Yöntem makalesi

Drosophila Wing Disc'ten Görüntüleme Dpp Salınımı

DOI:

10.3791/60528

⸱

30 Ekim 2019

 , 
1Department of Pediatrics, University of Colorado School of Medicine

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ligandlara maruz kalmanın zamanlaması gelişimsel sonuçlarını etkileyebilir. Burada kanat diskhücrelerinden Dpp adı verilen Drosophila kemik morfogenetik proteininin (BMP) nasıl görüntülenebildiğini gösteriyoruz.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Transforming Büyüme Faktörü-beta (TGF-β) süper ailesi, çok hücreli organizmalarda erişkin yapıların erken embriyonik desenleşeme ve gelişimi için gereklidir. TGF-β süper familyası TGF-β, kemik morfogenetik protein (KBP), Aktivinler, Büyüme ve Farklılaşma Faktörleri ve Nodalları içerir. Uzun hücrelere maruz ligand miktarı etkileri için önemli olduğu bilinmektedir. Uzun menzilli konsantrasyon degradelerinin embriyonik desen kurduğu düşünülüyordu. Ancak, son zamanlarda bu ligands maruz kalma zamanlaması da onların downstream transkripsiyonel sonuçları için önemli olduğu ortaya çıkmıştır. TGF-β süper familya ligi, üretildiği hücreden serbest bırakılmadan gelişimsel bir sonucu olamaz. Yakın zamana kadar, bu ligandların hücrelerden ne zaman salınıldığını belirlemek zordu. Burada kanat primordium veya kanat diskhücrelerinden Decapentaplegic (Dpp) adlı bir Drosophila BMP salınımını ölçmek için nasıl göstereceğim. Bu yöntem diğer sistemler veya sinyal ligands için değiştirilebilir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kemik Morfogenetik Proteinler (KPS) erken embriyogenez ve yetişkin yapıların desenleme için gereklidir. KİP'ler, yanıt veren hücrelerde büyüme ve hücre farklılaşması için gerekli hedef genlerin transkripsiyonunu etkileyecek şekilde üretilir ve salgılanır. Decapentaplegic (Dpp) kanat1gibi embriyonik ve yetişkin yapıların gelişimi için önemli olan BMP4 bir Drosophila homolog,2,3,4. Çeşitli gruplar yetişkin sinek kanatları desenleme Dpp rolü üzerinde duruldu çünkü 1) kanatları kolayca değerlendirilebilir tutarlı bir venasyon desenli iki şeffaf epitel levhaoluşur; 2) kanat diskleri de makul düz, larva dışında kültürlü olabilir ve görüntü ve desen farklılıkları ölçmek için basit; ve 3) kanat desen gelişimi dpp duyarlı dır ki yoldaki küçük tedirginlikler kanat venasyon deseni etkileyecektir.

Dpp kanat diski5,6,7,8ön /posterior sınırında bulunan hücrelerde üretilir. Dpp tip 1 ve tip 2 serine/ threonine kigaz reseptörleri9,10bir komplekse bağlanır. Dpp bağlanması üzerine tip 2 reseptörü, anneleri Dpp (Mad) ile fosforilasyona yol açan tip 1 reseptörü fosforilasyona, bir Smad 1/5/8 homolog. Fosforlu SMAD ek bir co-Smad acemi (Medea), hangi hedef genleri düzenleyen çekirdek girmek sağlar, bu tür çoğalma veya farklılaşma gibi downstream etkilerine yol açan4,11.

Son zamanlarda, Bates Lab kanat diskiçinde Dpp yanlış salınımı Mad fosforilasyon bir azalmaya yol açabilir göstermiştir, hedef gen ekspresyonu azalma, ve kanat desenleme kusurları12,13. Drosophila kanadıve ilişkili yapıların çeşitli iyon kanalları etkisi gelişimi14,15. Bu iyon kanalları da Dpp sürümü dahil olabilir. Morfojen salınım mekanizmasını belirlerken, serbest bırakma olaylarını görselleştirmek için bir yöntem olması önemlidir.

