Yöntem makalesi

Gen Ekspresyonu Analizi için Fare Embriyonik Kıkırdağı ve Kemiğinin Lazer Yakalama Mikrodizmesi

DOI:

10.3791/60503

⸱

18 Aralık 2019

 ,  ,  ,  , 
1Department of Genetics and Genomic Sciences, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 2Icahn Institute for Data Science and Genomic Technology, Icahn School of Medicine at Mount Sinai

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, fare embriyosu taze dondurulmuş bölümlerinden kıkırdak ve kemik izolasyonu için lazer yakalama mikrodizeksiyon açıklar. Kıkırdak ve kemik hızla cresyl menekşe boyama ile görselleştirilmiş ve transkripsiyonanalizi için yüksek kaliteli RNA verim hassas toplanabilir.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Lazer yakalama mikrodiseksiyon (LCM) heterojen dokulardan belirli hücre tipleri veya ilgi bölgeleri izole etmek için güçlü bir araçtır. İskelet elemanlarının hücresel ve moleküler karmaşıklığı gelişme ile birlikte artar. Doku heterojenliği, birbirleriyle veya çevre dokularla kıkırdak ve kemik gelişen çalışma için bir engel dir. Protokolümüz, gen ekspresyonu analizi için yüksek kaliteli RNA sağlayan kıkırdak ve kemiğin doku işleme ve izolasyonhızlı bir yöntem sağlar. Fare embriyolarının taze dondurulmuş dokuları kesitli ve kısa tere mor boyama çevreleyen dokulardan farklı renklerle kıkırdak ve kemik görselleştirmek için kullanılır. Slaytlar daha sonra hızla susuz, ve kıkırdak ve kemik lcm tarafından daha sonra izole edilir. Bu işlem sırasında sulu çözeltilere maruz kalmanın en aza inmesi RNA bütünlüğünü korur. Mouse Meckel'in E16.5'teki kıkırdağı ve mandibuler kemiği başarılı bir şekilde toplanmış ve gen ekspresyonu analiziosteoblastlar, osteositler, osteoklastlar ve kondrositler için marker genlerin diferansiyel ekspresyonu göstermiştir. Yüksek kaliteli RNA da dokular ve embriyonik çağlar bir dizi izole edildi. Bu protokol, kriyoksasyon, kesitleme, boyama ve taze dondurulmuş dokuların susuz kalması ve kıkırdak ve kemiğin LCM ile hassas izolasyonu gibi LCM için numune hazırlamasını ayrıntılarıyla belirterek transkripskopik analiz için yüksek kaliteli RNA sağlar.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kas-iskelet sistemi kas, bağ dokusu, tendon, bağ, kıkırdak ve kemik, sinirler tarafından innerve ve kan damarları tarafından vaskülarize oluşan çok bileşenli bir sistemdir1. İskelet dokuları artan hücresel heterojenlik ve yapısal karmaşıklık ile gelişir. Kıkırdak ve kemik aynı osteokondroprojenitor soydan gelişir ve son derece ilişkilidir. Embriyonik kıkırdak ve kemik kaslar, sinirler, kan damarları ve farklılaşmamış mezenkim ile birlikte gelişir. Kıkırdak da kemik ile çevrili olabilir, Meckel kıkırdak ve mandibuler kemik içinde kondize kıkırdak gibi. Bu dokular anatomik olarak ilişkilidir ve gelişim sırasında hücre dışı sinyaller aracılığıyla birbirleriyle etkileşime geçerler. Kıkırdak ve kemik gelişiminde gen ekspresyonunun incelenmesinde, birden fazla doku tipinden oluşan iskelet yapılarının heterojenliği bir engeldir. İlgi dokusunun hassas izolasyonu başarılı transkripsiyonel analiz için anahtardır.

