Neurog1/2)11,12,13,14. Pronörgenler nöronal farklılaşmayı indüklediği için, Hes1/5 NP'lerin korunmasında önemli rol oynar. Ayrıca, pronörgenler Notch ligand Delta-like1 (Dll1) ekspresyonunu aktive edebildiği için, Hes1/5 de Dll1ekspresyonunu bastırabilir. Bu nedenle, Dll1 ifadesi Komşu hücrelerin Notch sinyalizasyon yoluyla Dll1 için negatif olmasına yol açar. Bu şekilde, hücreler aynı kaderi takip komşu hücreleri inhibe, lateral inhibisyon olarak bilinen bir fenomen8. Gelişmekte olan beyinde, lateral inhibisyon çeşitli farklı hücre tipleri üreten bir rol oynar.

Tek hücre düzeyinde gerçek zamanlı görüntüleme NPCs15,16,17Çentik sinyal bileşenlerinin dinamik ifadeler ortaya koymaktadır. Çentik sinyalhes1ifadesini aktive eder , ama Hes1 protein kendi organizatörü bağlanır ve kendi ifadesini bastırır. Ayrıca, Hes1 son derece kararsız bir proteindir, bu ubikitin-proteozom yolu tarafından bozulur; bu nedenle, kendi organizatörü baskı sadece kısa ömürlü ve daha sonra transkripsiyon tekrar başlar. Bu şekilde, Hes1 ifadesi 2 h döngüsü18hem transkripsiyon ve çeviri düzeylerinde salınımlar . Hes1 salınımlı ekspresyonu, sırayla, ascl1 gibi downstream hedef genlerin salınım ekspresyonu indükler, Ascl1gibi , Neurog2, ve Dll1, periyodik baskı yoluyla15,16,17,19. Pronör genler nöronal farklılaşmaya neden olabilirken, salınımlı ekspresyonları nöronal farklılaşma için yeterli değildir; yerine onların sürekli ifade nöronal farklılaşma için gereklidir. Pronör genlerin salınımlı ekspresyonu nöronal farklılaşma yı neden olmaktan ziyade NCD'lerin korunması için önemlidir14,15,16. Dll1 ekspresyonu nörogenez ve somitogenez gibi çeşitli morfogenez sırasında hem transkripsiyon hem de çeviri düzeyinde salınım lar. Dll1 dinamik ekspresyonu normal morfogenez ve Dll1 sürekli ekspresyonu için önemlidir nörogenez ve somitogenez17kusurları indükler. Bu bulgular, gen ekspresyonu ve protein kinetik dinamiklerinin çeşitli gelişimsel olayların düzenlenmesi nde sahip olduğu önemli işlevi göstermektedir (örneğin, farklı ifade dinamiği hücresel davranışlarda farklı çıkışlar üretir).

Çentik sinyalleme dinamiklerini analiz etmek için doku ve hücrelerin statik analizi sürekli değiştiği için yetersizdir. Tek hücrelerin gerçek zamanlı görüntüleme gen ekspresyonundaki dinamikleri ortaya çıkarmak için güçlü bir araçtır. Çentik sinyal moleküllerinin dinamik ekspresyonu 2-3 saat süre içinde hızlı döngüsel tepkilere uğrar. Bu hızlı periyodik ifade gerçek zamanlı izleme için iki zor sorun sunar: (1) moleküllerin ekspresyonu düşük seviyelere bastırılır ve (2) hızlı ciro hızlı yanıt muhabirleri gerektirir. Bu sorunların üstesinden gelmek için, daha önce bir biyolüminesans gerçek zamanlı görüntüleme yöntemi20geliştirdi. Biyolüminesans muhabiri floresan muhabirlere göre daha yüksek duyarlılığa ve daha kısa olgunlaşma süresine sahip olduğundan, bu strateji canlı hücrelerdeki hızlı dinamikleri izlememizi sağlar. Gerçek zamanlı görselleştirmeyi kullanarak, daha önce düşündüğümüzden daha fazla genin dinamik ifade sergilediğini bulduk. Buna ek olarak, canlı hücrelerde ekspresyon ve protein dinamiklerini gösteren raporların sayısı ve çeşitli biyolojik olaylarda bu dinamiklerin önemi artmıştır, gen ifadelerinde dinamiklerin temel bir rolü düşündüren21,22.