Dr Aurelio Teleman ve Stephen Cohen Dpp kaybı kurtarmak mümkün bir Dpp-GFP füzyon proteini oluşturdu, biyolojik olarak aktif olduğu anlamına gelir ve biyolojik olarak ilgili bir şekilde serbest bırakılır16. Burada, bu Dpp-GFP'yi kullanarak Dpp sürüm olaylarını nasıl görselleştirdiğimizi anlatıyoruz. GFP asidik veziküllerde olduğunda floresan17söndürülür gibi pH duyarlı olduğu için bu füzyon proteini özellikle yararlıdır. Bu nedenle, GFP ile etiketlenmiş bir protein daha nötr hücre dışı ortama bir vezikül serbest bırakıldığında, GFP floresans yoğunluğu artar17. Dpp-GFP'nin asidik veziküllerde olup olmadığını belirlemek için GFP'nin pH duyarlılığından yararlandık. Hücre içi kompartmanları nötralize eden amonyum klorür ilavesinden önce ve sonra Dpp-GFP ifade eden kanat disklerini görüntüledik18. Amonyum klorür ilavesinden sonra puncta floresansında önemli bir artış bulduk, bu da hücre içi Dpp-GFP'nin amonyum klorür18ilavesinden önce söndürüldünden kaynaklandı. Hücre içi Dpp-GFP'nin veziküller gibi asidik membrana bağlı bölmelerde bulunduğu ve hücre içi bölmelerin pH'ını nötralize etmek için amonyum klorür eklenmesi yle söndeğinin olmadığı sonucuna vardık18. Bu dpp-GFP canlı görüntüleme yararlı bir teknik olarak asidik bölmelerden hücre dışı ortama serbest bırakılır gibi Drosophila kanat diskinde Dpp dinamikleri görselleştirmek için yapar.

Burada, Dpp-GFP kullanarak Dpp sürüm olaylarını görselleştirmek için kullandığımız yöntemi açıklıyoruz. Dpp-GFP UAS-GAL4 sistemi19kullanılarak Drosophila kanat diskleri kendi yerli desen ifade edilebilir. Bu, Irk kanallarının Dpp salınımını18'eetkilediğini belirlemek için kullanılan yöntemdir. Bu yöntemi canlı görüntüleme z-yığınları ile doğruladık. Bir odak düzleminde elde ettiğimizde Dpp-GFP puncta'nın zaman serisinde odak düzleminde hareket diğini görmüyoruz. Biz de bir z-yığın görüntülenmiş eğer Dpp-GFP puncta hareketi görmüyorum. Bu yöntemle görülen Dpp-GFP puncta'sının hücre içi veziküllerin hareketi yerine serbest bırakma olayları olduğu sonucuna varıyoruz. Dpp-GFP canlı görüntüleme Bu yöntem potansiyel Dpp dinamikleri üzerindeki etkileri için Dpp sürümü diğer putatif değiştiriciler test etmek için kullanılabilir veya diğer ligands dinamikleri bakmak için değiştirilebilir

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Diseksiyon için Larva Oluşturmak için Yumurta Toplama