Lazer yakalama mikrodiseksiyon (LCM) heterojen dokular içinde hücre tipleri veya ilgi bölgeleri izole etmek için güçlü bir araçtır, ve tekrarlanabilir ve tek hücre seviyesine duyarlı2. Bu kesin hedef ve transkriptomik, genomik ve proteomik3,4downstream tahliller geniş bir yelpazede için ilgi hücreleri yakalamak . İzole RNA, DNA veya proteinin kalitesi biyoanalizör veya eşdeğer bir platform ile değerlendirilebilir. Örneğin, RNA kalitesi RNA bütünlük numarası (RIN)5ile gösterilir.

Burada, taze dondurulmuş dokulardan LCM tarafından kıkırdak ve kemik hızlı boyama ve izolasyon için bir protokol sağlar. Fare embriyosu kullanarak bu protokolün rna dizilemesi (RNA-seq) gibi sonraki transkripsiyonanalizi için yüksek kaliteli RNA verdiğini gösteriyoruz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Farelerden elde edilen dokular, Ulusal Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Sağlık Enstitüleri Rehberi'ne uygun olarak elde edildi ve çalışma protokolleri Sina Dağı'ndaki Icahn Tıp Fakültesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylandı.

1. Taze Dondurulmuş Numunenin Hazırlanması

  1. Embriyoyu veya ilgi çekici dokuyu inceleyin. Numuneyi en iyi kesme sıcaklığı (OCT) bileşiğiyle tek kullanımlık gömme kalıbına gömün. Numunenin yönünü bir ucu veya iğneile ayarlayın.
  2. Numuneleri kuru buz/metil-2-bütan banyosunda hızla dondurun. Bir sonraki adıma devam edin veya -80 °C'de saklayın.
    NOT: Protokol burada duraklatılmış olabilir.

2. Lazer Yakalama Mikrodisseksiiçin Kriyoding

  1. Kriyostat'ı çözün ve iç yüzeyleri %70 etanol ile temizleyin. Anti-roll plakasını ve bir çift forceps'ü RNase dekontaminasyon maddesi ile tedavi edin. Kriyostat'ı istenilen kesme sıcaklığına (-18 ila -22 °C) ayarlayın. Kriyosiksiyon sırasında kesitli numune slaytların geçici olarak saklanması için kuru buz üzerine alüminyum folyo bir levha yerleştirerek kuru buzlu kapaklı bir kap hazırlayın.
    DİkKAT: Kuru buz son derece soğuktur. Kuru buzu her zaman özenle kullanın ve her kullanırken yalıtımlı eldiven ler giyin.
  2. Taze dondurulmuş numuneyi kuru buz kovasına aktarın. Bir kriyostat numune tutucuüzerine OCT bileşik bir tabaka yerleştirin ve hemen nazik basınç ile OCT üstüne örnek yerleştirin. OCT tamamen dondurulduğunda, tutucuyu numuneyle birlikte kriyostat kesme koluna bağlayın.
  3. Kesme sıcaklığına dengelemek için numuneyi kriyostatta 15 dk bekletin.
  4. Dokuyu kesip 12 μm kalınlığında polietilen naftalat (PEN) membran slaytlarında dilimleri toplayın. Membran üzerinde ardışık bölümleri hizalayın. Bir slayt tamamlandıktan sonra, bölümlerin birkaç dakika kurumasını bekleyin ve gerekli tüm slaytlar toplanana kadar kaydırağı kuru buz kabındaki folyoya aktarın.
  5. Slaytları -80 °C'de bir slayt kutusunda saklayın.
    NOT: Kesit kalınlığı, dokunun verimli kesilmesine izin verirken toplanan doku miktarını en üst düzeye çıkarmak için seçilir ve ilgi dokuya bağlı olarak değişebilir. Protokol burada duraklatılmış olabilir. Slaytları RNase kontaminasyonundan uzak tutun. Sıcaklık değişimlerinden kaçının. 6 aya kadar depolanan slaytlardan RNA'nın RNA'ları hala RNA'nın yüksek kalitesini gösterse de, slaytları mümkün olan en kısa sürede kullanmanızı öneririz.

