Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Farelerde İntrathecally Sentezlenmiş Proteinlerin Kantitatif Ölçümü

11.4K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/60495

⸱

29 Kasım 2019

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Neurology, Geisel School of Medicine & Dartmouth-Hitchcock Medical Center, 2Program in Experimental and Molecular Medicine, Dartmouth College

Bu makalede

Özet

Yüksek spinal sıvı protein düzeyleri ya değiştirilmiş bir kan-beyin bariyeri veya intratekal sentez arasında plazma proteininin difüzyon sonucu olabilir. Bu makalede, her iki vakanın da ayrımına yardımcı olan ve intrathecally sentezlenmiş proteinlerin nicel ölçümlerini sağlayan optimize edilmiş bir test protokolü sunulmuştur.

Özet

Beyin ve omurilikte bulunan bir sıvı olan beyin omurilik sıvısı (BOS), hem temel hem de klinik bilim için büyük önem taşımaktadır. BOS protein bileşiminin analizi, nörolojik hastalıkların yanı sıra temel nörolojik araştırmalarda da önemli bilgiler sağlar. Bir uyarı, BOS cinsinden ölçülen proteinlerin hem intratekal sentezden hem de serumdan transudasyondan kaynaklanabilir ve BOS'un protein analizi sadece bu iki bileşenin toplamını belirleyebilir. Protein transudasyonu ile hayvan modellerinde ve insanlarda intrathecally üretilen proteinler arasında ayrım yapmak için, geleneksel protein analiz araçlarını kullanan BOS protein profilleme ölçümleri, kan-beyin arabiriminin bütünlüğünün bir göstergesi olan albumin BOS/serum quotient (Qalbumin)ve intrakalprotein sentezinin bir tahmini olan protein indeksini (Qprotein/Qalbumin)içermelidir. Bu protokol, bos ve kan toplamadan, intratekal protein sentezinin kantitatif ölçümü ve nörolojik bozuklukların fare modellerinde BBI bozukluğunun kantitatif ölçümü için tüm prosedürü göstermektedir.

Giriş

Beyin ve omuriliği çevreleyen berrak ve renksiz bir sıvı olan beyin omurilik sıvısı (BOS), büyük klinik ve temel bilimsel öneme sahiptir. BOS merkezi sinir sisteminin elektrolitik ortamını korur (CNS), sistemik asit-baz durumunu dengeler, nöronal ve glial hücrelere besin kaynakları, CNS için lenfatik bir sistem olarak fonksiyonları, ve hormonlar taşır, nörotransmitter, sitokinler ve CNS boyunca diğer nöropeptidler1. Böylece, BOS bileşimi CNS aktivitesini yansıttığından, bu sıvı CNS'nin fizyolojik ve patolojik durumunu karakterize etmek için değerli, dolaylı da olsa erişim sağlar.

BOS, yüz yılı aşkın bir süredir CNS'yi etkileyen koşulları teşhis etmek için kullanılmıştır ve bu süre içinde öncelikle klinisyenler tarafından bir tanı aracı olarak incelenmiştir. Ancak, son yıllarda nörobiyologlar CNS patofizyolojisi çalışma için BOS potansiyelini tanıdı. Özellikle, bu analizin dinamik değişimlere ışık tutabileceği beklentisiyle, BOS'un protein bileşiminin ayrıntılı bir şekilde incelenmesine olanak sağlayan nörolojik alanda çeşitli yüksek işlem protein analiz araçları kullanılmaya başlanmıştır. CNS içinde meydana gelen.

Luminex ve Simoa teknolojileri 2 gibi multipleksimmünoassay teknikleri teknolojik gelişmeler,3, çok düşük konsantrasyonlarda proteinlerin yüzlerce tespit yeteneği ile bugün araştırmacılar sağlar. Ayrıca, bu aynı teknolojiler küçük örnek hacimlerin kullanımına izin vermekte, böylece küçük hayvanlarda, fareler de dahil olmak üzere, sınırlı sayıda BOS numune hacminin yakın zamana kadar sıvının ayrıntılı karakterizasyonlarını engellediği çalışmaları teşvik etmektedir.

Bununla birlikte, bir uyarı BOS cinsinden ölçülen proteinlerin hasarlı bir kan-beyin arayüzü (BBI) nedeniyle intratekal sentez ve / veya serum transudation elde edilebilmiştir. Ne yazık ki, BOS protein analizi tek başına sadece bu iki bileşenin toplamını belirleyebilirsiniz. Transudate ve intrathecally üretilen proteinler arasında ayrım yapmak için, mevcut protein analiz aracını kullanan BOS protein ölçümleri serum konsantrasyonlarında bireysel değişkenlik ve bariyer bütünlüğü için ayarlanmalıdır. Ancak, bu ayarlama yaygın klinik uygulamada kullanılan rağmen, örneğin, BOS IgG indeksi, intratekal IgG sentezi tespit etmek için yüksek duyarlılığa sahip4,5,6, Bugüne kadar çok az araştırma çalışmaları serum konsantrasyonu ve bariyer bütünlüğü için BOS protein konsantrasyonları düzeltilmiş var7,8.

