Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Temizlenmiş Kalp Üç Boyutlu Görüntüleme ile Hedefhücre Popülasyonlarının Kardiyak Yaralanma Yanıtının Yakalanması

5.4K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/60482

⸱

17 Mart 2020

 ,  , 
1Department of Cell and Regenerative Biology, University of Wisconsin-Madison School of Medicine and Public Health

Bu makalede

Özet

Yaralanma sonrası kardiyomiyosit proliferasyonu, miyosit dışı hücre popülasyonlarından gelen ekstrasellüler ipuçlarının senfonisini gerektiren dinamik bir süreçtir. Soy takibi, pasif CLARITY ve üç boyutlu tam montajlı konfokal mikroskopi tekniklerini kullanarak, çeşitli hücre tiplerinin kardiyak onarım ve rejenerasyon üzerindeki etkisini analiz edebiliriz.

Özet

Kardiyovasküler hastalık diğer tüm ölüm nedenlerinden daha yüksektir ve dünya çapındaki ölümlerin %31'inden sorumludur. Bu hastalık kardiyak yaralanmada, öncelikle akut miyokard enfarktüsü şeklinde ortaya çıkar. Yaralanma dan sonra çok az esneklik ile, bir kez sağlıklı kardiyak doku fibröz, non-kontrtil skar dokusu ile değiştirilir ve genellikle kalp yetmezliği için bir prelüd olabilir. Rejeneratif tıpta yeni tedavi seçeneklerini belirlemek için, araştırma doğuştan rejeneratif yetenekleri olan omurgalılar üzerinde odaklanmıştır. Böyle bir model organizma yenidoğan fare, sağlam miyokardiyal rejenerasyon ile kardiyak yaralanma yanıt verir. Yenidoğan faresinde klinik olarak alakalı bir yaralanmayı tetiklemek için, sol anterior inen arteri (LAD) tıkamak için, insan kalbinde aterosklerozun tetiklediği miyokard enfarktüsü yansıtan bir ameliyat geliştirdik. Kardiyomiyositler ve miyosit olmayan popülasyonlarda ki değişiklikleri takip etme teknolojisiyle eşleştiğinde, bu model bize kalp yenilenmesini yönlendiren mekanizmaları belirlemek için bir platform sağlar. Yaralanma sonrası kardiyak hücre popülasyonlarında değişiklikler hakkında bilgi edinmek, bir zamanlar doku kesiti ve histolojik inceleme gibi iki boyutlu analizle sınırlı olan ve genellikle bu süreçte dokuya zarar veren yöntemlere dayanıyordu. Ayrıca, bu yöntemler hücre soy değişiklikleri izlemek için yeteneği yoksun, bunun yerine yaralanma yanıtı sadece bir anlık görüntü sağlayan. Burada, soyu izleme modellerinde teknolojik olarak gelişmiş yöntemlerin, tüm organ temizliğinin ve üç boyutlu (3D) tam montajlı mikroskopinin kardiyak onarım mekanizmalarını açıklamak için nasıl kullanılabileceğini anlatıyoruz. Yenidoğan fare miyokard infarktüsü cerrahisi, doku temizleme ve 3Boyutlu tüm organ görüntüleme protokolümüzle, kardiyomiyosit proliferasyonuna neden olan karmaşık yollar çözülerek kardiyak rejenerasyon için yeni tedavi hedeflerini ortaya çıkarabilebilir.

Giriş

Kalp uzun bir post-mitotik organ olarak kabul edilmiştir, henüz son kanıtlar kardiyomiyosit yenilenmesi yılda yaklaşık% 1 yetişkin insan kalbinde meydana geldiğini göstermektedir1. Ancak, kardiyomiyosit ciro bu düşük oranları yaralanma sonrasında meydana gelen doku büyük kaybı doldurmak için yetersizdir. Bir miyokard enfarktüsü acı bir kalp genellikle kalp yetmezliği ve ani kardiyak ölüm2,,3bir prelüd olarak hizmet veren, bir milyar kardiyomiyosit civarında kaybedersiniz . Dünya çapında kalp yetmezliğinden etkilenen 26 milyondan fazla insan ile, kalp hastalığı4tarafından neden olduğu zararları tersine çevirebilir terapötik için karşılanmamış bir ihtiyaç vardır.