  1. Çapraz 30-40 bakire dişi Dpp-GAL4/TM6 Tb Hu 10-15 erkek Sp/CyO-GFP uçar; UAS-Dpp-GFP/TM6 Tb Hu.
    NOT: Dpp-GAL4 ve UAS-Dpp-GFP içeren iki genotip, dengeleyicilerde larva evresinde uygun singenin seçilmesine olanak tanıyan larva belirteçleri olduğu sürece kullanılabilir.
  2. Yumurta toplamak için, çapraz sinekleri taze bir yiyecek şişesine çevirin ve şişeden çıkarmadan önce 3-4 saat yumurtlamalarına izin verin. Yumurta yumurtlama teşvik etmek için, su küçük bir miktar ile karışık tozmaya yapılmış maya ezmesi küçük bir miktar sinekler şişe tanıtıldı önce gıda üstüne eklenebilir. Çapraz sinekler aynı seti saklanabilir ve yumurta koleksiyonları 7 güne kadar kullanılabilir.
    NOT: Herhangi bir standart Drosophila mısır unu gıda tarifi kabul edilebilir olmalıdır. Burada kullanılan hazegh ve Reis20tarafından açıklanan gıda tarifi .
  3. Larvalar üçüncü instar (gezinme) aşamasında olana kadar yumurta toplama şişelerini yaklaşık 144 saat boyunca 25 °C'de tutun.
  4. Diseksiyon için uygun larvaları seçmek için (hem Dpp-GAL4 hem de UAS-Dpp-GFP'yi ifade edenler) önce Tb olmayan larvaları seçerler. Bu larvalar kısa ve yağlı değil, normal uzunlukta olacaktır.
  5. Tüberküloz olmayan larvalar arasında CyO-GFP ve Dpp-GFP ifade eden larvalar olacaktır. Larvaları ifade eden Dpp-GFP'yi seçmek için, bunları floresan stereomikroskop altında görüntüleyin. Hem Dpp-GFP hem de CyO-GFP ifade eden larvalar bazı GFP floresan olacak iken, GFP kanat diskleri ile sınırlı ve floresan çok daha az parlak olan gfp ifade larvaları ayırt edici dpp-GFP. Diseksiyon için bu daha az parlak larvaları seçin.

2. Larva Görüntüleme ve Diseksiyon için Çözüm Hazırlama

  1. Kanat disklerinin canlı görüntülenmesi için modifiye HL3 media21 (70 mM NaCl, 5 mM KCl, 1.5 mM CaCl2 dyhidrat, 4 mM MgCl2, 10 mM NaHCO3, 5 mM trehalose dishidrat, 115 mM sakaroz, 5 mM HEPES) hazırlayın. Bu ortam kanat diskinin görüntüleme21için canlı tutulmasını sağlar.
  2. HEPES kullanarak pH'ı 7.1'e ayarlayın ve 0,22 μm filtre ile filtre uygulayın. Bu ortamı hem kanat diski diseksiyonları hem de canlı görüntüleme için montaj ortamı olarak kullanın.

3. Kanat Diski Montajı için Slayt Hazırlama

  1. İki adet renksiz çift taraflı teyp genişlikte bir mikroskop slaytı üzerinde yerleştirin ve aralarında yaklaşık 5 mm'lik bir boşluk bırakarak. Bant parçaları, teybin uçlarının mikroskop kaydırağının kenarlarıyla dolup taşacak kadar uzun olmalıdır.
  2. Hiçbir ortamın altından sızaması için bandı slayta sıkıca bastırmak için düz bir kenar (bir çift kesme çikisinin sapucu gibi) kullanın.
  3. İki bant parçası arasına 25 μL'lik değiştirilmiş HL3 ortamı yerleştirin. Kanat diski, bantın kapağın diski ezmesini önleyecek şekilde bant parçaları arasında bu ortam damlasına monte edilecektir(Şekil 1A).

4. Görüntüleme için Kanat Disklerinin Diseksiyonu ve Montajı

  1. Hazırlanan modifiye HL3 medya26larvaları diseksiyon .
  2. İki çift forceps kullanarak larvaları yavaşça ikiye ayırın ve larvanın arka yarısını atın.
  3. Larvanın ön yarısının ortasını bir çift forceps ile tutun ve larva tamamen ters dönene kadar ağız kancalarını larvaya geri itmek için başka bir çift kapalı çile kullanın.
  4. Kanat diskleri en kolay larvaher iki tarafında aşağı çalıştırmak trakea iki koyu renkli birincil dalları keskin virajlar arayarak bulunabilir. Kanat diskleri ters bir larva da trakea bu virajlar altında doğrudan yatıyor.
  5. Kanat disklerini yavaşça çıkarın ve hazırlanan mikroskop kaydırağında 25 μL HL3 ortama aktarın. Disklerin yüzdürülmesi nedeniyle, incelenmiş kanat disklerine hiçbir trakea parçasının bağlı kalmadığından emin olmak önemlidir, bu da görüntülemeyi zorlaştırabilir.
  6. Kanat diskini, kanat kesesinin peripodial tarafının mikroskop kaydıraktan yukarı bakacak şekilde yerleştirin (bkz. Şekil 1A,B).
  7. Kanat diskini ve bandı bir kapak fişi ile kapatın ve oje kullanarak kapak fişini kapatın. Cila kurudıktan sonra, hemen aşağıdaki görüntüleme adımlarına geçin.