Günümüzde Reibergram yaklaşımı, proteinlerin bariyer fonksiyonunu ve intratekal sentezini belirlemenin en iyi yoludur. Bu analizleri BOS / serum bölüm diyagramları grafiksel bir değerlendirme, entegre bir şekilde, hem bariyer (dys) fonksiyonu ve intratekal protein sentezi, sadece kan kaynaklı protein atıfta9,10. Çok bol protein albumin genellikle referans protein olarak seçilir çünkü sadece karaciğerde üretilir ve büyüklüğü, yaklaşık 70 kDa, küçük ve büyük proteinler arasında ara protein11. Analiz diyagramı ilk olarak 1987 yılında Reiber ve Felgenhauer tarafından immünglobulinlerin (Igs)11'inana sınıfları için tanımlanmıştır, ampirik olarak binlerce insan örneğinin analizinden elde edilen sonuçlara dayanmaktadır9. Yaklaşım daha sonra moleküler difüzyon / akış hızı12teorisinde difüzyon iki Fick yasalarının uygulanması ile doğrulandı . Böyle bir teori bariyer yoluyla bir proteindifüzyon uhiperbolik bir dağılıma sahiptir ve nicel CNSproteinlerindinamiklerini açıklayabilir gösterir 9,13. Genel olarak, intratekal protein sentezini göstermek için Reibergram kullanmanın avantajı, aynı anda serumdan BOS giren protein fraksiyonunu ve yerel üretim nedeniyle BOS'ta bulunan protein miktarını aynı anda tanımlamasTır.

Bu makale ve ilgili protokol, BOS ve kan toplamadan BOS protein düzeylerini düzelten son hesaplamalara kadar tüm prosedürü, nörolojik fare modellerinde intratekal protein sentezinin nicel ölçümü için tanımlar. Bozukluk -ları. Bu prosedür, (1) herhangi bir BOS proteininin patofizyolojik kökenini ve (2) bariyer bütünlüğünün stabilitesini ve işlevsel önemini değerlendirmek için bir temel sağlar. Bu prosedür ve protokol sadece fare BOS örneklerinin değerlendirilmesinde yararlı olmakla kalmıyor, aynı zamanda nörolojik hastalıklar ve insan hastalarının çok sayıdaki hayvan modellerinde BOS'un analizinde de yararlıdır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Tüm hayvan çalışmaları, Dartmouth'taki Geisel Tıp Fakültesi'nde Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından incelenen ve onaylanan protokolleri kullanır.

1. Sıvıların toplanması

NOT: Hem serum hem de BOS gereklidir. Her sıvı toplama için iki protokol ler hayatta kalma ve nekropsi için gereklidir.