3. Lazer Yakalama Mikrodisseksi için Örnek Hazırlama

  1. Boyama ve dehidratasyon için çözümler hazırlayın.
    1. Buz üzerinde üç 50 mL santrifüj tüpü her 45 mL% 80 etanol yerleştirin. Bunları #1, #2 ve #3 olarak etiketleyin. RNase/DNase içermeyen su ile etanol seyreltin.
    2. Buz üzerinde 50 mL santrifüj tüpüne 45 mL%95 etanol yerleştirin.
    3. Buz üzerinde 50 mL santrifüj tüpüne 45 mL %100 etanol yerleştirin.
    4. Oda sıcaklığında 50 mL'lik bir santrifüj tüpüne 45 mL ksilen yerleştirin.
      DİkKAT: Xylene bir duman başlık kullanılmalıdır.
  2. Bir PEN membran slaytını eldivenli bir ele dayayarak kısa bir süre eritin, sonra 45 mL'de %80 etanol (#1 ve #2) ile 30'şar s'yi iki kez yıkayın ve 50 mL santrifüj tüplerinde ajitasyon ile OKT'yi çıkarın.
    NOT: Boyama dan önce OCT kaldırmak için önemlidir, ekim bölümleri gizleme boyama sırasında gevşetilmiş önlemek için. Forceps ajitasyon tarafından yıkanmış değil OCT kaldırılmasını kolaylaştırmak için kullanılabilir.
  3. Alüminyum folyo bir levha üzerine slayt lay. Pipet 0.8 mL% 50 etanol üzerine slayt üzerine% 50 krem menekşe ve leke 30 s. 30 s için% 80 etanol (#3) 45 mL slayt yıkayın ve daha sonra 30 s için geçit ile 30 s ile 45 mL ile% 95 etanol, 100% etanol ve ksilen 50 mL slürfugege.
  4. Ksilen ve kuru bölümleri boşaltmak için 5 dakika boyunca hassas bir görev silecek üzerinde slaytlar standı.
    NOT: Slaytlar LCM önce tamamen kurutulmalıdır.

4. Lazer Yakalama Mikrodisseksi

NOT: LCM yaparken pudrasız nitril eldiven takın.

