Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

İplik Spesifik RT-PCR ile Hastalarda İnsan İmmün Yetmezlik Virüs Tip 1 (HIV-1) Antisense Protein (ASP) RNA Transkriptlerinin Saptanması

6.9K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/60511

⸱

27 Kasım 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Immunology and Allergy, Lausanne University Hospital, 2Department of Fundamental Neuroscience, University of Lausanne, 3Department of Biochemistry, Erasmus Medical Center, 4Theoretical Biology and Biophysics Group, Los Alamos National Laboratories, 5Department of Biochemistry, University of Lausanne

Bu makalede

Özet

RNA saç tokaları ve döngüler, sekansa özgü astarların yokluğunda ters transkripsiyon (RT) için astar işlevi görebilir ve üst üste gelen antisense transkriptlerin incelenmesine müdahale eder. İplik spesifik RNA'yı tanımlayabilen bir teknik geliştirdik ve bunu HIV-1 antisense protein ASP'yi incelemek için kullandık.

Özet

Retrovirüslerde antisense transkripsiyon hem insan immün yetmezlik virüsü tip 1 (HIV-1) hem de insan T-lenfotropik virüs 1 (HTLV-1) olarak tanımlanmıştır. HIV-1'de antisense protein ASP geni env'nin negatif iplikçiküzerinde, -2 okuma çerçevesinde gp120/gp41 kavşaklarını kapsayan bir proteinde bulunur. Asp açık okuma çerçevesinin 3' ucu gp120 hiperdeğişken bölgeler V4 ve V5 ile örtüşmektedir. ASP RNA çalışması RT-self-priming olarak bilinen bir fenomen tarafından engellenmiştir, rna ikincil yapılar belirli astar yokluğunda RT asal yeteneğine sahip, spesifik olmayan CD'ler üreten. RT reaksiyonunda biyotinylated ters astarlar ile yüksek RNA denatürasyonu kombine kullanımı, streptavidin kaplı manyetik boncuküzerine cDNA afinite ile birlikte, bize seçici OLARAK CD4 ASP RNA yükseltmek için izin verdi + T hücreleri HIV-1 ile enfekte bireylerden türetilen. Yöntemimiz nispeten düşük maliyetli, gerçekleştirmek için basit, son derece güvenilir ve kolayca tekrarlanabilir. Bu bağlamda, sadece HIV-1'de değil, diğer biyolojik sistemlerde de antisense transkripsiyon çalışması için güçlü bir araçtır.

Giriş

Antisense protein (ASP) geni, insan immün yetmezlik virüsü tip 1 (HIV-1) zarf (env) geninin negatif iplikçik üzerinde bulunan açık okuma çerçevesi (ORF) olup, gp120/gp411kavşağına yayılan bir gendir. Son 30 yıl içinde, çeşitli raporlar HIV ASP geni gerçekten transkripsiyonu ve tercüme olduğunu göstermiştir2,3,4,5,6,7,8,9. ASP antisense transkriptler tamamen in vitrokarakterize olmasına rağmen , yakın zamana kadar hastalarda ASP RNA gerçek üretimi hakkında bilgi hala eksikti.

ASP dizisi ters ve env tamamlayıcıdır. Bu, ASP transkriptlerini algılamaya çalışırken büyük bir engel teşkil eder. Standart ters transkripsiyon-polimeraz zincir reaksiyonu (RT-PCR) yöntemleri, doğru polaritenin tamamlayıcı NA'larını (cDNA'ları) sentezlemek için genlere özgü antisense astarlar kullanır. Ancak bu yaklaşım, rna saç tokaları veya döngüleri10astar yokluğunda her iki yönde de RT asal olabilir, rt kendini astar olarak bilinen bir fenomen, ilk RNA şablonunun yönünü (anlamda veya antisense) belirlemek için izin vermez. Çoğu ASP araştırmacıları HIV-111,12ile ilgili olmayan dizileri ile etiketlenmiş astarlar kullanarak RT kendini astar sorunu kenara . Ancak bu strateji, fenomenin oluşumunu ortadan kaldırmaz ve PCR11'espesifik olmayan CDNA'ların potansiyel olarak taşınmasına yol açabilir.