  1. Sağkalım prosedürleri kullanılarak serum ve BOS toplama
    NOT: Sağkalım sıvısı toplama için serum toplama daha az invaziv bir işlem olduğu için BOS koleksiyonundan önce yapılmalıdır. BOS serum çekilişinden sonraki bir hafta içinde alınmalıdır.
    1. Serum toplama için retro-orbital kanama prosedürü.
      NOT: Bu işlem farelerin sağkalım kanaması içindir14. Açıklanan prosedür farelerin herhangi bir yaş, cinsiyet ve suşu için geçerlidir. IACUC kuralları, vücut ağırlığının %1'inin maksimum kan hacminin tek bir kan çekimi olarak çıkarılabileni gerektirdiğinden, işlemin sadece 15 g'dan ağır farelerde yapılması önerilir.
      1. Fare içeren kafesleri raftan uygun bir çalışma alanına taşıyın. Oksijen akış ölçeri 1 L/dk'ya açarak anestezi gaz makinesini hazırlayın.
      2. Hayvanı indüksiyon odasına yerleştirin ve kapağı sıkıca kapatın. Izofluran buharlaştırıcıyı %3,5'e açın ve hayvanı bükünmeye kadar izleyin.
      3. Odadan hayvan çıkarın ve pedal refleks, yani, sıkı ayak takımı çimdik anestezi düzeyini değerlendirmek. İşlemi gerçekleştirmeden önce yeterli anestezi derinliğini sağlayın: sıkı bir kıskaç yanıt eksikliği yeterli anestezi gösterir.
      4. Baskın olmayan elin başparmak ve işaret parmağı ile kulakların arkasındaki gevşek deriyi kavrayarak anestezili fareyi dizginle. Göz üstündeki deriyi ve başparmağı geri çekmek için göz altı derisini geri çekmek için işaret parmağını kullanarak gözleri şişkinlik.
      5. Pasteur pipetinin ucunu göz küresinin altındaki göz çukuruna yerleştirin(Şekil 1, sol panel), ucu yaklaşık 45° olarak göz çukurunun ortasına doğru yönlendirin(Şekil 1, sağ panel). Pipeti ileri geçiş sırasında parmakların arasında döndürün. Hafif basınç uygulayın ve kan pipet girene kadar bırakın.
        NOT: Bu konumdan bir anda çekilebilecek maksimum kan miktarı vücut ağırlığının yaklaşık %1'idir, örneğin 20 g fareden 0.2 mL.
      6. Kapilleri yavaşça çıkararak göz yaralanmasını önleyin ve toplanan kanı 1,5 mL'lik bir santrifüj tüpüne yerleştirin. Göz kapağını kapatın ve daha fazla kanamayı önlemek için gazlı bez ile hafif basınç uygulayın. Bir kez tam uyarı ve mobil (genellikle 3−5 dk), onun tutma kafesi için fare dönün.
      7. Oda sıcaklığında 30−60 dakika (RT) için kanın pıhtılaşmasına izin verin, ardından 4 °C'lik soğutuculu santrifüjde 2.000 x g'da 10 dakika santrifüj kan verin. Temiz bir pipet tekniği kullanarak serumu 0,5 mL etiketli yeni bir şişeye toplayın. Serum şişesini hemen -80 °C'de dondurun.
    2. Hayatta kalma prosedürü ile BOS toplama
      NOT: Bu işlem sağkalım cerrahisi içindir ve Liu ve Duff tarafından 2008 yılında yayınlanan protokole dayanmaktadır.15. Fareler intraperitoneal olarak uygulanan Ketamin (20 mg/mL), ksilazin (0.5 mg/mL) ve asetpromazin (0.5 mg/mL) kokteylile anestezi edilir.
      1. Fare içeren kafesleri raftan belirlenmiş bir ameliyat çalışma alanına taşıyın. Steril bir ortamda ameliyat alanı hazırlayın. Kullanılan tüm alet ve malzemelerin ameliyattan önce sterilize edilmesini sağlayın.
      2. Fareyi tartın ve gerekli anestezi hacmini hesaplayın (20 g fare için 0,1 mL anestezi kokteyli). Anestezi intraperitoneal16enjekte edin. Birkaç dakika sonra, yeterli anestezi sağlamak için ayak takımı çimdikleyerek fareyi test edin. Daha fazla anestezi gerekiyorsa, anestezik kokteylin 0.01−0.03 mL daha fazla enjekte edin.
      3. BOS koleksiyonu için yeterince büyük çalışma alanını ortaya çıkarmak için, kafanın küçük bir alanını, kafatasıüzerinde medial üzerinde, küçük bir alanı tıraş etmek için makas veya tıraş layıcı kullanın. Fareyi stereotaksik aletin üzerinde eğilimli pozisyonda konumlandırın ve kulak çubuklarını kullanarak başı sabitler(Şekil 2A).
        NOT: Fare, kafanın gövdeyle yaklaşık 135° açı kurabilmesi için yere serilir (Şekil 2A). Hayvan konumlandırıldıktan sonra, cerrahi alanda steril bir alan korumak için cerrahi bir örtü kullanılır. Farelerde BOS koleksiyonu için net yapışkan perdeler tercih edilir, çünkü hayvanın doğrudan ve daha odaklı görselleştirilmesine olanak sağlar.
      4. % 30 klorheksidin diasetat ile cerrahi site swab. Steril bir neşter kullanarak, sarsıcı bir kesi yapmak ocisterna magna örten kasları ortaya çıkarmak için occiput aşağı deri.