Bu raporda, notch ligand Dll1'in npt'lerde hem ayrıştırılmış kültürlerde hem de kortikal dilim kültürlerinde ifadesini görselleştirmenin bir yolunu açıklıyoruz. Dll1 transkripsiyonunun dinamiklerini tek hücre seviyelerinde izlemek için, dll1 organizatörü güdümlü dengesiz luciferase muhabiri pDll1-Ub-Fluc muhabiri nitransgenik farelerin embriyonik telensefalonundan elde edilen ndc'lerin ayrıştırılmış kültürlerini oluşturduk. Dll1 protein dinamiklerini vivo olarak izlemek için, Dll1-Fluc füzyon muhabirini korteksteki NPC'lere tanıttık ve kortikal dilim kültürlerinde NPC'lerde muhabirin ifadesini görselleştirdik. Gerçek zamanlı görüntüleme, yüksek zamansal çözünürlükte canlı hücrelerdeki gen ekspresyonu ve protein dinamiğinin çeşitli özelliklerini yakalamamızı sağladı.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Hayvan denekleri de dahil olmak üzere tüm prosedür, Kyoto Üniversitesi Frontier Life and Medical Sciences Enstitüsü'ndeki Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanmıştır.

1. Biyolüminesans muhabirleri

NOT: Luciferase muhabiri, bozulma sinyalini kaynaştırarak organizatör aktivitesinin hızlı dinamiklerini ölçmek için uygundur. Ayrıca, luciferase füzyon muhabiri tek hücredeki protein dinamiklerinin izlenmesini sağlar. Muhabirlerin her iki türü de mono katmanlı kültür (ayrışma kültürü) ve doku kültürü (dilim kültürü) deneyi için kullanılabilir.

  1. Dll1 organizatöraktivitesi17 izleme muhabiri
    NOT: Gen ekspresyonundaki hızlı değişimleri izlemek için hızlı tepki ve kararsız muhabir esastır. Firefly luciferase (Fluc) fluorescein muhabirleri ile karşılaştırıldığında hızlı olgunlaşma gösterir. Ubiquitin erimiş luciferase muhabiri (Ub-Fluc) hızlı bozulma ve hızlı ciro gösterir çünkü, çok canlı hücrelerde dinamik gen ekspresyonu izlemek için yararlıdır20.
    1. Dll1 promotör odaklı dengesiz luciferase muhabiri, her yerde bulunan luciferase (pDll1-Ub-Fluc, Şekil 1A üst paneli), transkripsiyonel düzeyde Dll1 ifadesindeki hızlı değişiklikleri izlemek içinkullanın 17.
    2. Bu muhabirin kararlı ifadesi için pDll1-Ub-Fluc taşıyan transgenik bir fare hattı oluşturun.
  2. Dll1 protein dinamiği17'yiizlemek için muhabir.
    1. Knock-in farelerin üretimi için, Dll1 kodlama bölgesinin 3 'termini içine luciferase cDNA takın böylece Dll1-luciferase füzyon proteinifade edilir (Dll1-Fluc muhabiri, Şekil 1A, alt panel)17.
    2. Luciferase aktivitesini ölçerek Dll1'in ifade dinamiklerini protein düzeylerinde izleyin.
    3. Doku düzeylerinde Dll1 protein dinamiklerini izlemek için, dll1-Fluc muhabirini rahim elektroporasyonunda embriyonik telensefalondaki NPC'lere tanıyın.

2. Biyolüminesans görüntüleme sistemi

  1. Son derece hassas, su soğutmalı CCD kamera ile yüklü ters bir mikroskop kullanarak bir biyolüminesans canlı görüntüleme sistemi kurun. Gürültüyü azaltmak ve yüksek hassasiyet elde etmek için kamerayı su sirkülasyonu tarafından sağlanan soğutulmuş su ile -90 °C'lik optimize edilmiş bir sıcaklıkta soğutun.
  2. Canlı hücre/doku görüntülemesi için, mikroskop aşamasına sıcaklığı ve karışık gazı kontrol eden kuluçka sistemini kurun.
  3. Kararsız luciferase muhabirinin ifadesini görüntülemek için yüksek sayısal açı (NA: 1.30) 40x yağ daldırma nesnel lens kullanın. Bu lensin çalışma mesafesi 0.2 mm, sadece mono katmanlı hücre kültürü için değil, aynı zamanda dilim kültür için kullanılabilir.
  4. Luciferase ve floresan muhabir ifadesinin çift izlenmesi için LED aydınlatma cihazını mikroskobun ışık yoluna takın.
  5. Mikroskopla ilişkili bir yazılımla (örneğin, MetaMorph yazılımının çok boyutlu satın alma programı) hızlandırılmış görüntülemeyi kontrol edin.
  6. Kararsız luciferase muhabirinin sinyali çok zayıf olduğu için tüm sistemi karanlık bir odada hazırlayın ve gereksiz ışığın satın alınmasını önleyin.