Yakın zamanda antisense RNA çalışması için yeni bir iplikçik özgü RT-PCR tayini geliştirdik ve Tablo 1'degösterildiği gibi, altı HIV enfekte hastanın bir kohort ASP RNA tespiti için kullandık. Aşağıda açıklanan prosedür daha önce Antonio Mancarella ve ark.13tarafından yayınlanmıştır. Protokolümüzde, spesifik olmayan CNA'ların çift yaklaşımla üretiminden kaçınıyoruz. İlk olarak, RNA'yı yüksek sıcaklıkta (94 °C) reddederek RNA ikincil yapılarını ortadan kaldırıyoruz ve ikinci olarak, biyotinylated ASP'ye özgü astar kullanarak ASP RNA'yı tersine çeviriyoruz ve elde edilen cDNA'yı arındırıyoruz. Bu yaklaşımla, spesifik olmayan diğer RT ürünlerinin üretilmesi (RNA'nın yüksek sıcaklık denatürasyonu) engellenmesi veya PCR (afinite arınma) öncesinde ortadan kaldırılması önlendiği için, sadece hedef cDNA'mızı yükseltebiliriz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Bu çalışma, Centre Hospitalier Universitaire Vaudois (CHUV) Kurumsal İnceleme Kurulu tarafından onaylanmıştır.

1. Hiv-1HXB2 suşu ile periferik kan mononükleer hücrelerinin (PBMCs) enfeksiyonu

  1. 1. Gün: PBMCS UYARITMA
    1. Sağlıklı bir donör buffy ceket PBMCs izole.
    2. Komple Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 orta% 10 fetal sığır serumu (FBS) ve% 1 penisilin / streptomisin (R-10) içeren 1x106/ mL konsantrasyonda pBMCs saymak ve resuspend, interleukin-2 50 U /mL eklenmesi ile (IL-2) ve 3 μg/mL phytohahaemagin (PHA).
    3. Hücreleri yukarı ve aşağı boruyla iki altı kuyuplakaya (3 mL hücre süspansiyonu/kuyusu) ayırın.
    4. 37 °C ve %5 CO2'de3 gün kuluçkaya yatırın.
  2. Gün 3: PBMCs ENFEKSİyon
    NOT: Pozitif 1.1.3'teki iki plakadan birini negatif kontrol olarak kullanın (bu hücrelere bulaşmayın).
    DİkKAT: Tüm prosedürü biyogüvenlik seviyesi III laboratuvarında (P3) gerçekleştirin.
    1. Havuz PBMCs bir tabak içine 50 mL şahin tüp ve santrifüj 300 x g 10 dk için.
    2. Supernatant atın ve 20 U/mL IL-2 ve 2 μg/mL polibren içeren R-10 2.2 mL hücreleri yeniden askıya.
    3. HIV-1HXB2 virüslerini içeren şişeleri eritin ve hücrelere 1.8 mL viral süspansiyon (0.376 ng/μL) ekleyin.
    4. Hücreleri 37 °C'de 2 saat kuluçkaya yatırın ve tüpü her 30 dakikada bir hafifçe döndürün.
    5. Hücreleri 300 x g'de 10 dk santrifüj edin.
    6. Supernatant atın ve IL-2 (50 U/mL) içeren R-10 1x106/mL hücreleri yeniden askıya.
    7. Hücre süspansiyonuna 1 mL/kuyu konsantrasyonu yla 24 kuyulu bir plaka aktarın ve 37 °C ve %5 CO2'de5 gün kuluçkaya yatırın.
    8. Hasat 1 iyi her gün ve 1.5 mL tüp (enfeksiyon günü ile etiketlenmiş) hücreleri aktarın.
      NOT: Santrifüjden önce, 150 μL'lik hücre süspansiyonunu PBMCs enfeksiyonu kalite kontrolü için akış sitometri tüpüne aktarın (bkz. adım 1.3)
    9. Tüpleri 400 x g'de 10 dk için santrifüj edin ve süpernatantatın.
    10. Hücre peletlerini kullanıma kadar -80 °C'de dondurun.
  3. PBMCs enfeksiyonu: kalite kontrol
    1. Enfeksiyonun her günü için, 150 μL enfekte PBMCs toplamak ve bir akış sitometri tüpü içine aktarın.
    2. 5 dk için 400 x g fosfat tamponlu salin (PBS) ve santrifüj 1 mL ekleyin.
    3. Supernatant atın ve Aqua canlı / ölü boya 1 μL içeren PBS 50 μL ekleyin (daha önce PBS ile seyreltilmiş 1:10).
    4. 4 °C'de 15 dakika kuluçkaya yatırın.
    5. 1 mL PBS, 400 x g'de 5 dk santrifüj ekleyin ve supernatant atın.
    6. 250 μL Fiksasyon/Permeabilizasyon çözeltisi ekleyin ve karanlıkta oda sıcaklığında 20 dakika kuluçkaya yatırın.
    7. 1 mL 1x Perm/Yıkama Tamponu (1:10 seyreltilmiş FBS ve saponin içeren 10x stok çözeltisi) ve 5 dk için 400 x g santrifüj ekleyin.
    8. Supernatant atın ve HIV Gag p24 floresan isotiyoyanat içeren PBS 50 μL ekleyin (FITC)-konjuge antikor (seyreltilmiş 1:10).
    9. Karanlıkta oda sıcaklığında 20 dakika kuluçka.
    10. 1 mL PBS, 400 x g'de 5 dk santrifüj ekleyin ve supernatant'ı atın.
    11. 150 μL x CellFIX (%10 formaldehit içeren 10x stok çözeltisi, %3,55 metanol, %0,93 sodyum azit seyreltilmiş 1:10) ekleyin ve hücreleri akış sitometrisi ile analiz edin.