      5. Forceps ile künt diseksiyon ile, sarnıç magna ortaya çıkarmak için deri altı doku ve kasları ayırmak (Şekil 2B). Kasları ayrı tutmak için mikroretraktörler kullanın(Şekil 2B)ve sarnıç magna üzerinde dura mater meningeal tabakası ortaya çıkarmak.
      6. Olası kan kontaminasyonunu gidermek için steril fosfat tamponlu salin (PBS) ile hafifçe yıkayın. Leke steril pamuklu bir bez ile dura mater kuru ve hafifçe 30 G iğne ile sarnıç magna kapsayan membran delin. BOS'u toplamak için hızlı ve hafifçe küçük bir cam kılcal tüp takın (Şekil 2C).
        NOT: İntrakraniyal basınç BOS'un kılcal damara kendiliğinden akmasını sağlar (Şekil 2C). Farenin yaşına ve boyutuna bağlı olarak her fareden yaklaşık 5−12 μL BOS elde edilir.
      7. Kılcal tüpü membrandan dikkatlice çıkarın. Tüpü polietilen bir tüp(Malzeme Tablosu)aracılığıyla 3 mL şırıngaya bağlayın ve toplanan BOS'u 0,5 mL etiketli bir tüpe enjekte edin(Şekil 2D). Şişeleri buzda tut.
      8. Tek kullanımlık iğne ile polidioxanone sütür (PDS) kullanarak ve gömülü dikişler kullanılarak kesikapatın 17. Herhangi bir kurutulmuş kan veya doku alanı temizleyin.
      9. Analjezik tedavi olarak 0.05−0.1 mg/kg buprenorfin hidroklorür içeren farelere deri altı veya intraperitoneal16enjekte edin. Ayrıca, dehidratasyon önlemek için steril salin subkutan 1 mL enjekte.
      10. Kurtarma için temiz ve sıcak bir kafese fare geri yerleştirin. Fare hareket halinde ve yiyecek ve suya ulaşabildikten sonra kafesi rafa geri yerleştirin.
      11. 4 °C'lik soğutulmuş santrifüjde 10 dk x g 4 °C'lik bir santrifüjde santrifüj BOS. Ksanthochromia'nın belirlenmesi ve tüpün alt kısmında kırmızı bir pelet bulunması için görsel inceleme ile kan kontaminasyonu derecesini kontrol edin. Kanla kirlenmiş örnekleri atın.
        NOT: Kanla kontamine olmuş numunelerde BOS protein miktarlarının düzeltilmesiiçin kullanılan formül, BOS ve serumda protein içeriği, hematokrit (HCT) ve BOS'ta kırmızı kan hücreleri (RBC) sayımı ve kan18'iiçeren denklem parametrelerine dayanmaktadır. Ancak, bu tür bir düzeltme stratejisi fare BOS örneklerine küçük hacim nedeniyle kolayca uygulanamadığından, düzeltme stratejisini görsel bir denetimle sınırlandırmaktadır.
      12. Temiz bir pipet tekniği kullanarak BOS'u yeni bir 0,2 mL tüp halinde toplayın ve peleti hücrelerle birlikte geride bırakın. Aerosol nedeniyle hacim kaybını azaltmak için PBS ile Bos 1:3 seyreltin. BOS şişesini hemen -80 °C'de dondurun.
  2. Sağkalım dışı prosedürler kullanılarak serum ve BOS toplama
    NOT: Hayatta kalmayan sıvı toplama için, farenin nabzının olması gerektiğinden BOS toplama serum toplamadan önce gelir.
    1. Nekropsi de BOS koleksiyonu
      NOT: Bu işlem sağkalım dışı cerrahi içindir ve her fareden yaklaşık 10−20 μL BOS elde edilir. Steril cerrahi alan önerilir, ancak sağkalım dışı cerrahi için gerekli değildir.
      1. Fare içeren kafesleri raftan rahat bir çalışma alanına taşıyın. BOS koleksiyonu için 1.1.2.2−1.1.2.7 ve 1.1.2.11−1.1.2.12 adımlarını izleyin. Serum toplama için bölüm 1.2.2'ye devam edin.
    2. İntrakardiyak delinme yoluyla kan toplanması (açık yaklaşım)
      NOT: Beklenen kan hacimleri vücut ağırlığının yaklaşık %3'üdür, örneğin 20 g fareden 0.6 mL.
      1. BOS koleksiyonunu takiben, farenin ayak bileliğini sıkıştırarak hala yeterince anestezi sağladığından emin olun. Herhangi bir reaksiyon gözlenirse, anestezik ikinci bir doz uygulayın. Reaksiyon gözlenmezse, devam edin.
      2. % 70 alkol ile arka ve karın deri bezi hayvan yerleştirin. Cerrahi makas ile göğüs boşluğunu açın ve kalbi ortaya çıkarın. Sol ventriküle 25 G iğne (3 mL şırınga bağlı) yerleştirin ve şırınga pistonuna hafifçe negatif basınç uygulayın. Kan toplandıktan sonra iğneyi geri çekin.
      3. Hayvanın ölmüş olduğundan emin olmak için kafa kesme veya servikal çıkık gibi ötanazi ikinci bir yöntem gerçekleştirin.
      4. Şırınganın pistini aşağı itin ve toplanan kanı 1,5 mL'lik bir şişeye enjekte edin. RT'de 30-60 dakika kanın pıhtılaşmasına izin verin ve 4 °C'lik soğutuculu santrifüjde 2.000 x g'de 10 dakika santrifüj edin.
      5. Temiz pipet tekniğini kullanarak serumu 0,5 mL etiketli yeni bir şişeye toplayın. Serum şişesini -80 °C'lik bir dondurucuda hemen dondurun.