Terapötik ler arasındaki bu boşluğu kapatmak için bilim adamları, yaralanma sonrası endojen yenilenmenin altında yatan evrimsel olarak korunmuş mekanizmaları araştırmaya başladılar. Memeli kardiyak rejenerasyonu üzerinde çalışmak için bir model yenidoğan faresidir. Doğumu takip eden hafta içinde, yenidoğan farelerkardiyak hasarı takiben sağlam bir rejeneratif yanıta sahiptir5. Daha önce neonatal farelerin apikal rezeksiyon5sonrasında kardiyomiyosit proliferasyonu ile kalplerini yenileyebildiklerini göstermiştir. Bu teknik, yenini kardiyak rejenerasyon uyandırmak rağmen, cerrahi insan kalp yaralanmaları için klinik alaka yoksundur. Neonatal fare modelinde bir insan yaralanması taklit etmek için, bir koroner arter tıkanıklığı ile miyokard enfarktüsü neden bir teknik geliştirdik6. Bu teknik sol ventrikül miyokardiyum6,,7kan% 40-50 teslim sorumludur sol anterior inen arter (LAD), cerrahi ligasyon gerektirir. Böylece, cerrahi sol ventrikül duvarının önemli bir bölümünü etkileyen bir enfarktüs sonuçları. Miyokardindeki bu hasar kardiyomiyosit proliferasyonlarını ve kalp yenilenmesini teşvik edecektir5.

Koroner arter oklüzyon cerrahisi kardiyak rejenerasyon iç işleyişini ortaya çıkarmak için son derece tekrarlanabilir ve doğrudan çeviriyöntemi sağlar. Yenidoğan cerrahisi insan kalbinde koroner arter ateroskleroz paralellikler, arterlerin iç duvarları içinde plak birikimi bir oklüzyon ve sonraki miyokard enfarktüsü neden olabilir8. Kalp yetmezliği hastaları için terapötik tedavilerde bir boşluk nedeniyle, LAD bir tıkanıklık yaralanma9aşağıdaki bir yıl içinde% 26'ya ulaşan mortalite oranları ile ilişkilidir , ve sonuç olarak "dul yapıcı" olarak adlandırılmıştır. Terapötik gelişmeler doğru kardiyak yaralanma karmaşık fizyolojik ve patolojik etkilerini yansıtan bir model gerektirir. Yenidoğan fare kardiyak yaralanması için cerrahi protokolümüz, araştırmacıların yaralanma sonrası memeli kalp yenilenmesini işaret eden moleküler ve hücresel ipuçlarını araştırmalarını sağlayan bir platform sağlar.

Son araştırmalar hücre dışı ortam ve kardiyomiyositler çoğalan arasındaki dinamik ilişkiyi vurgulamaktadır. Örneğin, postnatal rejeneratif pencere kalbi çevreleyen hücre dışı matriks sertliği azaltarak uzatılabilir10. Yenidoğan ekstrasellüler matris biyomalzemeler de kardiyak yaralanma11aşağıdaki yetişkin memeli kalplerde kalp rejenerasyonu teşvik edebilir. Ayrıca kardiyomiyosit proliferasyonu eşlik eden bir anjiyojenik yanıt12,13; yenidoğan farenin rejeneratif kalbine özgü kollateral arter oluşumukardiyak rejenerasyonu teşvik etmek için gerekli olduğu gösterilmiştir12. Ayrıca, bizim laboratuvar sinir sinyalizasyonu kardiyomiyosit proliferasyon ve büyüme faktörü düzeyleri modülasyonu yoluyla kalp rejenerasyon düzenler göstermiştir, yanı sıra yaralanma sonrası inflamatuar yanıt14. Bu bulgular kardiyak yaralanmaya yanıt olarak miyosit dışı hücre popülasyonlarının izlenmesi gereğini vurgulamaktadır. Bu amaca ulaşmak için, transgenik fare hatlarındaki Cre-lox rekombinasyon sisteminden yararlanarak floresan muhabir proteinlerin kurucu veya koşullu ifadesini soy takibi için birleştirdik. Ayrıca, hedeflenen hücre popülasyonlarının klonal genişlemesini belirlemek için Cre bağımlı, çok renkli floresan muhabirlerin stokastik ifadesine dayanan Rainbow fare çizgisi ile klonal genişleme desenlerini belirlemek için gelişmiş yöntemler kullanabiliriz15. Neonatal koroner arter oklüzyonu cerrahisi ile soy takibi nin alınması, kardiyak rejenerasyonun karmaşık hücresel mekanizmalarını incelemek için güçlü bir araçtır.