2. Anti-CD3/CD28 antikorları ile insan CD4+ T hücrelerinin uyarılması

  1. HEM HIV-1 enfekte hastaların hem de sağlıklı donörlerin PBMCs CD4 + T hücreleri izole.
  2. PBS'de anti-CD3 (1:100) ve anti-CD28 (1:50) seyrelterek insan anti-CD3/CD28 antikor karışımı hazırlayın.
  3. Uygun sayıda kuyuya kuyu başına 200 μL antikor karışımı ekleyerek 48 kuyulu bir plakayı katlayın ve 37 °C'de 2 saat boyunca kuluçkaya yatırın.
  4. Antikor çözeltisini aspire edin ve 1x106/mL'de 1 mL CD4+T hücresini anti-CD3/CD28 antikor kaplı kuyulara ekleyin.
    NOT: CD4+ T hücrelerini 5 güne kadar uyarın.

3. Ters transkripsiyon

NOT: Hastaya özgü astarelde etmek için her hastadan CD4+T hücrelerinden izole edilen proviral DNA HIV-1HXB2 Pan ASP astarları kullanılarak güçlendirilmiştir. Hastaya özgü astarlar Pan ASP astarları için internal proviral dizi kullanılarak tasarlanmıştır. Bu çalışmada kullanılan tüm astar ve problar Tablo 2'delistelenmiştir.

  1. Hücrelerden toplam RNA yalıtma
    1. Örnekleri DNase ile tedavi ederek RNA'yı ölçün ve DNA kontaminasyonunu ortadan kaldırın.
    2. 50 μL'lik bir hacimde RT reaksiyonları gerçekleştirin. Toplam RNA'nın 0,1-1 μg'sini 96 kuyulu bir PCR plakanın uygun sayıda kikuyuya aktarın. RNA'ya aşağıdaki bileşenleri ekleyerek RNA karışımını hazırlayın:
      5 μL biyotinylated ASP ters astar (20 μM)
      2.5 μL deoksinükleotid trifosfat (dNTPs) (10 mM)
      25 μL dietilpirokarbonat (DEPC) ile işlenmiş distile su (dH2O).
      Biyotinylated ASP ters astar yerine 5 μL nükleaz içermeyen su ekleyerek endojen RT kontrollerini hazırlayın.
    3. 96 iyi PCR plakayı bir termocycler'a yerleştirin ve RNA karışımını 5 dakika boyunca 94 °C'ye ısıtın.
    4. RNA karışımını buzlu suda hemen en az 1 dakika soğutun.
    5. Aşağıdaki bileşenleri 1,5 mL'lik bir tüpe ekleyerek reaksiyon karışımını hazırlayın (toplam numune sayısını artı 1 hesaplayın):
      10 μL 5x RT tampon
      2.5 μL 0.1 M ve 1,4-dithiothreitol (DTT)
      2,5 μL RNase çıkış (40 birim/μL)
      2.5 μL RT enzimi (200 birim/μL)
    6. Bu karışımın 17,5 μL'sini RNA içeren kuyuların her birine aktarın. Ters transkriptaz yerine 2,5 μL nükleaz içermeyen su içeren RT eksi kontrollerini hazırlayın.
    7. Hafifçe karıştırın ve bir termocycler kullanarak 60 dk için 55 °C'de plaka kuluçka.
    8. 70 °C'de 15 dakika ısıtarak reaksiyonları inaktive edin.