  1. LCM mikroskobunu, lazeri ve bilgisayarı açın. Bilgisayarda oturum açın ve yazılımı başlatın. Lazeri başlatmak için anahtarı "Açık" konumuna çevirin. Yeşil ışık (Lazer) açıkken, lazeri etkinleştirmek için kırmızı düğmeye basın ve ardından ışık (Lazer) lazerkullanmaya hazır olduğunu belirten kırmızıya döner.
    NOT: Lazer ısınmak için yaklaşık 10 dakika gerekir.
  2. Toplama tüplerini ayarlayın.
    1. 0,5 mL polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) borunun kapağını kolektöre takın.
      NOT: İstenilen PCR tüpleri (0,2 veya 0,5 mL) için eşleşen toplayıcıyı seçin.
    2. Pipet 50 μL çıkarma tamponu (Malzeme Tablosundalistelenen RNA izolasyon kiti tarafından sağlanan) 0,5 mL toplama tüpünün kapağına.
    3. Toplama cihazını mikroskoba yerleştirin.
    4. Toplayıcı Aygıtı değiştir penceresinde, toplayıcıyı başvuru noktasına (RP) taşımak için Başvuru Noktasına Taşı düğmesini tıklatın. RP'yi net bir şekilde görüntülemek için odağı ayarlayın. RP'yi görünümün ortasına taşımak için okları tıklatın.
  3. Numune slaytlarını yükleyin.
    1. Slayt tutucusunu düşürmek için araç çubuğundaki sol Boşalt düğmesini tıklatın.
    2. Doku bölümü aşağıya bakacak şekilde kaydırağı tutucuya yerleştirin.
      NOT: Bu oryantasyon, yakalanan doku bölümlerinin yerçekimi ile toplama tüpünün kapağına düşmesini sağlar.
    3. Tutucuyu tekrar sahneye yerleştirin.
  4. Lazer parametrelerini ayarlayın.
    1. Lazer menüsünün Denetim seçeneğini seçin veya Lazer simgesine tıklayın.
    2. Bu parametreleri istenilen şekilde ayarlayın: Güç,lazerin gücü; Diyafram, lazer genişliği; ve Hız, Draw ve Cut modunda kesme hızı.
      NOT: Lazeri ilgi çekici bir alanda test edin. Daha yüksek güç veya daha büyük diyafram kesmek daha kolay hale getirir ama hücrelere daha fazla zarar verir. Verimli kesim ve doku minimum hasar elde etmek için güç, diyafram ve hız kombinasyonu ayarlayın. Örneğin, Güç = 40, Diyafram = 5 ve Hız = 7 12 μm kesitüzerinde kıkırdak doku için.
  5. İlgi çekici alanları seçin ve kesin.
    1. 5x hedefi ile başlayın ve ilgi alanları bulmak ve sonra en iyi ilgi alanı gösterir objektif (5x, 10x veya 40x) geçmek.
      NOT: Cresyl menekşe boyama sonra, kıkırdaklar lekeli macenta ve mineralize dokular kahverengi veya siyah görünür, diğer dokulardan ayırt edilebilir. Görüntüler, Dosya menüsünden Görüntüyü Kaydet kullanılarak kaydedilebilir.
    2. Toplayıcıdaki işareti tıklatarak toplama için tüpü (A, B, C, D) seçin.
    3. Taşı ve Kes veya Çiz ve Kes'iseçin. Taşı ve Kes modunda, örnek elle kesilir, fare veya dokunmatik ekran lı kalem kullanılarak şekilleri serbest el çizin. Draw and Cut modunda, şekiller sonraki kesim için fare veya dokunmatik ekranlı kalemle serbest olarak çizilebilir. Lazer kesimi başlatmak için Başlat Kes düğmesini tıklatın.
    4. Kesim tamamlandıktan sonra PEN membranlı hedef doku yerçekimi ile toplama tüpünün kapağına düşer. Gerekirse birden fazla ilgi alanını bir araya getirmek için 4,5'i tekrarlayın.
      NOT: Doku eksik kesim nedeniyle toplama tüpünün kapağına düşmezse, kesiklerin tekrarlanması veya güç veya diyafram açıklığı nın artırılması gerekebilir. Mineralize kemik (kahverengi veya siyah) doğrudan lazer le kesilemez.
  6. Kolektörü boşaltın ve PCR tüpünü dikkatlice kapatın. Mikrodissected dokuları kuru buza yerleştirin. Bir sonraki adıma devam edin veya -80 °C'de saklayın.
    NOT: Protokol burada duraklatılmış olabilir. Bir sonraki örnek için 4,2 ile 4,6 arası tekrarlayın.

5. Mikrodissected Dokuların Lysis ve RNA İzolasyon

  1. Mikrodiskoplu dokuları oda sıcaklığında eritin. Santrifüj kısa bir süre ve 42 °C'de 30 dakika boyunca numuneleri kuluçkaya yatırın.
  2. Kuluçkadan sonra lysis tamponunu 0,5 mL PCR tüpe çevirin. Üreticinin talimatlarına uyarak Bir RNA izolasyon kiti (Malzeme Tablosunabakın) kullanarak DNa işlemi ve RNA ekstraksiyonu gerçekleştirin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

E16.5'teki taze dondurulmuş fare dokularının koronal bölümleri, Meckel'in kıkırdağının (MC), aküler kıkırdağının ve mandibular kemiğinLCM ile izolasyon ve toplanmasını göstermek için kullanıldı. E16.5'teki fare embriyoları parçalandı ve OCT bileşiği ile kriyojenik kalıplara gömülmüştü. Kalıptaki numuneler kuru buz ve metil-2-bütan banyosunda hızla dondurularak -80 °C'de saklandı.