Floresan etiketli hücrelerin soyunu üç boyutlu (3D) tüm organ görüntülemesi ile izlemek geleneksel kesitleme ve rekonstrüksiyon tekniği kullanılarak elde etmek zordur – özellikle hücre popülasyonları kırılgan olduğunda, sinir lifleri veya kan damarları gibi. Optik kesitile organın doğrudan tam montaj görüntüleme yüzeysel hücre popülasyonları yakalayabilir iken, doku içinde derin bulunan yapılar erişilemez kalır. Bu engelleri aşmak için, doku temizleme teknikleri tüm organ dokularının opaklık azaltmak için geliştirilmiştir. Son zamanlarda, önemli gelişmeler Clear Lipid-exchanged Akrilamid-hibrid Rijit Görüntüleme uyumlu Doku hYdrogel (CLARITY) tabanlı yöntemler, hangi lipid ekstraksiyon u geçerek sabit doku temiz16yapılmıştır . Kırılma indisi homojenize etmek ve daha sonra17'yigörüntülerken ışık saçılımını azaltmak için de adımlar atılır. Böyle bir yöntem aktif CLARITY, hangi doku18boyunca deterjan nüfuz elektroforez kullanarak lipid ayrışmasını hızlandırır. Etkili olmasına rağmen, Bu doku temizleme yöntemi pahalı ekipman gerektirir ve doku hasarına neden olabilir, yaklaşım kardiyak sinirler gibi kırılgan hücre popülasyonları ile uyumsuz hale19. Böylece, biz yavaşça deterjan penetrasyon kolaylaştırmak için ısı dayanır pasif CLARITY yaklaşımı, istihdam, bu nedenle karmaşık hücre yapılarının tutulmasına yardımcı20,21.

Pasif BERRAKLIK genellikle aktif CLARITY18daha az verimli olduğu düşünülmektedir , teknik genellikle iki büyük engeller eşlik ettiği gibi: yetersizlik tüm organ derinliği temizlemek için ve yetişkin dokuları temizlemek için gerekli zaman geniş miktarda. Pasif CLARITY yaklaşımımız, yenidoğan ve erişkin kalp dokusunu tamamen temizleyebilecek hızlı bir temizleme işlemi yle bu engellerin her ikisini de aşar. Pasif CLARITY doku temizleme tekniğimiz, erişkin kalbe dağılmış nadir popülasyonlar da dahil olmak üzere çeşitli kardiyak hücre popülasyonlarının görüntülenmesine izin veren bir verimliliğe ulaşmıştır. Temizlenmiş kalp konfokal mikroskopi ile görüntülendiğinde, gelişim, hastalık ve rejenerasyon sırasında hücreye özgü desenleme mimarisi aydınlatılabilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Tüm deneyler, Laboratuvar Hayvanlarının Kullanımı ve Bakımı Kılavuzu'na ve Wisconsin-Madison Üniversitesi Tıp ve Halk Sağlığı Fakültesi'ndeki Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi'ne uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Tüm yöntemler, Jackson Laboratuvarları'ndan elde edilen c57BL/6J (B6) ve transgenik fare hatlarında uygulandı.

1. 1 Günlük YenidoğanFarelerde Sol Anterior İnancı Arterin (LAD) Ligasyonu ile İndüklenen Koroner Arter Oklüzyonu (Miyokard İnfarktüsü) 6