3. Nöral Kök/Progenitor Hücre (NPC) dissociasyon kültürleri

  1. NPC dissosyasyon kültürü için kültür ortamının, yemeklerinin ve reaktiflerin hazırlanması
    1. DMEM/F12 ortamlarında 1x N2, 1x B27, 1 mM N-asetilsistein, 10 ng/mL bFGF ve 50 U/mL Penisilin/Streptomisin konsantrasyonu olan nöral kök/progenitor hücrelerinin kültüre siniiçin N2/B27 ortam hazırlayın.
    2. EBSS medyada 7 U/mL papain, %0.006 DNase ve 1 mM N-asetilsistein içeren dissosilasyon için papain çözeltisini hazırlayın.
    3. Lüminesans görüntüleme için 100 mM luciferin sodyum çözeltisi hazırlayın. N2/B27 ortamlarında 100 mM luciferin çözeltisini 1 mM'lik son konsantrasyona seyreltin.
      NOT: Luciferin otomatik floresan kendisi gösterir. Luciferase-floresan çift görüntüleme durumunda, özellikle EGFP, 0.5 mM luciferin konsantrasyonu düşürücü daha iyidir.
    4. Oda sıcaklığında 1 saat boyunca 40 μg/mL poli-L-l-lizin (PLL) çözeltisi ile 35 mm cam taban tabaklarını (cam çapı 27-mm) kaplayın. Kuluçkadan sonra, pbs ile plakaları 3x yıkayın ve kurumasına izin.
  2. Embriyoların diseksiyonu ve NPC'lerin dissosiyasyonu
    1. Hamile bir pDll1-Ub-luc transgenik fare (embriyonik gün 12.5 (E12.5)) CO2 boğulma ve servikal çıkış ile ötenazi sonra, karın yoluyla kesilmiş ve rahim çıkarmak.
      NOT: Araştırmacılar, kurumlarının hayvan araştırma komitesinin yönetmelik ve yönergelerine uymak zorundadır. Anestezi veya ağrı kesici ilaçlar kullanılırsa, bunları düzgün kullanın.
    2. 25 mL buz gibi PBS içeren 10 cm Petri kabında rahmi aktarın. Mikro makas ve ince çerkeskullanarak, buz gibi PBS rahim den embriyoları alın.
    3. Her embriyonun kafasını makasla kesin ve buz gibi DMEM/F12 içeren 10 cm Petri kabına aktarın. Beyni çevreleyen epidermisin ve kıkırdağı çıkarın ve beyni buz gibi 3 mL N2/B27 ortam içeren 35 mm Petri kabına aktarın.
    4. Diensefalon sağ ve sol telensefalon kesin (Şekil 1Ba-f, C,D). İnce forceps kullanarak telensefalon yüzeyini kaplayan menenjleri çıkarın(Şekil 1Bi). Tekrar ince çerkezlikler kullanarak, telensefalon korteksin dorso-lateral kısmını çıkarmak (Şekil 1Bg, h,j-l E).
    5. P1000 pipet kullanarak dokuları yeni 1,5 mL tüplere aktarın ve P200 pipetile herhangi bir ekstra ortamı çıkarın. Beyin dokusu (korteks bir çift) başına papain çözeltisi 0.1 mL ekleyin. 24 °C'de 15 dk kuluçkadan sonra numuneleri P1000 pipetile 10 kez hafifçe pipetleyin. 24 °C'de 15 dakika boyunca numuneleri tekrar kuluçkaya yatırın.
    6. P1000 pipet ile numuneleri 10 kez hafifçe pipetleyin. 400 x g ve oda sıcaklığında (RT) 3 dakika için numuneleri santrifüj. Supernatant atın.
    7. Pelete 1 mL DMEM/F12 ortamı ekleyin. P1000 pipet ile 10 kez hafifçe pipet. 400 x g ve RT 3 dakika için numunesantrifuge. Bunu en az 2 kez daha tekrarlayın.
    8. Pelet için, 1 mM luciferin içeren 0,5 mL N2/B27 ortam ekleyin ve iyice karıştırın. Hücreleri (1 x 106 hücre) PLL kaplı cam alt tabağa tohumlayın. Co2 kuluçka makinesindeki hücreleri 1 saat e kültür. Hücreler yemeğe yapışınca, 1 mM luciferin içeren 2 mL N2/B27 ortam ekleyin.
  3. NPC dissosiyasyon kültüründe luciferase muhabirinin ifadesinin görselleştirilmesi
    1. Diseksiyonu yapmadan önce lüminesans canlı görüntüleme sistemini çalıştırın. NPC kültürü için, sahne kuluçka makinesinin sıcaklığını 37 °C olarak ayarlayın ve gaz karışımının ayarını %20 O2, %5 CO2olarak ayarlayın.
    2. Daldırma yağını objektif merceğe koyun. Örnek kabı mikroskop aşamasına yerleştirin. Alanı el ile görüntüleyin ve en iyi konumu ve ilgi hücrelerinin odağı seçin. Test görüntüsünü elde etmek için canlı'yı tıklatın.
    3. Çok Boyutlu Edinme programı ile 24 saat için 2 boyutlu (parlaklık ve parlak alan) satın almalar tarafından hızlandırılmış edinim çalıştırın. Çok Boyutlu Edinme programını seçin ve satınalma ayarını aşağıdaki gibi ayarlayın (adım 3.3.6).
    4. Parlaklık görüntü edinimi için aşağıdaki kamera ayarlarını kullanın: düşük aktarım hızı (50 kHz), 2 x 2/4 x 4 binning, 10 dk/5 dk pozlama süresi. Parlak alan görüntü edinimi için aşağıdaki ayarları kullanın: ara aktarım hızı (1 MHz), 1 x 1 binning ve 100 ms pozlama süresi.