2. Protein analizi

  1. Uyumlu serum ve BOS örneklerinde hedef protein(ler) ve albuminlerin ölçülmesi için Luminex teknolojisi gibi tercih edilen bir yöntem kullanın.
    NOT: Burada Luminex manyetik teknolojisi ile bir örnek verilir, ancak enzime bağlı immünosorbent tahlilleri (ELISA) dahil olmak üzere protein miktarlarını ölçen hemen hemen her teknik mevcut protokole uygulanabilir. İdeal olarak, BOS ve serum örnekleri aynı platformda hem albumin hem de hedef proteinler için çalıştırılır. Test koşulları, antijen-boncuk bağlantı konsantrasyonu, serum ve BOS numune seyreltmeleri, her bir analiz için en uygun standart eğriler ve spesifik olmayan reaktiviteyi azaltmak için tampon bileşimi gibi protokoldeki önemli adımlar için optimize edilmelidir. Protein ölçümü için ticari bir kit kullanılıyorsa, örneğin, immünglobulin isotipleme kiti (Malzeme Tablosu) içinde sunulan verileri elde etmek için kullanılanŞekil 3, üreticilerin talimatlarına uyulmalıdır.
    1. Çözülme üzerine ve analizden önce, BOS ve serum numuneleri (10 dk için 2.000 x g) santrifüj ve filtre plakaları ve /veya probun tıkanmasını önlemek için supernatant kullanın. Uygun numune seyreltmeleri için kit ile sağlanan test prosedürünü uygulayın. Aksi takdirde, her analit ve sıvı için uygun seyreltme belirleyin. PBS'deki numuneleri buna göre seyreltin.
      NOT: Belirli bir kılavuz veya talimat yoksa, her bir analit ve sıvı için seyreltmeler çalışma testinden önce, en fazla içine giren konsantrasyon tahminlerini elde etmek için gerekli seyreltme aralıkları belirlenerek kurulmalıdır. standart bir eğrinin güvenilir aralığı. Analiz edilecek biyolojik numunenin özelliklerini bilmek, örneğin sıvıdaki fizyolojik ve patolojik konsantrasyonlar, düşük, orta ve yüksek analit içeriği örnekleri ile farklı seyreltmelerin yapılmasına olanak sağlar. Numunelerde beklenen konsantrasyon aralığının a priori olarak biliniyorsa, seçilen standart eğri aralığında olmak için numunenin kaç kez seyreltilmesi gerektiği hesaplandıktan sonra seyreltmeler seçilebilir.
      DİkKAT: Seyreltme faktörleri hesaplanarak, BOS'un 1:3 seyreltildiğini unutmayın.
    2. Referans standart proteinleri seri olarak seyrelterek Şekil 3'teveri oluşturmak için kullanılan albumin ve IgG gibi ilgi çeken her protein için standart bir eğri hazırlayın. Standart eğrilerin hazırlanması sırasında, bir sonraki seyreltme yapmadan önce iyice her yüksek konsantrasyon karıştırın.
      NOT: Seçilen nicelik yöntemine bakılmaksızın, numunelerde protein konsantrasyonunu tahmin etmek için her test yapıldığında standart bir eğri nin dahil edilmesi esastır. Bir referans standart için en iyi seçim ilgi protein saflaştırılmış, bilinen konsantrasyonudur. Standart eğriyi tanımlamak için kullanılan veri noktalarının ve çoğaltmaların sayısının yanı sıra belirli seyreltmelere karar vermek, standart eğrideki doğrusal olmayanlık derecesine bağlıdır.
    3. Uygun antikor-çiftli manyetik boncuk setleri seçin(Malzeme Tablosu). Boncuk bireysel şişeler için, 30 s ve girdap için her şişe sonicate 1 dakika. Boncuk stokları her set / μL her set / μL son konsantrasyonu için seyrelterek bir "çalışan boncuk karışımı" hazırlamak tahlil / yıkama tampon (PBS, 1% sığır serum albumin [BSA]). Her kuyuya düz tabanlı 96 kuyulu bir plaka(Malzeme Tablosu)50 μL karışık boncuk ekleyin.
      DİkKAT: Floresan boncuklar ışığa duyarlıdır. Bu nedenle, prosedür boyunca ışığa uzun süre maruz kalmaktan korunmalıdır.
    4. Geçmişlerin, standartların ve örneklerin iyi bir harita çalışma sayfasına yerleştirilmesi diyagramı.
    5. Her arka plan için 50 μL'lik test/yıkama arabelleği ve standart eğri için kuyulara her standarttan 50°L ekleyin. Seyreltilmiş her numunenin 50 mL'ini uygun kuyulara son olarak yükleyin. Rt 30 dakika boyunca bir tabak çalkalayıcı üzerinde ajitasyon (~ 800 rpm) ile folyo ve kuluçka ile plaka sarın.
    6. Plakayı el mıknatısına(Malzeme Tablosu)yerleştirin ve manyetik boncukların tam olarak ayarlanmasına izin vermek için plakayı ~60 s için mıknatısın üzerine koyun. Plakayı yavaşça dekantasyon yaparak iyi içeriği çıkarın ve artık sıvıyı çıkarmak için emici pedlere dokunun.
    7. Plakayı mıknatıstan çıkararak, ~30 s için sallayarak ve son olarak mıknatısa yeniden takarak 200 μL'lik bir yıkama tamponu ekleyerek yıkayın. 3x yıkamatekrarlayın.
    8. Biyotinylated algılama antikor seyreltmek, yani, biyotin etiketli antikor protein konak türlerine karşı yükseltilmiş, için 4 μg/mL için ispat / yıkama tampon. Her kuyuya seyreltilmiş algılama antikorunun 50 000'ini ekleyin. Plakayı kapatın ve ~800 rpm'de plaka çalkalayıcıda RT'de 30 dk kuluçkaya yatın. Plakayı mıknatısın üzerine yerleştirin ve 2.1.6 ve 2.1.7 adımlarını tekrarlayın.
    9. Seyreltik phycoerythrin (PE)-konjuge streptavidin (SAPE) için 4 μg/mL ispat / yıkama tampon. Her kuyuya 50°L seyreltilmiş SAPE ekleyin. Plakayı kapatın ve ~800 rpm'de plaka çalkalayıcıda RT'de 30 dk kuluçkaya yatın. Plakayı mıknatısın üzerine yerleştirin ve 2.1.6 ve 2.1.7 adımlarını tekrarlayın.
    10. Plakayı mıknatıstan çıkarın ve boncukları 100 μL'lik bir aratla/yıkama tamponunda yeniden askıya alın. PE floresan yoğunluğunun (FI) büyüklüğünün algılanmasını sağlayan çift lazer akış tabanlı algılama cihazı ile kuyuları okuyun.
      NOT: Üretilen sinyal, örneğin FI, boncukyüzeyine bağlı hedef antijen miktarı ile orantılıdır.
    11. Ham verileri dışa aktarın ve algılama sinyali FI'yi standart protein konsantrasyonlarına karşı grafikleştirerek standart eğriler oluşturun. Örneklerdeki analit konsantrasyonunun hesaplanması için standart eğri(ler)i kullanın.
      NOT: Albumin tercihen g/dL ile, ilgi proteinleri ise tercihen mg/dL ile ifade edilir.