  1. 1 günlük yenidoğan yavrularını, orijinal yuvalama malzemesiyle birlikte temiz bir kafese koyarak anneden ayırın.
  2. Kafesin yarısını orta ısıya ayarlanmış bir ısıtma yastığıüzerine yerleştirin. Yavrular kafesin ısıtılmamış tarafında kalmalıdır, sadece ameliyattan sonra ısıtmalı tarafınüzerine yerleştirilir.
  3. Bir işletim mikroskobu altında steril bir cerrahi alan oluşturun. Sterilize cerrahi ekipman toplamak (Tablo 1).
  4. Hipotermi yoluyla yavruyu anestezi kaltın: buzla doğrudan cilt temasından kaçınmak için yavruyu gazlı bezle sarın ve yaklaşık 3-4 dakika boyunca bir buz yatağına gömün. Yeniler hipotermiyi iyi tolere eder, ancak hipotermiye uzun süreli maruz kalma donma ve sonraki mortaliteye neden olabilir.
  5. Anestezi yapıldıktan sonra fareyi cerrahi alana supine pozisyonunda yerleştirin ve kolları ve bacakları bantla emniyete alın. Bir antiseptik solüsyon ile farenin cerrahi alanı sterilize.
  6. Alt göğüs bölgesini bulun ve küçük diseksiyon makasla deride enine bir kesi yapın. Kaburgaların cerrahi görünümünü genişletmek için, bir çift pansuman forsepsi ile cildi hafifçe kaldırarak cildi kaslardan ayırın ve kapalı pozisyondaki küçük makasla interkostal kaslara hafifçe bastırın.
  7. Dördüncü interkostal alanı bulun(Şekil 1A)ve keskin forceps kullanarak küçük, yüzeysel bir delinme yapmak, herhangi bir iç organları delmek için dikkatli olmak. Pansuman forceps ile interkostal kaslar arasındaki alanı genişleterek künt bir diseksiyon gerçekleştirin. Kesiğin uygun anatomik konumlandırılması kalbe uygun erişim için gereklidir.
  8. Yavaşça bir parmak yerleştirerek ve pansuman forceps ile interkostal boşluk açık tutarken karın sol tarafında artan basınç uygulayarak göğüs boşluğundan kalp kılavuzu(Şekil 1B). Kalp göğüs dışında bir kez, pansuman forceps kaldırmak, basınç rahatlatmak, ve kalp interkostal kaslar üzerinde dinlenmek için izin.
  9. Lad'i daha az kan anına sahip ve doğru anatomik konumda olan kalp bölgesi olarak bulun (Şekil 1C). LAD sadece kalp cerrahi başlayan birkaç dakika içinde erişilirse mikroskop altında görülebilir.
  10. LAD'yi 6-0 sütürle dikerek LAD ligasyonunu gerçekleştirin (Şekil 1D). Miyokard enfarktüsü(Şekil 1E)neden olmak için iki kez kare düğüm bağlayın. Miyokardine dikiş derinliği değişebilir, ancak LAD ligasyonunun uygun anatomik konumlandırması tekrarlanabilirlik için çok önemlidir. LAD ligating zaman, dikiş sıkı ama dikkatli böylece LAD kesmek için değil çekilmelidir. Kalbin tepe noktasında beyazlatma hemen görülecektir (Şekil 1E)
  11. Kalbin göğüs boşluğuna geri kaymasına izin ver; bu işlem nazikçe pansuman forceps ile kolaylaştırılabilir. Kaburgaları bir cerrah düğümü ile birlikte dikin ve ardından kare bir düğüm, kaburgaüst ve alt set inden 6-0 dikiş geçerken kaburga üst kümesi kaldırmak için künt forseps kullanarak.
  12. Yavrunun arka bacaklarını sabitlemek için kullanılan bandı çıkarın.
  13. Üst karın üzerine deri tutkal küçük bir miktar yerleştirerek birlikte cilt yapıştırın. Sonra, ince forceps ile alt karın deri kapmak ve maruz göğüs bölgesi kapağı. Bu anne tarafından reddedilme ve yamyamlık olasılığını artırabilir gibi, yavrular üzerinde kalan fazla tutkal miktarını sınırlayın.
  14. Hemen orta ısı ayarlanmış bir ısıtma yastığı üzerine yavru yerleştirerek anestezi kurtarma kolaylaştırmak. Düzenli olarak düzgün vücudun tüm parçaları ısınmak için neonates yerleşimi değiştirin.
  15. Yenidoğanın 10-15 dakika boyunca doğrudan ısıtma yastığıüzerinde kalmasına izin verin.
  16. Artık kanı ve tutkalı alkol mendiliyle temizleyin.
  17. Orijinal kafesten yatak ile tüm vücut sürtünme tarafından neonates üzerinde yabancı kokular kapağı. Diğer ameliyatlar yapılırken Sıcak tarafında kafes içine yavru yerleştirin.
  18. Tüm ameliyatlar tamamlandıktan ve yavrular sıcak ve hareketli olduktan sonra, orijinal yuvalama malzemesi ile birlikte çöpü annenin kafesine aktarın.
  19. Ameliyattan sonra fareleri 30-60 dakika boyunca izleyin ve annenin yavruları yuvalama ve/veya damat olarak kabul ünü izleyin.
  20. Ameliyattan sonraki sabah fareleri kontrol edin. Eğer anne sıkıntılı ysa ve yavruları yuvalamamışsa, yavrular için bir koruyucu anne düşünün.