4. Rahim elektroporasyonunda

NOT: Bu nöral progenitor hücrelerine Dll1-Fluc muhabirinin giriş için yapılır.

  1. Elektroporasyon için alet ve reaktiflerin hazırlanması
    1. Embriyonik telensefalon ventrikül içine DNA enjeksiyonu için mikro kılcal damarlar hazırlayın. Isı ile bir çim kılcal germek ve kesme ve parlatma makinesi ile ucunu parlatmak.
    2. Boya ile DNA karışımı hazırlayın (örneğin, Trypan mavisi). Her DNA'nın konsantrasyonu PBS'de 1 μg/μL'dir ve boyayı %10'luk son konsantrasyona ekleyin.
      NOT: Dll1 protein dinamiğinin görselleştirilmesi için DNA karışımını aşağıdaki gibi kullanın: Dll1-Fluc (Dll1 protein muhabiri, Şekil 2E üst)ve pEF-EGFP (EF promotör güdümlü EGFP ekspresyon vektörü, Şekil 2Edaha düşük),transfected hücrelerin yerini ve morfolojisini izlemek.
    3. İki tür anestezi kiçin hazırlayın: steril 1x PBS'de pentobarbital 3.88 mg/mL ve ksilezinin %0.12'si.
    4. Operasyon sırasında steril aletleri ve cerrahi eldivenleri kullanın.
  2. Rahim elektroporasyonunda
    1. Anesteziklerin intraperitoneal uygulaması ile 3.88 mg/mL pentobarbital ve 500 μL %0.12 xylazine ile anestezi eliyle anestetoneal anestezi kesterin.
      NOT: Araştırmacılar hayvan deneyleri yönetmeliğine uymak zorundadır. Bir anestezi veya ağrı kesici ilaçlar kullanmak gerekiyorsa, düzgün kullanın.
    2. Saç kırpın ve cerrahi scrub ile cilt dezenfekte.
    3. Parmak sıkıştırma yanıtı eksikliği olup olmadığını kontrol edin. Pedal refleksi gözlenmedikten sonra, orta hat boyunca karın dan 2-3 cm kesin. Kesiyi kurutmamak için gazlı bezleri parçalanmış kısmın etrafına koyun ve gazlı bezleri sıcak PBS ile ısıtın. Halka şeklindeki pütürlülerle sağ rahim boynuzunu hafifçe çıkarve embriyo sayısını sayın.
    4. Mikro kılcal damar ile yavaşça embriyoların telensefalon ventrikül içine karışık DNA 1-2 l enjekte.
      NOT: Enjeksiyon başarılı olduğunda, bir rahim yüzeyinde boya mavi rengini görebilirsiniz.
    5. Voltaj darbeleri sağlamadan önce rahim ve elektrot ıslak ve sonra yavaşça bir embriyo nun başını tutun. Pozitif yüklü elektrotu, DNA'nın enjekte edildiği yarımkürenin kenarına ayarlayın. Elektroporasyon nabzının 50 ms için 30-50 V, darbelerin aralığının 1 s (50 ms şarj ve 950 ms şarjsız) olduğundan emin olun. Bir embriyoya 5 darbe sağlayın ve negatif yüklü elektrottan kabarcıklar üretilip oluşturulmadığını kontrol edin.
      NOT: Elektrotun yönünün: DNA'nın pozitif elektrot tarafındaki hücrelere dahil olduğundan emin olun. Bu işlem sırasında elektrotun konumunu hareket ettirin.
    6. Diğer embriyolar için 4.2.3-4.2.4 adımlarını tekrarlayın ve rahim boynuzunu karın boşluğuna geri döndürün. Sol rahim boynuzu embriyolar için aynı işlemi yürütmek.
    7. Sol tarafı geri koyduktan sonra, bir iğne (17 mm) ile bir ipek sütür (4-0) ile kesi dikiş. Kesi tamamen kapatmadan önce, karın boşluğuna sıcak PBS koyun
      NOT: Dikişler arasındaki aralık 2 mm civarındadır.
    8. Ameliyatı bitirdikten sonra, anestezi sonrası iyileşme için fareyi bir ısıtma yastığına yerleştirin. Fareyi tek tek barındırın.
      NOT: Araştırmacılar hayvan deneyleri kendi yerel instiutional yönetmelik takip etmelidir. Bir ağrı kesici ilaçlar kullanmak gerekiyorsa, düzgün kullanın.