3. İntekal indeks hesaplamaları

  1. Protein konsantrasyonu değerlerini bir elektronik tabloda düzenleyin ve aşağıdaki formülleri uygulayarak sonuçları analiz edin.
  2. Qalbuminhesapla:
    Albümin katsayısı denklemi, Q_albumin formülü, BOS ve Serum albümin düzeylerinin ilişkilendirilmesi.
    bosalbumin ve Serumalbuminin ineşe serum ve BOS örneklerinde albumin konsantrasyonları olduğu durumlarda, sırasıyla.
  3. Qproteininihesapla :
    Protein konsantrasyon oranı denklemi Q_protein=(CSF_protein/Serum_protein), biyokimyasal analiz.
    BOSproteini ve Serumproteininin sırasıyla serum ve BOS örneklerinde hedef protein(ler) konsantrasyonları olduğu durumlarda.
  4. Protein indeksini hesaplayın:
    Protein indeksi formülü, denklem, Q_protein/Q_albumin, biyokimyasal analiz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Bu temsili deney multipl skleroz (MS) iki klinik olarak ilgili kemirgen modelleri IgG intratekal sentezini karşılaştırmayı amaçladı: PLP139-151-deneysel otoimmün ensefalomiyelit (R-EAE) ve kronik progresif nüks, Theiler's murine ensefalomiyelit virüsü kaynaklı demiyelinating hastalık (TMEV IDD). R-EAE relaps-remitting MS anlamak için yararlı bir model, TMEV-IDD modeli kronik progresif MS özellikleri ise19.

Bu çalışmada R-EAE (n = 12) ve TMEV-IDD (n = 28) intr...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Artmış BOS protein konsantrasyonlarının değerlendirilmesi için kullanılan kantitatif yöntemler, CNS'nin fizyolojik ve patolojik durumunun karakterizasyonunda yararlı araçlardır. Ancak, BOS protein düzeylerinin güvenilir bir şekilde ölçülmesinin ötesinde, BOS proteinlerinin saptanması, BOS'ta kan ve CNS kaynaklı fraksiyonlar arasında ayrım yapan sonuçların bir ifadesi nin ifade sini gerektirir. Ancak, bugüne kadar, yaygın olarak kullanılan protein niceleme tahlilleri iki protein bileşeni arasında ayrımcılığa izin vermez, ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Teşekkürler