2. Pasif BERRAKLIK21,22,23 ile Fare Kalp Temizleme

  1. Fareyi izoflurane ile anesthetize edin. Farenin tamamen uyuşturulmasını sağlamak için bir parmak tutamını gerçekleştirin.
  2. Fareyi supine pozisyonunda temiz, cerrahi bir alana yerleştirin, kolları ve bacakları bantla emniyete alın.
  3. Kalp çıkarılana kadar bir burun konisi kullanarak fare üzerinde isoflurane sedasyon koruyun.
  4. Doku forceps ile xiphoid sürecinin hemen altında kürk tutarak alt göğüs açın ve büyük diseksiyon makas kullanarak göğüs kafesi genişliği kapsayan bir kesi yapmak.
  5. Cerrahi makas ile göğüs kafesi distal kısımları yanında kesin.
  6. Doku forceps ile ksifoid süreci kavrayarak diyafram kas maruz. Kavisli forceps kullanarak diyafram ı ayırın.
  7. Ksifoid süreci bir kavrayışa korurken, atan kalp erişilebilir olana kadar cranially doku çekin.
  8. Kavisli forceps ile tabanında kalp kavramak ve iridektomi makas ile aort ve üstün vena kava keserek göğüs boşluğundan kalp incelemek.
  9. Kalp hala atıyor iken, kalp pbs dolu bir Petri kabına kalp yerleştirin böylece kalp atmaya devam ettikçe içinde kan pompalar. Miyokard enfarktüsü, sütün yerleştirilmesinin LAD ligasyonu için uygun anatomik pozisyonda olup olmadığı kontrol edilerek doğrulanabilir.
  10. Kalbin artık kanı dışarı atmasını sağlamak için kalbi forsepslerle hafifçe sıkın.
  11. Fare kalbini 2 mL PBS ile tek kullanımlık 2,5 mL cam kabuk şişesine aktarın. Oda sıcaklığında 10 dakika (RT) birkaç kez bir shaker üzerinde kalp kuluçka tarafından artık kan yıkayın. PBS açık kalana kadar her seferinde PBS çözümünü değiştirin.
  12. PBS atın ve soğuk 2 mL ile şişe doldurun 4% paraformaldehit (PFA). RT'de 4 saat kuluçka(Şekil 2A).
  13. Kuluçkadan sonra PFA ve şişeyi 2 mL PBS ile atın. Kalbi 10 dakika boyunca rt'de çalkalayın. Fazla PFA'yı tamamen temizlemek için şişeyi her seferinde yeni PBS ile boşaltArak ve doldurarak yıkama adımını iki kez tekrarlayın.
  14. PBS atın ve% 4 akrilamid 2 mL ve% 0.5 VA-044 çözeltisi ile şişe doldurun. Gece boyunca 4 °C'de kuluçkaya yatırın.
  15. Ertesi gün, şişeyi 37 °C'de 3 saat boyunca belirlenen bir ısı bloğuna aktararak polimerizasyon gerçekleştirin.
  16. Kalbi yeni bir cam kabuk şişesine aktarın ve 2.12(PBS yıkama döngüsü) adımını tekrarlayın.
  17. PBS'yi atın ve şişeyi 2 mL Takas Çözeltisi ile doldurun(Tablo 2). Kalp temizlenene kadar 37 °C'de kuluçkaya yatırın. Çözümü değiştirin ve her 2-3 günde bir taze Takas Çözümü ile doldurun. Temizleme işlemi birkaç hafta kadar sürebilir(Şekil 2B-C).
    NOT: P1 kalpleri genellikle yaklaşık 3-5 gün sürer, P21 kalpleri Clearing Solution kuluçka tamamlanmadan önce yaklaşık bir ay sürebilir.
  18. PBS atın ve 2 mL PBS ile şişe doldurun ve adım 2.12 (PBS yıkama döngüsü) tekrarlayın. Şişeyi taze PBS ile doldurun ve bir gecede 37 °C'de kuluçkaya yatırın.
  19. İmmünoboyama yapılacaksa, 2.21-2.22 adımlarını atlayın ve immünboyama için Bölüm 3'e ilerleyin. Yalnızca endojen floresana güveniyorsanız, 2.21-2.22 adımlarını atlayın ve Bölüm 3'i atlayın.
  20. PBS'yi atın ve çözümü Kırılma Dizini Eşleştirme Çözümü (RIMS)(Tablo 3)olarak değiştirin. Bir gecede 37 °C'de kuluçkaya yatırın.
  21. Kuluçkadan sonra, temizlenmiş doku RT RIMS çözeltisinde saklanabilir. doku birkaç hafta oda sıcaklığında RIMS inkübülsonra şeffaf hale gelmelidir(Şekil 2D).