5. Gelişen korteksin dilim kültürlerinin hazırlanması ve kortikal dilimlerde luciferase muhabiri ifadesinin görselleştirilmesi

  1. Korteksin dilim kültürleri için kültür ortamı ve reaktiflerin hazırlanması
    1. N2/B27 ortamlarında %5 fetal sığır serumu ve %5 at serumu içeren kortikal dilimlerin kültüre edilmesi için zenginleştirilmiş ortam hazırlayın.
    2. Kabarcık 100% O2 gaz diseksiyon ve kortikal dilimler yapmak için DMEM/ F12 medya ile.
      NOT: Oksijen gazını güvenli bir şekilde kullanmak için, O2 silindirini silindir dolabında saklayın ve havadaki oksijen konsantrasyonunu bir oksijen konsantrasyonölçeri ile izleyin.
    3. Zenginleştirilmiş ortamda 100 mM luciferin sodyum çözeltisini 1 mM'lik son konsantrasyona seyreltin.
      NOT: Luciferin otomatik floresan kendisi gösterir. Luciferase-floresan çift görüntüleme durumunda, özellikle EGFP, luciferin düşük konsantrasyonu (0.5 mM) daha iyidir.
    4. Çok gazlı kuluçka makinesini 37 °C'de %40 O2 ve %5 CO2olarak ayarlayın.
  2. Embriyoların diseksiyonu ve floresan muhabirin ifadesinin incelenmesi
    1. Muhabirlerin (E13.5) rahim elektroporasyonunda (adım 4.2) tanıtıldığı hamile fareyi ötenaziden sonra karından kesip rahmi dışarı çıkarır.
      NOT: Araştırmacılar hayvan deneyleri yönetmeliğine uymak zorundadır. Anestezi veya ağrı kesici ilaçlar kullanıyorsanız, düzgün kullanın.
    2. Rahmi PBS içeren 10 cm'lik Petri kabına aktarın. Mikro makas ve ince çerkes kullanarak PBS rahim den embriyoları alın. Her embriyonun kafasını kesin ve %100 O2 gazı ile kabarmış DMEM/F12 ortam içeren 10 cm'lik petri kabına aktarın. DMEM/F12 ortamlarında beyni çevreleyen epidermisin ve kıkırdağı çıkarın.
    3. Halka şeklindeki çifenler ile Petri kabının kapağına beyin koyun ve floresan stereoskopik mikroskop sahne kapağı ayarlayın. Uyarma ışığı altında floresan proteini ifade eden korteksin bölgesini kontrol edin (Şekil 2A,B).
    4. Beyni 30 mL DMEM/F12 ortamla dolu silikon kauçuk kesme tahtasına aktarın ve %100 O2 gaz ile kabardırın. İnce forceps ile telencephalon yüzeyini kaplayan menenjler çıkarın.
    5. Dorsal telencephalon medial ve lateral kısmı arasındaki sınırı kesin ve mikro cerrahi bıçak veya ince çerkecikler kullanarak iki yarımküreye ayrı. Bir mikro cerrahi bıçak kullanarak, şeritler gibi korteks kesmek ve kortikal dilimler yapmak(Şekil 2C,D). Pipet li pipet dilimleri pipet kullanılarak orta ve 35 mm çanak zenginleştirilmiş ortama aktarın.
    6. Zenginleştirilmiş medya ile cam alt yemekleri kültür ekler üzerine dilimleri koyun. İnce forceps kullanarak dilimlerin yönünü düzeltin. Dilimlerin kesme yüzeyini kültür ekleme sinin yüzeyine ayarlayın. İlave ortamı pipetle çıkarın. Dilimleri 30 dakika boyunca 37 °C'de %40 O2 ve %5 CO2 olarak belirlenen çok gazlı kuluçka makinesinde kuluçkaya yatırın.
    7. Cam alt çanağa kültür eklemek dışında 1 mM luciferin içeren zenginleştirilmiş medya 300 μL ekleyin.
  3. Dilim kültürlerde luciferase muhabir ifadesinin görselleştirilmesi
    1. Diseksiyonu başlatmadan önce lüminesans canlı görüntüleme sistemini başlatın. Kortikal dilim kültürlerin aşağıdaki durumunu kullanın: 40% O2,5% CO2 ve 37 °C.
    2. 40x objektif lens daldırma yağı koyun. Örnek tabağı mikroskop aşamasına koyun. Floresan test görüntüsünü edinin ve uyarma ışığının aydınlatılması altında konumu ve odak düzlemini ilgi bölgesine ayarlayın.
    3. 24 saat(Şekil 2F-H)için 3-dimentional (parlaklık, floresan ve parlak alan) kazanımlar tarafından zaman atlamalı edinimi çalıştırın. Parlaklık görüntü edinimi için aşağıdaki kamera ayarlarını kullanın: düşük aktarım hızı (50 kHz), 2x2/4x4 binning, 10 dk/5 dk pozlama süresi. Floresan ve parlak alan görüntüsü edinimi için aşağıdaki ayarları kullanın: ara aktarım hızı (1 MHz), 1x1 binning ve 100 ms pozlama süresi.