Kıkırdak ve kemik terosmor mor boyama göstermek için koronal düzlemde kriyokesit yapıldı ve mikroskop slaytlar üzer...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

LCM, zenginleştirilmiş veya homojen hücre popülasyonlarının heterojen dokulardan izole edilmesini sağlar. Avantajları arasında hücrelerin in vivo bağlamında hızlı ve hassas bir şekilde yakalanması yer alırken, potansiyel dezavantajları arasında zaman alıcı, pahalı ve kullanıcının belirli bir örnek30içinde farklı alt popülasyonları tanıma ihtiyacı yla sınırlı olması yer almaktadır. Bu protokol fare embriyonik kıkırdak ve kemik LCM ayrıntılarını sağlar, rna-seq tarafından sonraki analiz içi...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma Ulusal Diş ve Kraniyofasiyal Araştırma Enstitüsü (R01DE022988) ve Eunice Kennedy Shriver Ulusal Çocuk Sağlığı ve İnsanGelişimi Enstitüsü (P01HD078233) tarafından desteklenmiştir. Yazarlar Mount Sinai De Icahn Tıp Okulu'nda Leica LMD 6500 platformuna erişim için Biorepository ve Patoloji Çekirdek teşekkür ederiz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
2-MetilbütanThermoFisher ScientificO3551-4
BiyoanalizörAgilentG2939BA
Santrifüj tüpüThermoFisher Scientific339653Konik steril polipropilen santrifüj tüpleri, 50 mL
Kresil menekşe asetatSigma-AldrichC5042
KriyostatLeica BiyosistemlerCM3050 S
Hassas görev sileceğiThermoFisher Scientific06-666
Tek kullanımlık gömme kalıbıThermoFisher Scientific1220
Damıtılmış suInvitrogen10977-015DNase/RNase İçermeyen
Etanol, mutlak (200 kanıt)ThermoFisher ScientificBP2818Moleküler biyoloji sınıfı
Cam PEN membran slaytLeica Microsystems11505158
LCM sistemiLeica MicrosystemsLeica LMD6500
Mikroskop kapak camıThermoFisher Scientific12-545FP
Mikroskop slaytlarıThermoFisher Scientific12-550-15
OCT bileşikElektron Mikroskobu Bilimleri102094-106
Düz kapaklı PCR tüpü, 0,5 mLAxygenPCR-05-CLCM toplama tüpleri
Kalıcı montaj ortamıVektör LaboratuvarlarıH-5000
RNA izolasyon kitiThermoFisher ScientificKIT0204
RNase dekontaminasyon ajanıSigma-AldrichR2020yüzeyleri temizlemek için RNase dekontaminasyon ajanı
KsilenSigma-Aldrich214736