3. İsteğe Bağlı: Tüm-Mount Mouse Kalp İmmünohistokimya Boyama

  1. Temizlenmiş kalbi RIMS çözeltisinden çıkarın ve 2 mL PBST (PBS % 0,1 Triton-X 100 ile PBS) ile temiz 2,5 mL cam şişeye yerleştirin
  2. Rt'de 30 dk kuluçka ile orbital rotator üzerinde PBST 3 kez kalp yıkayın.
  3. Kalbi 2 mL 20 blokajlık tampona batırarak (PBST'de seyreltilmiş) ve RT'de 3 saat rotasyonla inkübünle inkübünle bağlanarak spesifik olmayan antikor bağlanmasını engelleyin.
    NOT: Engelleme tamponu, sekonder antikorun yükseltildiği türle eşleşen normal serumdan yapılır.
  4. Rt'de 5 dk kuluçka için 3 kez PBST'de kalbi yıkayın.
  5. Kalbi birincil antikora batırın (PBST ile tamponu %2 oranında seyreltin) ve cam şişeyi alüminyum folyoya sararak ışığa maruz kalmalarını önleyin. RT'de bir gecede rotasyon la kuluçka.
    NOT: Bu noktadan itibaren, alüminyum folyo sürekli ortam ışık maruz kalma ikincil korumak için kullanılmalıdır.
  6. 4 °C'de rotasyon ile 24 saat ek bir kuluçka.
  7. Birincil boyama dan sonra, tekrar adım 3.2 (uzun PBST yıkama döngüsü) dokudan bağlanmamış birincil antikor kaldırmak için. RT'de rotasyon ile bir gecede kuluçka ile yıkama uzatın.
  8. İkincil antikor ışığına maruz kalmamak için sınırlı aydınlatmalı bir alanda çalışarak kalbi ikincil antikora batırın (PBST ile tamponu %2 oranında seyrelterek seyreltin) ve RT'de 3 saat rotasyonla kuluçkaya yatırın.
  9. Ertesi gün, bağlı olmayan ikincil antikor kaldırmak için adım 3.2 (uzun PBST yıkama döngüsü) tekrarlayın.
  10. Çözeltiyi %2 engelleme tamponu (PBST'de seyreltilmiş) ile değiştirin. RT'de rotasyonla bir gecede yıkayarak artık bağlanmamış antikorları çıkarın.
  11. Ertesi gün, aşırı sekonder antikor konfokal mikroskopi kullanılarak kaldırıldı kontrol edin. Yıkamayı gerektiği gibi uzatın ve %2'lik engelleme tampon çözeltisini günlük olarak değiştirin. Belirli olmayan ikincil hiçbir yerde çok az bir kez devam edin.
  12. İmmünoslekeli kalbi PBS'de 4 °C'de saklayın.
  13. Tam montajlı mikroskopiden hemen önce, rims çözeltisindeki kalbi bir gecede 37 °C'de kuluçkaya yatırın. Doku hala tam olarak temizlenmezse kuluçka süresini 24 saat daha uzatın.
  14. Tamamen temizlenmiş ve immünostained kalbi RIMS'de RT'de saklayın.

4. Temizlenmiş Fare Kalbinin Tek Foton Konfokal Mikroskopi Sigörme ile 3Boyutlu Miyosit Dışı Popülasyonların Görselleştirilmesi

NOT: Fare kalpleri embriyonik olarak hasat edilirse, bölüm 4.1 ile devam edin. Doğum sonrası hasat edilen fare kalpleri için bölüm 4.2 ile devam edin.