4. ASP biyotinylated cDNA affinity arıtma

NOT: RT eksi reaksiyonları arındırmayın.

  1. 1L 2x yıkama/bağlama tamponu içeren 10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 1 mM etilendirmintetraasetik asit (EDTA) ve 2 M NaCl hazırlayın. Çözümü filtreleyin.
    1. PCR sınıfı su kullanarak 50 mL 1x yıkama/bağlama tamponu hazırlayın.
    2. Her reaksiyon için 10 μL streptavidin konjuge manyetik boncuk kullanın. Reaksiyon sayısına bağlı olarak, uygun miktarda boncukları 1,5 mL'lik bir tüpe aktarın.
    3. 15 s için 2x yıkama / bağlama tampon ve girdap eşit hacim ekleyerek boncukyı yıkayın.
    4. Bir manyetik ayırma raf içine tüp yerleştirin ve oda sıcaklığında 3 dakika kuluçka.
    5. Boncukları rahatsız etmeden supernatant'ı dikkatlice çıkarın ve boncukların ilk hacmiyle aynı yıkama/bağlama 2x tamponhacmini ekleyin.
    6. 30 s için girdap ve 10 μL boncuk süspansiyon için transfer 1.5 mL tüpler imal.
    7. Tüpleri manyetik ayırma rafına yerleştirin ve oda sıcaklığında 3 dakika kuluçkaya yatırın.
    8. Supernatant atın ve yıkama / bağlayıcı 2x tampon 50 μL ekleyin.
    9. Boncukları içeren ilgili tüplere 50 μL biyotinylated cDNA ekleyin.
    10. Oda sıcaklığında 30 dakika boyunca hafifçe dönerek kuluçkaya yatırın.
    11. Oda sıcaklığında 3 dakika için bir mıknatıs ayırma rafı ile supernatant boncuk ayırın.
    12. 200 μL 1x yıkama/bağlama tamponu ekleyerek boncukları yıkayın. Tüpleri oda sıcaklığında 3 dakika boyunca mıknatıs ayırma rafına yerleştirin ve süpernatantatın. İki kez tekrarlayın.
    13. 10 μL PCR sınıfı sudaki boncukları yeniden askıya alın.

5. Standart PCR

NOT: Standart PCR'nin amacı ASP geninin tüm ORF'sini yükseltmektir. Amplifikasyon ürünleri daha sonra gerçek zamanlı PCR ile ASP RNA nicelleştirme için standart eğriler geliştirmek için pCR2.1 plazmid içine klonlanır (paragraf gerçek zamanlı PCR bakınız).