6. Görüntü işleme ve analizi

  1. Her görüntüyü bağlayın ve yığın görüntüleri olun. Dosya menüsünden Görüntü Dizisini Al'a tıklayın (Dosya | İthalat | Resim Sırası) ve edinilmiş görüntülerin kaydedildiği klasörü seçin. Dosya adı bulunan bazı sözcükleri File adısütununa koyun.
  2. Biyolüminesans görüntülerindeki kozmik ışın gürültüsünü gidermek için ImageJ/Fiji'nin SpikeNoise Filtresi eklentisini uygulayın. Yığın görüntülerini açın ve SpikeNoise Filtresi'nitıklatın.
  3. Muhabir ifadesinin net dinamiklerini elde etmek için Savitzky Golay Geçici Filtre eklentisi uygulayın. Yığın görüntülerini açın ve Savitzky Golay Geçici Filtre'yitıklatın.
  4. Muhabir ifadesinin yoğunluğunu ölçmek için her bir hücreye Z Ekseni Profil Plus eklentisi uygulayın. Hücreleri seçin ve ROI'ları, ilgi çekici bölgeyi ayarlayın ve Z Ekseni Profil Plus'ı tıklatın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Hes1/7 genlerinin ifadeleri çeşitli hücre hatlarında ve somitogenez sırasında 2 h salınım döngüsü sergiler. Ayrıca, salınım dönemi çok kısadır ve hem mRNA'ları hem de proteinleri yaklaşık 20 dk'lık yarı lanma süreleri ile son derece kararsızdır. Eğer yavaş tepkili bir muhabir kullanıyorsak, bu kadar hızlı dinamikleri takip edemeyiz ve istikrarlı bir muhabir kullanıyorsanız, gen ekspresyonu salınım yaparken yavaş yavaş birikir. Bu nedenle, muhabir hızla bu tür döngüsel ifade genlerin hızlı ciro izlemek için alçal...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Notch sinyalin bileşenleri somitogenez sırasında senkronize ama nörogenez sırasında senkronize salınımlı ifadeler göstermek, ikinci durumda statik analiz ile ifade dinamikleri yakalama zorluklara yol açan. Bu nedenle, Hes1 ve Dll1gibi Çentik sinyal bileşenlerinin ifade dinamiklerini ortaya çıkarmak için gerçek zamanlı izleme gereklidir. Hes1 ve Dll1 salınımlarının ifadeleri dönemleri son derece kısa olduğundan, ifade dinamiklerini izlemek için yaklaşık 2-3 saat hızlı tepki ve kararsız ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların çakışan bir mali çıkarları yok.