  1. Temizlenmiş Embriyonik Fare Kalp Görüntüleme
    1. Mikroskop depresyon slaytını PBS çözeltisi ile doldurun.
    2. Kavisli çalgılarile temizlenmiş kalbi dikkatlice toplayıp dokuyu slaytüzerine yerleştirin.
    3. Kaydırağı cam bir kapak lı olarak monte edin. Doku artık bir konfokal mikroskop altında görüntülenebilir.
  2. Temizlenmiş Postnatal Fare Kalp Görüntüleme
    1. Depresyon slayt Odasının yarısını PBS çözeltisi ile doldurun. Yetişkin bir fare kalbine sığacak kadar büyük bir oda oluşturmak için, 3D baskılı polipropilen depresyon slaytı özel olarak yapılmıştır (Şekil 4).
    2. Dikkatle kavisli forceps ile temizlenmiş kalp almak ve odaya doku yerleştirin. Haznenin kalan hacmini PBS ile doldurun.
    3. Sıvı yüzeyi odanın üst üzerinde bir kubbe oluşturur böylece PBS ile oda doldurun. Kapak kaydırasını monte edin. Doku artık dik bir konfokal mikroskop altında görüntülenebilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Genellikle iki en zorlu adım göğüs boşluğu dışında kalp rehberlik ve LAD ligating vardır. Bu adımları gidermek için, ayarlamalar dördüncü interkostal kaslar arasında ilk delinme yerleşimi yapılabilir; delinme ve künt diseksiyon göğüs kafesine çok yakınsa, kalp göğüs boşluğundan çıkamayabilir(Şekil 1A).

Ayrıca, sol karın üzerinde artan basınç bu süreci kolaylaştırmak için gerekli olabilir(Şekil 1B). Ko...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Kardiyomiyositler ve miyosit dışı popülasyonlar arasındaki hücre-hücre etkileşimleri, kalbin yaralanma sonrası fibrozis mi yoksa onarım mı geçireceğini belirleyen bir faktördür. Keşifler gösteren çeşitli hücre tipleri, sinirler de dahil olmak üzere14, epikardiyal hücreler24, peritonmakrojlar25, arteriyol1212,13, ve lenfatik endotel hücreleri26, tüm kardiyak onarım arac...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarları olduğunu beyan.

Teşekkürler

Bu projenin finansmanı Wisconsin Ortaklık Programı (A.I.M.) ve Amerikan Kalp Derneği Kariyer Geliştirme Ödülü 19CDA34660169 (A.I.M.) tarafından UW Tıp ve Halk Sağlığı Okulu tarafından sağlanmıştır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
1-tiyokliserol
6-0 ProleneSütürler Ethicon8889HPolipropilen Sütürler
Akrilamid
Borik asit
Kavisli Forseps Excelta16-050-146Yarım Kavisli, Tırtıklı, 4
Pansuman ForsepsFisherbrand13-812-39Diseksiyon, 4.5 inç
Cam FlakonFisherbrand03-339-26A12 x 35 mm Kapaklı Flakon
HistodenzSigma-AldrichYoğunluk gradyan orta
İridektomi MakasGüzel Bilim Araçları15000-032 mm Kesici Kenar
Büyük DiseksiyonMakası Fisherbrand08-951-20Düz, 6 inç
İğne TutucuFisherbrand08-966Mayo-Hegar, 6 in
Paraformaldehit
Fosfat Tampon
Keskin ForsepsSigma-AdrichZ168777İnce Uç, Düz, 4.25 inç
Küçük Diseksiyon MakasıWalter Stern Inc25870-00230 mm Kesici
Kenar Sodyum Azid
Sodyum Dodesil Sülfat (SDS)
Doku ForsepsExcelta16050133Orta Doku, 1X2 Diş
VA-044Wako Kimyasalları Sudaçözünür azo başlatıcı