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kardon, G. Development of the musculoskeletal system: Meeting the neighbors. Development. 138 (14), 2855-2859 (2011).
  2. Nichterwitz, S., Chen, G., et al. Laser capture microscopy coupled with Smart-seq2 for precise spatial transcriptomic profiling. Nature Communications. 7, 12139(2016).
  3. Liu, A. Laser capture microdissection in the tissue biorepository. Journal of Biomolecular Techniques. 21 (3), 120-125 (2010).
  4. Datta, S., et al. Laser capture microdissection: Big data from small samples. Histology and Histopathology. 30 (11), 1255-1269 (2015).
  5. Schroeder, A., Mueller, O., et al. The RIN: An RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements. BMC Molecular Biology. 7 (3), (2006).
  6. Motch Perrine, S. M., Wu, M., et al. Mandibular dysmorphology due to abnormal embryonic osteogenesis in FGFR2-related craniosynostosis mice. Disease Models & Mechanisms. 12 (5), (2019).
  7. Holmes, G., O'Rourke, C., et al. Midface and upper airway dysgenesis in FGFR2-craniosynostosis involves multiple tissue-specific and cell cycle effects. Development. 145 (19), (2018).
  8. Ewels, P., Magnusson, M., Lundin, S., Käller, M. MultiQC: Summarize analysis results for multiple tools and samples in a single report. Bioinformatics. 32 (19), 3047-3048 (2016).
  9. Tromp, G., Kuivaniemi, H., et al. Structure of a full-length cDNA clone for the preproα1(I) chain of human type I procollagen. Biochemical Journal. 253 (3), 919-922 (1988).
  10. De Wet, W., Bernard, M., et al. Organization of the human pro-alpha 2(I) collagen gene. Journal of Biological Chemistry. 262 (33), 16032-16036 (1987).
  11. Bonewald, L. F. The amazing osteocyte. Journal of Bone and Mineral Research. 26 (2), 229-238 (2011).
  12. Toyosawa, S., Shintani, S., et al. Dentin matrix protein 1 is predominantly expressed in chicken and rat osteocytes but not in osteoblasts. Journal of Bone and Mineral Research. 16 (11), 2017-2026 (2001).
  13. Guo, D., et al. Identification of osteocyte-selective proteins. Proteomics. 10 (20), 3688-3698 (2010).
  14. Ducy, P., Zhang, R., Geoffroy, V., Ridall, A. L., Karsenty, G. Osf2/Cbfa1: A transcriptional activator of osteoblast differentiation. Cell. 89 (5), 747-754 (1997).
  15. Nakashima, K., Zhou, X., et al. The novel zinc finger-containing transcription factor osterix is required for osteoblast differentiation and bone formation. Cell. 108 (1), 17-29 (2002).
  16. Termine, J. D., et al. Osteonectin, a bone-specific protein linking mineral to collagen. Cell. 26 (1), 99-105 (1981).
  17. Baldwin, C. T., Reginato, A. M., Prockop, D. J. A new epidermal growth factor-like domain in the human core protein for the large cartilage-specific proteoglycan. Evidence for alternative splicing of the domain. Journal of Biological Chemistry. 264 (27), 15747-15750 (1989).
  18. Strom, C. M., Upholt, W. B. Isolation and characterization of genomic clones corresponding to the human type II procollagengene. Nucleic Acids Research. 12 (2), 1025-1038 (1984).
  19. Ninomiya, Y., Olsen, B. R. Synthesis and characterization of cDNA encoding a cartilage-specific short collagen. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 81 (10), 3014-3018 (1984).
  20. Muragaki, Y., Mariman, E. C. M., et al. A mutation in the gene encoding the alpha 2 chain of the fibril-associated collagen IX, COL9A2, causes multiple epiphyseal dysplasia (EDM2). Nature Genetics. 12 (1), 103-105 (1996).
  21. Brewton, R. G., Wood, B. M., et al. Molecular cloning of the alpha 3 chain of human type IX collagen: linkage of the gene COL9A3 to chromosome 20q13.3. Genomics. 30 (2), 329-336 (1995).
  22. Newton, G., Weremowicz, S., et al. Characterization of human and mouse cartilage oligomeric matrix protein. Genomics. 24 (3), 435-439 (1994).
  23. Hiraki, Y., Mitsui, K., et al. Molecular cloning of human chondromodulin-I, a cartilage-derived growth modulating factor, and its expression in Chinese hamster ovary cells. European Journal of Biochemistry. 260 (3), 869-878 (1999).
  24. Smits, P., Li, P., et al. The transcription factors L-Sox5 and Sox6 are essential for cartilage formation. Developmental Cell. 1 (2), 277-290 (2001).
  25. Hayman, A. R., Jones, S. J., et al. Mice lacking tartrate-resistant acid phosphatase (Acp 5) have disrupted endochondral ossification and mild osteopetrosis. Development. 122 (10), 3151-3162 (1996).