  1. Standart PCR'leri toplam 50°L hacimde gerçekleştirin. Uygun bir PCR ana karışımı hacmi (numune sayısı artı 1) hazırlayın. Her örnek için aşağıdaki bileşenleri 1,5 mL'lik bir tüpe ekleyin:
    1 μL 10 μM ASP astar (ileri ve geri)
    1 μL 10 mM dNTPs
    Magnezyum klorür (MgCl2) (konsantrasyon kullanılan astarbağlıdır)
    dH2O son hacmi 49 μL
    1. İyice karıştırın, içeriği hızla aşağı çevirin ve PCR ana karışımının 49 μL/well'ini 96 kuyulu bir PCR plakasına aktarın.
    2. ASP cDNA afinitesinin 15 s için kullanılması için kullanılan boncukları içeren tüpleri dikkatlice girdaplayın.
    3. İlgili kuyulara 1°L boncuk ekleyin ve PCR'yi 2 dk için 95 °C, 30 s için 95 °C'lik 40 devir, 30 s için 55 °C ve 40 s için 68 °C, ardından 7 dk için 68 °C çalıştırın.
    4. PCR ürünlerini % 1 agarose jel üzerine ayırın, bantları kesip amplifiye edilmiş ürünleri pCR2.1 plazmid haline getirin.
    5. Her klonun dizilerini sırala ve analiz edin.

6. Gerçek zamanlı nicel PCR (qPCR)

NOT: Adım 3 "Ters Transkripsiyon"da açıklanan yaklaşımı kullanarak hastaya özel astarlar ve problar geliştirin. QPCR için standart eğriler için ASP plazmid seyreltmeiçerir. Hastaya özgü kesici ler içeren plazmidler, 5.

  1. Standart eğriyi 3 x 106 kopya/μL'den 3 kopya/μL'ye kadar 1:10 ASP plazmid seri seyreltmelerini kullanarak hazırlayın.
    1. İlk tur PCR (ön-amp). Toplam 25 μL hacimde reaksiyonlar gerçekleştirin. Uygun bir HACIM PCR ana karışımı (örnek sayısı artı 1) hazırlayın. Her örnek için aşağıdaki bileşenleri 1,5 mL'lik bir tüpe ekleyin:
      0,5 μL ASP veya env astar karışımı (son konsantrasyon 0,2 μM her) (ileri ve geri)
      0,5 μL dNTPs karışımı (son konsantrasyon 0,2 mM her)
      MgCl2 (konsantrasyon astar çiftlerinin konsantrasyonuna bağlıdır)
      dH2O son hacmi 24 μL
    2. 24 μL PCR ana karışımını uygun sayıda 96 kuyulu PCR plakaya aktarın.
    3. Dikkatle 15 s cDNA ile boncuk içeren tüpler girdap.
    4. İlgili kuyulara 1 μL boncuk ekleyin. Plazmid seyreltmeler için aynı şeyi yapın.
    5. PCR'yi aşağıdaki algoritmayı kullanarak çalıştırın: 95 °C'de 2 dk denatürasyon; 95 °C'de 30 s, 55 °C'de 30 s, 68 °C'de 18 devir için 40 s; 7 dk için 68 °C'de uzatma.
    6. PcR sınıfı su ile ilk turda PCR reaksiyonları 1:5 seyreltin.
    7. İkinci tur qPCR. Toplam 20 μL hacimde reaksiyonlar gerçekleştirin. Uygun bir HACIM PCR ana karışımı (örnek sayısı artı 1) hazırlayın. Her örnek için aşağıdaki bileşenleri 1,5 mL'lik bir tüpe ekleyin:
      1.8 μL 10 μM astar (ileri ve geri)
      1 μL 5 μM prob
      6.2 μL dH2O
    8. 96-iyi qPCR plaka nın uygun sayıda kisi içine 19 μL qPCR ana karışımı aktarın ve ilgili kuyulara seyreltilmiş ilk yuvarlak PCR reaksiyonlarının 1 μL'sini ekleyin. Plazmid seyreltmeler için aynı şeyi yapın.
    9. QPCR'ı aşağıdaki algoritma ile çalıştırın: 95 °C'de 10 dk denatürasyon; 95 °C'de 15 s, 40 devir için 60 °C'de 1 dk.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Biyotinylated cDNA afinite ile birleştiğinde yüksek sıcaklık RNA denatürasyonu, pcr sırasında non-spesifik ASP ürünlerinin in vitro enfekte PCR ve hastalardan izole CD4 + T hücrelerinde amplifikasyon önler. RT kendini priming antisense RNA10ters transkripsiyon sırasında meydana gösterilmiştir10 ,14,15,16,17. Bu fenomeni önlemek için, heist ve ark.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Bu raporda, HIV-1 ile enfekte olan bireylerden izole cd4+ T hücrelerinde ASP RNA tespitine uygulanan iplikçik spesifik RT tayini açıklanmıştır. RT sırasında spesifik olmayan astar oluşumu, RNA transkriptlerinin doğru polarite ile saptanmasını engelleyerek sonuçların yanlış yorumlanmasına yol açtı. Önceki gruplar RT reaksiyonu sırasında astar-bağımsız cDNA sentezini önlemeye yönelik çeşitli stratejiler geliştirmişlerdir. HIV ile ilgili olmayan dizileri ile 3 'sonunda ters astar etiketleme iplikçik özgü amplifikasyon