Kaynaklar

  1. Lazar, E., Sadek, H. A., Bergmann, O. Cardiomyocyte renewal in the human heart: insights from the fall-out. European Heart Journal. 38 (30), 2333-2342 (2017).
  2. Kikuchi, K., Poss, K. D. Cardiac regenerative capacity and mechanisms. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 28, 719-741 (2012).
  3. Habecker, B. A., et al. Molecular and cellular neurocardiology: development, and cellular and molecular adaptations to heart disease. The Journal of Physiology. 594 (14), 3853-3875 (2016).
  4. Savarese, G., Lund, L. H. Global Public Health Burden of Heart Failure. Cardiac Failure Review. 3 (1), 7-11 (2017).
  5. Porrello, E. R., et al. Transient regenerative potential of the neonatal mouse heart. Science. 331 (6020), 1078-1080 (2011).
  6. Mahmoud, A. I., Porrello, E. R., Kimura, W., Olson, E. N., Sadek, H. A. Surgical models for cardiac regeneration in neonatal mice. Nature Protocols. 9 (2), 305-311 (2014).
  7. Karwowski, J., et al. Relationship between infarct artery location, acute total coronary occlusion, and mortality in STEMI and NSTEMI patients. Polish Archives of Internal Medicine. 127 (6), 401-411 (2017).
  8. Lusis, A. J. Atherosclerosis. Nature. 407 (6801), 233-241 (2000).
  9. MAGGIC. The survival of patients with heart failure with preserved or reduced left ventricular ejection fraction: an individual patient data meta-analysis. European Heart Journal. 33 (14), 1750-1757 (2012).
  10. Notari, M., et al. The local microenvironment limits the regenerative potential of the mouse neonatal heart. Science Advances. 4 (5), 5553(2018).
  11. Porrello, E. R., et al. Regulation of neonatal and adult mammalian heart regeneration by the miR-15 family. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (1), 187-192 (2013).
  12. Das, S., et al. A Unique Collateral Artery Development Program Promotes Neonatal Heart Regeneration. Cell. 176 (5), 1128-1142 (2019).
  13. Wang, Z., et al. Decellularized neonatal cardiac extracellular matrix prevents widespread ventricular remodeling in adult mammals after myocardial infarction. Acta Biomateria. 87, 140-151 (2019).
  14. Mahmoud, A. I., et al. Nerves Regulate Cardiomyocyte Proliferation and Heart Regeneration. Developmental Cell. 34 (4), 387-399 (2015).
  15. Yanai, H., Tanaka, T., Ueno, H. Multicolor lineage tracing methods and intestinal tumors. Journal of Gastroenterology. 48 (4), 423-433 (2013).
  16. Ariel, P. A beginner's guide to tissue clearing. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 84, 35-39 (2017).
  17. Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).
  18. Epp, J. R., et al. Optimization of CLARITY for Clearing Whole-Brain and Other Intact Organs. eNeuro. 2 (3), (2015).
  19. Lee, H., Park, J. H., Seo, I., Park, S. H., Kim, S. Improved application of the electrophoretic tissue clearing technology, CLARITY, to intact solid organs including brain, pancreas, liver, kidney, lung, and intestine. BMC Developmental Biol. 14, 48(2014).
  20. Wan, P., et al. Evaluation of seven optical clearing methods in mouse brain. Neurophotonics. 5 (3), 035007(2018).
  21. Phillips, J., et al. Development of passive CLARITY and immunofluorescent labelling of multiple proteins in human cerebellum: understanding mechanisms of neurodegeneration in mitochondrial disease. Scientific Reports. 6, 26013(2016).
  22. Blom, J. N., Lu, X., Arnold, P., Feng, Q. Myocardial Infarction in Neonatal Mice, A Model of Cardiac Regeneration. Journal of Visualized Experiments. (111), e54100(2016).
  23. Sereti, K. I., et al. Analysis of cardiomyocyte clonal expansion during mouse heart development and injury. Nature Communications. 9 (1), 754(2018).
  24. Lepilina, A., et al. A dynamic epicardial injury response supports progenitor cell activity during zebrafish heart regeneration. Cell. 127 (3), 607-619 (2006).
  25. Wang, J., Kubes, P. A Reservoir of Mature Cavity Macrophages that Can Rapidly Invade Visceral Organs to Affect Tissue Repair. Cell. 165 (3), 668-678 (2016).
  26. Vieira, J. M., et al. The cardiac lymphatic system stimulates resolution of inflammation following myocardial infarction. Journal of Clinical Investigation. 128 (8), 3402-3412 (2018).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Neonatal Fare ModeliSol n nen ArterT m Organ effafla t rmaKonfokal MikroskopiSoy Hatt zleme ModelleriDoku effafla t rma ProtokolMiyokard Enfarkt s CerrahisiKardiyak Rejenerasyon
Temizlenmiş Kalp Üç Boyutlu Görüntüleme ile Hedefhücre Popülasyonlarının Kardiyak Yaralanma Yanıtının Yakalanması
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.