  26. Dai, X. -M., Ryan, G. R., et al. Targeted disruption of the mouse colony-stimulating factor 1 receptor gene results in osteopetrosis, mononuclear phagocyte deficiency, increased primitive progenitor cell frequencies, and reproductive defects. Blood. 99 (1), 111-120 (2002).
  27. Gowen, M., Lazner, F., et al. Cathepsin K knockout mice develop osteopetrosis due to a deficit in matrix degradation but not demineralization. Journal of Bone and Mineral Research. 14 (10), 1654-1663 (1999).
  28. Faccio, R., Takeshita, S., Zallone, A., Ross, F. P., Teitelbaum, S. L. c-Fms and the αvβ3 integrin collaborate during osteoclast differentiation. Journal of Clinical Investigation. 111 (5), 749-758 (2003).
  29. Kim, N., Takami, M., Rho, J., Josien, R., Choi, Y. A novel member of the leukocyte receptor complex regulates osteoclast differentiation. The Journal of Experimental Medicine. 195 (2), 201-209 (2002).
  30. Mahalingam, M. Laser Capture Microdissection: Insights into Methods and Applications. Methods in Molecular Biology. 11723, 1-17 (2018).
  31. Goldsworthy, S. M., Stockton, P. S., Trempus, C. S., Foley, J. F., Maronpot, R. R. Effects of fixation on RNA extraction and amplification from laser capture microdissected tissue. Molecular Carcinogenesis. 25 (2), 86-91 (1999).
  32. Clément-Ziza, M., Munnich, A., Lyonnet, S., Jaubert, F., Besmond, C. Stabilization of RNA during laser capture microdissection by performing experiments under argon atmosphere or using ethanol as a solvent in staining solutions. RNA. 14 (12), 2698-2704 (2008).
  33. Farris, S., Wang, Y., Ward, J. M., Dudek, S. M. Optimized method for robust transcriptome profiling of minute tissues using laser capture microdissection and low-input RNA-seq. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 185(2017).
  34. Espina, V., Heiby, M., Pierobon, M., Liotta, L. A. Laser capture microdissection technology. Expert Review of Molecular Diagnostics. 7 (5), 647-657 (2007).
  35. Martuscello, R. T., Louis, E. D., Faust, P. L. A stainless protocol for high quality RNA isolation from laser capture microdissected Purkinje cells in the human post-mortem cerebellum. Journal of Visualized Experiments. (143), (2019).
  36. Bevilacqua, C., Makhzami, S., Helbling, J. C., Defrenaix, P., Martin, P. Maintaining RNA integrity in a homogeneous population of mammary epithelial cells isolated by Laser Capture Microdissection. BMC Cell Biology. 11 (95), (2010).
  37. Takahashi, N., Tarumi, W., Hamada, N., Ishizuka, B., Itoh, M. T. Cresyl violet stains mast cells selectively: Its application to counterstaining in immunohistochemistry. Zoological Science. 34 (2), 147-150 (2017).
  38. Sheldon, A. R., Almli, L., Ferriero, D. M. Copper/zinc superoxide dismutase transgenic brain in neonatal hypoxia-ischemia. Methods in Enzymology. 353, 389-397 (2002).
  39. Kolijn, K., Van Leenders, G. J. L. H. Comparison of RNA extraction kits and histological stains for laser capture microdissected prostate tissue. BMC Research Notes. 9, 17(2016).
  40. Cummings, M., et al. A robust RNA integrity-preserving staining protocol for laser capture microdissection of endometrial cancer tissue. Analytical Biochemistry. 416 (1), 123-125 (2011).
  41. Filliers, M., et al. Laser capture microdissection for gene expression analysis of inner cell mass and trophectoderm from blastocysts. Analytical Biochemistry. 408 (1), 169-171 (2011).
  42. Vandewoestyne, M., et al. Laser capture microdissection: Should an ultraviolet or infrared laser be used? Analytical Biochemistry. 439 (2), 88-98 (2013).
  43. Ayturk, U. RNA-seq in skeletal biology. Current Osteoporosis Reports. 17 (4), 178-185 (2019).
  44. Van Den Brink, S. C., et al. Single-cell sequencing reveals dissociation-induced gene expression in tissue subpopulations. Nature Methods. 14 (10), 935-936 (2017).
  45. Adam, M., Potter, A. S., Potter, S. S. Psychrophilic proteases dramatically reduce single-cell RNA-seq artifacts: A molecular atlas of kidney development. Development. 144 (19), 3625-3632 (2017).
  46. Chen, J., et al. Spatial transcriptomic analysis of cryosectioned tissue samples with Geo-seq. Nature Protocols. 12 (3), 566-580 (2017).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Kemik Dokusu zolasyonuKresil Viyole BoyamaRNA B t nl n n KorunmasKriyoseksiyon Tekni iDoku Dehidratasyon ProtokolMeckel K k rdaMandibuler Kemik

İlgili makaleler