Yazarlar Karşılaştırmalı Tıp ve Araştırma Merkezi (CCMR) Dartmouth de fareler bu çalışmalar için kullanılan kendi uzman bakımı için personel teşekkür ederiz. Bu araştırmayı Bornstein Araştırma Fonu finanse etti.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
1 mL insülin şırıngasıBD329650
1 mL şırıngaBD329622
25 gauge iğneBD305122
30 gauge insülin iğnesiBD305106
Emici pedlerHerhangi bir uygun marka
AsepromazinPatterson Vet Supply Inc
BioPlex El Tipi Manyetik YıkayıcıBioRad171020100Mıknatıs
BioPlex MAGPIX Multipleks OkuyucuBioRad171015001
BioPlex Pro Düz Tabanlı PlakalarBioRad171025001
Biotinilated tespit antikoruHerhangi bir uygun kaynakAntikor, aşağıdaki türlere karşı yönlendirilmelidir: İlgilenilen protein.
Sığır Serum Albümini (BSA)SigmaA4503
Buprenorfin hidroklorürPAR FarmasötikNDC 42023-179-05
Kılcal TüplerSutter AletiB100-75-10OD: 1.0 mm, ID: 0.75 mm Borosilikat cam 10 cm; ID'yi küçültmek için Bunsen'in üzerine çizilmiştir.
Santrifüj tüpü, 0.2 mLVWR20170-012
Santrifüj tüpü, 0.5 mLVWR87003-290
Santrifüj tüpü, 1.5 mLVWR87003-294
Klorheksidin diasetatNolvasanE004272
Tek kullanımlık pipet uçlarıHerhangi bir uygun marka
Kulak çubuklarıKOPF Instruments1921 veya 1922
EtanolKopterV1001
DondurucuVWRVWR32086A
Gazlı BezMedlineNON25212
Isıtma yastığıSunbeamXL King Size SoftTouch, Otomatik Kapanmalı 4 Isı Ayarı, Deniz Mavisi, 12 İnç x 24 İnç
İndüksiyon OdasıVETEQUIP
IsofluranPatterson Veteriner Tedarik A.ŞNDC 14043-704-06
Ketamin (KetaVed)Patterson Vet Tedarik A.Ş
MagPlex Mikroküreler (antikorla birleştirilmiş)BioRadAntikor bağlantılı manyetik boncuk
Mikroplaka ÇalkalayıcıGüneybatı BilimselSBT1500
Mikro EkartörlerDolum KalitesiACD-010Kör - 1 mm
Microsoft Office (Excel)Microsoft
MilliPlex MAP Fare İmmünoglobulin İzotipleme Manyetik Boncuk PaneliEMD MilliporeMGAMMAG-300KFare sıvılarındaki immünoglobulin izotipleri ve alt sınıflarından oluşan bir panelin Luminex aracılığıyla miktar tayini için ticari kit.
Fare Albümin yakalama ELISA kitiNovus BiologicalNBP2-60484Fare sıvılarındaki albüminin ELISA aracılığıyla miktar tayini için ticari kit.
Çok kanallı pipetEppendorf3125000060
Steril olmayan swablarMediChoiceWOD1002Sterilite için otoklavlanması gerekiyor
OksijenAIRGASOX USPEA
Pasteur PippettesFisher13-678-20A5 & 3/4"
Tek kullanımlık iğneli PDS sütür, 6-0 ProlenPatterson Vet8695GP-3 Ters Kesim, 18
" PE-StreptavidinBD Biosciences554061
PipetleyicilerEppendorfResearch seriers
Polietilen boru
Soğutmalı SantrifüjBeckman CoulterALLEGRA X-12R
ÖlçekliUlineH2716
NeşterTüyüEF7281
Tıraş MakinesiHarvard Aparatı52-5204
Standart proteinlerHerhangi bir uygun kaynakBir referans standardı için en iyi seçim, ilgilenilen proteinin saflaştırılmış, bilinen bir konsantrasyonudur.
Stereotaksik aletKOPF InstrumentsModel 900LSStandart Aksesuarlar
Steril 1 x PBSCorning Cellgro21-040-CV
Steril salinBaxter0338-0048-02% 0,9 Sodyum Klorür Sulama USP
Cerrahi Forseps Kavisli, 7 (2)Güzel Bilim Araçları11271-30Dumont
Cerrahi MakasGüzel Bilim Araçları14094-11Paslanmaz 25x
Buharlaştırıcı + Akış ölçerModuflex Anestezi Aletleri
VortexFisher02-215-414
Isıtma pediKent Scientific CorporationRT-JR-20
Su SonikatörüCole ParmerEW-08895-01
KsilazinPatterson Veteriner Tedarik A.Ş
3 mL şırınga BD 309582 . . .