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan ediyorlar.

Teşekkürler

Biz Patrizia Amelio, Alessandra Noto, Craig Fenwick ve Matthieu Perreau her zaman bizim çalışma ve AIDS İmmünopatogenez Laboratuvarı'nda tüm insanlar değerli teknik yardım için tartışmak için kullanılabilir olduğu için teşekkür ederiz. Biz de John ve Aaron Weddle VSB Associated Inc kim mükemmel sanat ile katkıda teşekkür etmek istiyorum. Son olarak, tüm hastalara çok özel teşekkürler, onsuz bu çalışma mümkün olmazdı. Bu çalışma herhangi bir finansman ajansı ndan özel bir hibe almadı.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
BD LSR IIBecton Dickinson
BigDye Terminator v1.1 Döngü Sıralama KitiUygulamalı Biyosistem, Thermo Fisher Scientific4337450
dNTP Seti (100 mM)Canlandırıcı, Thermo Fisher Scientific10297018
Dynabeads M-280 Streptavidinİnvitrojen, Thermo Fisher Scientific11205D
EasySep İnsan CD4 + T Hücresi İzolasyon KitiKök Hücre Teknolojileri19052
Fetal Sığır SerumuBiowestS1010-500
Fiksasyon/Geçirgenleştirme Çözüm KitiBecton Dickinson554714
HIV Gag p24 akış sitometrisi antikoru - Kc57-FITCBeckman Coulter6604665
İnsan IL-2Miltenyi Biotec130-097-743
Phaseolus vulgaris'ten lektin (PHA)Sigma-Aldrich61764-1MG
CANLI / ÖLÜ Sabitlenebilir Sarı Ölü Hücre Leke Kiti, 405 nm uyarmaInvitrogen, Thermo Fisher ScientificL34967
Fare Anti-İnsan CD28Becton Dickinson55725
Fare Anti-İnsan CD3Becton Dickinson55329
Primerler ve ProblarEntegre DNA Teknolojiler (IDT)
Penisilin-StreptomisinBioConcept4-01F00-H
Platin Taq DNA Polimeraz Yüksek Sadakatİnvitrojen, Thermo Fisher Scientific11304011
Polibren Enfeksiyonu / Transfeksiyon ReaktifiSigma-AldrichTR-1003-G
RNeasy Mini KitQiagen74104
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 OrtaGibco, Thermo Fisher Scientific11875093
StepOnePlus Gerçek Zamanlı PCR SistemiUygulamalı Biyosistem, Thermo Fisher Scientific4376600
SuperScript III Ters Transkriptazİnvitrojen, Thermo Fisher Scientific18080044
TaqMan Gen Ekspresyonu Master MixUygulamalı Biyosistem, Thermo Fisher Scientific
Alt Klonlama için TOPO TA Klonlama Kiti, One Shot TOP10 kimyasal olarak yetkin E. coli hücreleriInvitrogen, Thermo Fisher ScientificK450001
TURBO DNaz (2 U/&mikro; L)Invitrogen, Thermo Fisher ScientificAM2238
Veriti Termal DöngüleyiciUygulamalı Biyosistem, Thermo Fisher Scientific4375786
4369016