Teşekkürler

Yumiko Iwamoto'ya videonun yapımını desteklediği için teşekkür ederiz. Biz de tartışma ve görüntü analizi destekler için Akihiro Isomura için müteşekkiriz, Hitoshi Miyachi transgenik hayvanların üretimi için teknik destekler için, Yuji Shinjo (Olympus Tıp Bilimi), Masatoshi Egawa (Tıp Bilimi), Takuya Ishizu ( Olympus Tıp Bilimi) ve Ouin Kunitaki (Andor Japonya) biyolüminesans görüntüleme sisteminin teknik destek ve tartışmaları için. Bu çalışma Evrimsel Bilim ve Teknoloji Için Çekirdek Araştırma (JPMJCR12W2) (R.K.), Yenilikçi Alanlar Bilimsel Araştırma Hibe(MEXT 24116705 H.S. ve MEXT 16H06480 R.K.), Grant-in-Aid Bilimsel Araştırma (C) (JSPS) tarafından desteklenmiştir 18K06254) (H.S.), Takeda Vakfı (R.K. ve H.S.) ve Eğitim, Kültür, Spor, Bilim ve Teknoloji Bakanlığı,Japonya'dan Yaşam Sistemine Dinamik Yaklaşımlar Platformu.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
<>Biyolüminesans Görüntüleme Sistemi< / güçlü>
Soğutulmuş su sirkülatörü (soğutucu)JulaboModel: F12-ED
934
Kuluçka sistemiTOKAI HITModel: INU-ONICS
Ters mikroskopOlympusModeli: IX81
Ters mikroskopOlympusModel: IX83
LED aydınlatma cihazıCoolLEDModel: pE1
MetaMorphMOLEKÜLER CİHAZLARModel: 40000
Karışım gaz kontrolörüTokkenModel: TK-MIGM OLO2
Objektif lensOlympusModeli: UPLFLN 40X O
Diseksiyon için hazırlıklar
Diseksiyon mikroskobuNikonModel: SMZ-2B
Floresan stereoskopik mikroskopLeicaModel: MZ16FA
İnce forsepsDUMONTINOX No.5
Makas, Mikro makas
Forseps
Halka şeklindeki forseps
10 cm plastik petri kabıgreiner664160-013
35 mm plastik petri kabıgreiner627160
PBSNacalai Tesque14249-24
DMEM/F12invitrogen11039-021
reaktifler ayrışma kültürü< / güçlü >
B27 takviyesiinvitrojen12587-010
bFGFinvitrojen13256-029Stok çözeltisi: 1 & mu; % 0.1 BSA / PBS içinde g / ml
D-luciferinNacalai Tesque01493-85Stok çözeltisi:% 0.9 tuzlu DNaz içinde 100mM
Worthington Biochemical CorporationLK003172Stok çözümü: EBSS'de 1000U/ml
EBSS WorthingtonBiochemical CorporationLK003188
Cam alt tabakIWAKI3910-035
N2 takviyesi (100x)invitrojen17502-048
N-asetil-sisteinSigmaA-9165-25G
PapainWorthington Biochemical CorporationLK003178Stok çözeltisi: EBSS
Penisilin/StreptmycineNacalai Tesque09367-34
Poli-L-lizinSigmaP-6281DW'de
40 mg / ml içinde 7U/mlUtero elektroporasyon için hazırlıklar
50 ml şırıngaTERUMO181228T Elektrot
Neppagene7-mm
ElektroporatörNeppageneCUY21 DÜZENLE
Forseps
Gazlı bezlerKawamoto co.7161
Mikro kılcalKurum içi
PBSNacalai Tesque14249-24
PentbarbitalKyoritsuseiyakuSomnopentil
Halka şeklindeki forseps
Makas, Mikro makas
Sütür iğnesiAkiyama MEDİKAL MFG. COF17-40B2
KsilazinBayerSeractal
Dilim kültürü için hazırlıklar
10 cm plastik petri kabıgreiner664160-013
35 mm plastik petri kabıgreiner627160
Kültür ekiMilliporePICM01250
DMEM/F12invitrogen11039-021
Fetal Sığır SerumuSigma172012-500ML
İnce forsepsDUMONTINOX No.5
Forseps
At SerumuGibco16050-122
Mikro cerrahi bıçakAlcon19 Gauge V-Lance
Çoklu gaz inkübatörüPanasonicMCO-5MUV-PJ
N2/B27 medyaMade in-houseref. NPC dissociatioin culture
PBSNacalai Tesque14249-24
Halka şeklindeki forseps
Makas, Mikro makas
Silikon kauçuk kesme tahtasıEvde
Soğutmalı CCD kamera Andor Teknolojisi Model: iKon-M üretilmiştir