Kaynaklar

  1. Whedon, J. M., Glassey, D. Cerebrospinal fluid stasis and its clinical significance. Alternative Therapies in Health and Medicine. 15 (3), 54-60 (2009).
  2. Kang, J. H., Vanderstichele, H., Trojanowski, J. Q., Shaw, L. M. Simultaneous analysis of cerebrospinal fluid biomarkers using microsphere-based xMAP multiplex technology for early detection of Alzheimer's disease. Methods. 56 (4), 484-493 (2012).
  3. Barro, C., et al. Fluid biomarker and electrophysiological outcome measures for progressive MS trials. Multiple Sclerosis. 23 (12), 1600-1613 (2017).
  4. Tourtellotte, W. W., et al. Multiple sclerosis: measurement and validation of central nervous system IgG synthesis rate. Neurology. 30 (3), 240-244 (1980).
  5. Bonnan, M. Intrathecal IgG synthesis: a resistant and valuable target for future multiple sclerosis treatments. Multiple Sclerosis International. 2015, 296184(2015).
  6. Reiber, H. Cerebrospinal fluid--physiology, analysis and interpretation of protein patterns for diagnosis of neurological diseases. Multiple Sclerosis. 4 (3), 99-107 (1998).
  7. DiSano, K. D., Linzey, M. R., Royce, D. B., Pachner, A. R., Gilli, F. Differential neuro-immune patterns in two clinically relevant murine models of multiple sclerosis. Journal of Neuroinflammation. 16 (1), 109(2019).
  8. Pachner, A. R., Li, L., Lagunoff, D. Plasma cells in the central nervous system in the Theiler's virus model of multiple sclerosis. Journal of Neuroimmunology. 232 (1-2), 35-40 (2011).
  9. Reiber, H. Flow rate of cerebrospinal fluid (CSF)--a concept common to normal blood-CSF barrier function and to dysfunction in neurological diseases. Journal of Neurological Sciences. 122 (2), 189-203 (1994).
  10. Reiber, H., Zeman, D., Kusnierova, P., Mundwiler, E., Bernasconi, L. Diagnostic relevance of free light chains in cerebrospinal fluid - The hyperbolic reference range for reliable data interpretation in quotient diagrams. Clinica Chimica Acta. 497, 153-162 (2019).
  11. Reiber, H., Felgenhauer, K. Protein transfer at the blood cerebrospinal fluid barrier and the quantitation of the humoral immune response within the central nervous system. Clinica Chimica Acta. 163 (3), 319-328 (1987).
  12. Dorta-Contreras, A. J. Reibergrams: essential element in cerebrospinal fluid immunological analysis. Revista de Neurologia. 28 (10), 996-998 (1999).
  13. Metzger, F., Mischek, D., Stoffers, F. The Connected Steady State Model and the Interdependence of the CSF Proteome and CSF Flow Characteristics. Frontiers Neuroscience. 11, 241(2017).
  14. Wolforth, J. Methods of blood collection in the mouse. Laboratory Animals. 29, 47-53 (2000).
  15. Liu, L., Duff, K. A technique for serial collection of cerebrospinal fluid from the cisterna magna in mouse. Journal of Visualized Experiments. (21), e960(2008).
  16. Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. Manual restraint and common compound administration routes in mice and rats. Journal of Visualized Experiments. (67), e2771(2012).
  17. Johnston, S. A., Tobias, K. M. Veterinary Surgery: Small Animal Expert Consult - E-Book. Elsevier Health Sciences. , (2017).
  18. Nigrovic, L. E., Shah, S. S., Neuman, M. I. Correction of cerebrospinal fluid protein for the presence of red blood cells in children with a traumatic lumbar puncture. Journal of Pediatrics. 159 (1), 158-159 (2011).
  19. McCarthy, D. P., Richards, M. H., Miller, S. D. Mouse models of multiple sclerosis: experimental autoimmune encephalomyelitis and Theiler's virus-induced demyelinating disease. Methods in Molecular Biology. 900, 381-401 (2012).
  20. Link, H., Tibbling, G. Principles of albumin and IgG analyses in neurological disorders. II. Relation of the concentration of the proteins in serum and cerebrospinal fluid. Scandinavian Journal of Clinical Laboratory Investigation. 37 (5), 391-396 (1977).
  21. Tibbling, G., Link, H., Ohman, S. Principles of albumin and IgG analyses in neurological disorders. I. Establishment of reference values. Scandinavian Journal of Clinical Laboratory Investigation. 37 (5), 385-390 (1977).
  22. Deisenhammer, F., et al. Guidelines on routine cerebrospinal fluid analysis. Report from an EFNS task force. European Journal of Neurology. 13 (9), 913-922 (2006).
  23. Johanson, C. E., Stopa, E. G., McMillan, P. N. The blood-cerebrospinal fluid barrier: structure and functional significance. Methods in Molecular Biology. 686, 101-131 (2011).
  24. Zaias, J., Mineau, M., Cray, C., Yoon, D., Altman, N. H. Reference values for serum proteins of common laboratory rodent strains. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 48 (4), 387-390 (2009).
  25. Felgenhauer, K., Renner, E. Hydrodynamic radii versus molecular weights in clearance studies of urine and cerebrospinal fluid. Annals of Clinical Biochemistry. 14 (2), 100-104 (1977).
  26. Pachner, A. R., DiSano, K., Royce, D. B., Gilli, F. Clinical utility of a molecular signature in inflammatory demyelinating disease. Neurology, Neuroimmunology & Neuroinflammation. 6 (1), 520(2019).
  27. Pachner, A. R., Li, L., Gilli, F. Chemokine biomarkers in central nervous system tissue and cerebrospinal fluid in the Theiler's virus model mirror those in multiple sclerosis. Cytokine. 76 (2), 577-580 (2015).
  28. Gerbi, C. Protein concentration in the arterial and venous renal blood serum of the rabbit. Archives of Biochemistry and Biophysics. 31 (1), 49-61 (1951).
  29. Abbott, N. J., Patabendige, A. A., Dolman, D. E., Yusof, S. R., Begley, D. J. Structure and function of the blood-brain barrier. Neurobiology of Disease. 37 (1), 13-25 (2010).
  30. Reiber, H. Proteins in cerebrospinal fluid and blood: barriers, CSF flow rate and source-related dynamics. Restorative Neurology and Neuroscience. 21 (3-4), 79-96 (2003).
  31. Reiber, H. Knowledge-base for interpretation of cerebrospinal fluid data patterns. Essentials in neurology and psychiatry. Arquivos de Neuropsiquiatria. 74 (6), 501-512 (2016).
  32. Kuehne, L. K., Reiber, H., Bechter, K., Hagberg, L., Fuchs, D. Cerebrospinal fluid neopterin is brain-derived and not associated with blood-CSF barrier dysfunction in non-inflammatory affective and schizophrenic spectrum disorders. Journal of Psychiatric Research. 47 (10), 1417-1422 (2013).
  33. Bromader, S., et al. Changes in serum and cerebrospinal fluif cytokines in response to non-neurological surgery: an observational study. Journal of Neuroinflammation. 9, 242(2012).
  34. Starhof, C., et al. Cerebrospinal fluid pro-inflammatory cytokines differentiate parkinsonian syndromes. Journal of Neuroinflammation. 15 (1), 305(2018).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Daha fazla makale keşfet

İntratekal Protein SenteziBOS Protein AnaliziKan Beyin BariyeriAlbumin BOS Serum KocyentiProtein İndeksi HesaplamasıFare BOS ToplamaRetroorbital KanamaKardiyak Ponksiyon SerumuSantrifügasyon Serum AyırımıFloresan Şiddeti Ölçümü
Farelerde İntrathecally Sentezlenmiş Proteinlerin Kantitatif Ölçümü
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.