Kaynaklar

  1. Miller, R. H. Human immunodeficiency virus may encode a novel protein on the genomic DNA plus strand. Science. 239 (4846), 1420-1422 (1988).
  2. Vanheebrossollet, C., et al. A Natural Antisense Rna Derived from the Hiv-1 Env Gene Encodes a Protein Which Is Recognized by Circulating Antibodies of Hiv+ Individuals. Virology. 206 (1), 196-202 (1995).
  3. Briquet, S., Vaquero, C. Immunolocalization studies of an antisense protein in HIV-1-infected cells and viral particles. Virology. 292 (2), 177-184 (2002).
  4. Clerc, I., et al. Polarized expression of the membrane ASP protein derived from HIV-1 antisense transcription in T cells. Retrovirology. 8, 74(2011).
  5. Landry, S., et al. Detection, characterization and regulation of antisense transcripts in HIV-1. Retrovirology. 4, 71(2007).
  6. Kobayashi-Ishihara, M., et al. HIV-1-encoded antisense RNA suppresses viral replication for a prolonged period. Retrovirology. 9, 38(2012).
  7. Barbagallo, M. S., Birch, K. E., Deacon, N. J., Mosse, J. A. Potential control of human immunodeficiency virus type 1 asp expression by alternative splicing in the upstream untranslated region. DNA Cell Biol. 31 (7), 1303-1313 (2012).
  8. Laverdure, S., et al. HIV-1 Antisense Transcription Is Preferentially Activated in Primary Monocyte-Derived Cells. Journal of Virology. 86 (24), 13785-13789 (2012).
  9. Zapata, J. C., et al. The Human Immunodeficiency Virus 1 ASP RNA promotes viral latency by recruiting the Polycomb Repressor Complex 2 and promoting nucleosome assembly. Virology. 506, 34-44 (2017).
  10. Haist, K., Ziegler, C., Botten, J. Strand-Specific Quantitative Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction Assay for Measurement of Arenavirus Genomic and Antigenomic RNAs. PLoS One. 10 (5), 0120043(2015).
  11. Lerat, H., et al. Specific detection of hepatitis C virus minus strand RNA in hematopoietic cells. The Journal of Clinical Investigation. 97 (3), 845-851 (1996).
  12. Tuiskunen, A., et al. Self-priming of reverse transcriptase impairs strand-specific detection of dengue virus RNA. J Gen Virol. 91, Pt 4 1019-1027 (2010).
  13. Mancarella, A., et al. Detection of antisense protein (ASP) RNA transcripts in individuals infected with human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1). Journal of General Virology. , (2019).
  14. Peyrefitte, C. N., Pastorino, B., Bessaud, M., Tolou, H. J., Couissinier-Paris, P. Evidence for in vitro falsely-primed cDNAs that prevent specific detection of virus negative strand RNAs in dengue-infected cells: improvement by tagged RT-PCR. J Virol Methods. 113 (1), 19-28 (2003).
  15. Boncristiani, H. F., Di Prisco, G., Pettis, J. S., Hamilton, M., Chen, Y. P. Molecular approaches to the analysis of deformed wing virus replication and pathogenesis in the honey bee, Apis mellifera. Virol J. 6, 221(2009).
  16. Boncristiani, H. F., Rossi, R. D., Criado, M. F., Furtado, F. M., Arruda, E. Magnetic purification of biotinylated cDNA removes false priming and ensures strand-specificity of RT-PCR for enteroviral RNAs. J Virol Methods. 161 (1), 147-153 (2009).
  17. Craggs, J. K., Ball, J. K., Thomson, B. J., Irving, W. L., Grabowska, A. M. Development of a strand-specific RT-PCR based assay to detect the replicative form of hepatitis C virus RNA. J Virol Methods. 94 (1-2), 111-120 (2001).
  18. Barbeau, B., Mesnard, J. M. Making sense out of antisense transcription in human T-cell lymphotropic viruses (HTLVs). Viruses. 3 (5), 456-468 (2011).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Biyotinillenmi PrimerlerRNA Denat rasyonuStreptavidin Manyetik BoncuklarASP RNA TespitiCD4 T H creleriSpesifik Olmayan cDNA nlemeqPCR AnaliziJel Elektroforezi
İplik Spesifik RT-PCR ile Hastalarda İnsan İmmün Yetmezlik Virüs Tip 1 (HIV-1) Antisense Protein (ASP) RNA Transkriptlerinin Saptanması
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.