Kaynaklar

  1. Ross, S. E., Greenberg, M. E., Stiles, C. D. Basic helix-loop-helix factors in cortical development. Neuron. 39, 13-25 (2003).
  2. Pontious, A., Kowalczyk, T., Englund, C., Hevner, R. F. Role of intermediate progenitor cells in cerebral cortex development. Developmental Neuroscience. 30, 24-32 (2007).
  3. Kriegstein, A., Alvarez-Buylla, A. The glial nature of embryonic and adult neural stem cells. Annual Review of Neuroscience. 32, 149-184 (2009).
  4. Paridaen, J. T., Huttner, W. B. Neurogenesis during development of the vertebrate central nervous system. EMBO Reports. 15, 351-364 (2014).
  5. Taverna, E., Götz, M., Huttner, W. B. The cell biology of neurogenesis: toward an understanding of the development and evolution of the neocortex. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30, 465-502 (2014).
  6. Louvi, A., Artavanis-Tsakonas, S. Notch signaling in vertebrate neural development. Nature Reviews Neuroscience. 7, 93-102 (2006).
  7. Pierfelice, T., Alberi, L., Gaiano, N. Notch in the Vertebrate Nervous System: An Old Dog with New Tricks. Neuron. 69, 840-855 (2011).
  8. Bray, S. Notch signalling: a simple pathway becomes complex. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7, 678-689 (2006).
  9. Bray, S. Notch signalling in context. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17, 722-735 (2016).
  10. Kopan, R., Ilagan, M. X. G. The Canonical Notch Signaling Pathway: Unfolding the Activation Mechanism. Cell. 137, 216-233 (2009).
  11. Ishibashi, M., et al. Persistent expression of helix-loop-helix factor HES-1 prevents mammalian neural differentiation in the central nervous system. The EMBO Journal. 13, 1799-1805 (1994).
  12. Ohtsuka, T., et al. Hes1 and Hes5 as notch effectors in mammalian neuronal differentiation. The EMBO Journal. 18, 2196-2207 (1999).
  13. Ohtsuka, T., Sakamoto, M., Guillemot, F., Kageyama, R. Roles of the Basic Helix-Loop-Helix Genes Hes1 and Hes5 in Expansion of Neural Stem Cells of the Developing Brain. Journal of Biological Chemistry. 276, 30467-30474 (2001).
  14. Kageyama, R., Ohtsuka, T., Kobayashi, T. The Hes gene family: repressors and oscillators that orchestrate embryogenesis. Development. 134, 1243-1251 (2007).
  15. Shimojo, H., Ohtsuka, T., Kageyama, R. Oscillations in Notch Signaling Regulate Maintenance of Neural Progenitors. Neuron. 58, 52-64 (2008).
  16. Imayoshi, I., et al. Oscillatory control of factors determining multipotency and fate in mouse neural progenitors. Science. 342, 1203-1208 (2013).
  17. Shimojo, H., et al. Oscillatory control of Delta-like1 in cell interactions regulates dynamic gene expression and tissue morphogenesis. Genes and Development. 30, 102-116 (2016).
  18. Hirata, H., et al. Oscillatory expression of the bHLH factor Hes1 regulated by a negative feedback loop. Science. 298, 840-843 (2002).
  19. Kageyama, R., Ohtsuka, T., Shimojo, H., Imayoshi, I. Dynamic Notch signaling in neural progenitor cells and a revised view of lateral inhibition. Nature Neuroscience. 11, 1247-1251 (2008).
  20. Masamizu, Y., et al. Real-time imaging of the somite segmentation clock: revelation of unstable oscillators in the individual presomitic mesoderm cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 1313-1318 (2006).
  21. Levine, J. H., Lin, Y., Elowitz, M. B. Functional roles of pulsing in genetic circuits. Science. 342, 1193-1200 (2013).
  22. Purvis, J. E., Lahav, G. Encoding and decoding cellular information through signaling dynamics. Cell. 152, 945-956 (2013).
  23. Luker, G. D., Pica, C. M., Song, J., Luker, K. E., Piwnica-Worms, D. Imaging 26S proteasome activity and inhibition in living mice. Nature Medicine. 9, 969-973 (2003).
  24. Yamaguchi, S., et al. Synchronization of Cellular Clocks in the Suprachiasmatic Nucleus. Science. 302, 1408-1412 (2003).
  25. Kiyohara, Y. B., et al. The BMAL1 C terminus regulates the circadian transcription feedback loop. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 10074-10079 (2006).
  26. Behar, M., Hoffmann, A. Understanding the temporal codes of intra-cellular signals. Current Opinion in Genetics and Development. 20, 684-693 (2010).
  27. Elowitz, M. B., Levine, A. J., Siggia, E. D., Swain, P. S. Stochastic Gene Expression in a Single Cell. Science. 297, 1183-1186 (2002).
  28. Nelson, D. E., et al. Oscillations in NF-kappaB signaling control the dynamics of gene expression. Science. 306, 704-708 (2004).
  29. Purvis, J. E., et al. p53 dynamics control cell fate. Science. 336, 1440-1444 (2012).
  30. Hansen, A. S., O'Shea, E. K. Promoter decoding of transcription factor dynamics involves a trade-off between noise and control of gene expression. Molecular Systems Biology. 9, 704(2014).
  31. Hansen, A. S., O'Shea, E. K. cis Determinants of Promoter Threshold and Activation Timescale. Cell Reports. 12, 1226-1233 (2015).
  32. Johnson, H. E., Toettcher, J. E. Signaling Dynamics Control Cell Fate in the Early Drosophila Embryo. Developmental Cell. 48, 361-370 (2019).
  33. Badr, C. E., Tannous, B. A. Bioluminescence imaging: Progress and applications. Trends in Biotechnology. 29, 624-633 (2011).
  34. Nakajima, Y., Ohmiya, Y. Bioluminescence assays: multicolor luciferase assay, secreted luciferase assay and imaging luciferase assay. Expert Opinion on Drug Discovery. 5, 835-849 (2010).
  35. Nakajima, Y., et al. Enhanced beetle luciferase for high-resolution bioluminescence imaging. PLoS One. 5, (2010).
  36. Stacer, A. C., et al. NanoLuc reporter for dual luciferase imaging in living animals. Molecular Imaging. 12, (2013).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

N ral K k H crelerIn Utero ElektroporasyonL siferaz ReporterProtein Dinami iGen Ekspresyon zlemeCanl H cre G r nt lemeKortikal Kesit K lt rTek H cre z n rl

İlgili makaleler