5. Görüntüleme Dpp Salınımı

  1. 40x yağ amacı ve 488 nm lazer ile konfokal lazer tarama mikroskobu kullanarak monte kanat diski görüntüleyin. Dpp-GFP hücrelerin bu merkezi şerit serbest bırakılan Dpp-GFP küçük puncta ile kanat diskinin merkezinde aşağı GFP floresan bir şerit olarak görünmelidir.
  2. Dpp sürümü görselleştirmek için 2 dakika için 2 Hz hızında görüntüleri toplayın. En iyi sonuçlar için lazeri, görüntü koleksiyonu sırasında aşırı beyazlatmayı önlemek için Dpp serbest hücrelerinin net bir görüntüsünü elde edecek kadar güçlü bir ayarda ayarlayın. Görüntüler daha sonra AVI dosyaları (sıkıştırma, 3 kare / s) Dpp sürümü video dosyaları elde etmek için dışa aktarılabilir bir zaman serisi olarak toplanabilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Şekil 2 bu protokolün temsili canlı görüntüleme sonuçlarını gösterir. Protokol başarılı olduğunda, Dpp-GFP kanat diskinin merkezinde nisbeten aşağı doğru bir şerit olarak görülebilir ve çekirdekleri Dpp-GFP bölgesinde floresan olmayan daireler olarak görülebilir (Şekil 2). Dpp-GFP sürümü görünür ve kaybolan floresan puncta olarak görülebilir. Dpp-GFP floresansının hücre cisimlerinde ve hücre cisimlerinden uzak larda ortaya çıktığını ve kaybolduğunu gözlemledik. ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dpp gibi BmP'ler, komşu veya görünüşte uzak hücrelerde hücre içi sinyal bir çağlayan neden membran bağlı reseptörleri karmaşık bir bağlamak zaman önemli bir etki yapmak. Dr Thomas Kornberg'in laboratuvarı göstermiştir ki, sitokinler15,24,25olarak adlandırılan aktin bazlı ince filapodia benzeri yapılar kullanarak sinyal alan Dpp sinyal temas hücrelerini üreten hücreler . Bu veriler, bu bağlamda gelişimsel hücre-hücre iletişiminin...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dr. Sarala Pradhan'a bu protokolün daha önceki bir versiyonu üzerinde çalıştığı için teşekkür ederiz. Bu protokolü geliştirirken finansman için NSF-IOS 1354282'ye teşekkür ederiz. Nih-NIDCR RO1DE025311'e şu anda laboratuvarımızı finanse ettiği için teşekkür ederiz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Ekmek mayasıKızılyıldız   
CaCl2 dyhidratFisher ScientificC79-500
LamellerVWR484-457
Çift taraflı bantScotch
Drosophila Agar Tip IIApex66-104
Drosophila melanogaster: < / em> Dpp-GAL4 / TM6 Tb HuBu hisse senedi yakında Bloomington Drosophila Stock Center
Drosophila melanogaster: Sp/CyO-GFP; UAS-Dpp-GFP/TM6 Tb HuBu hisse senedi yakında Bloomington Drosophila Stok Merkezi'nde satışa sunulacak
Dumont Cımbız #5HEPES
Sigma 500233 AldrichH3375
KClFisher ScientificAC193780010
Light Mısır ŞurubuKaro
Malt ÖzüBreiss
MgCl2Fisher ScientificAC223210010
Mikroskop slaytlarıSigma AldrichS8400
NaClFisher ScientificS271-500
NaHCO3RPIS22060-1000.0
OjeElektron Mikrosroskopi Bilimleri72180
Propiyonik AsitVWRU330-09
Soya UnuADM Özel Malzemeler062-100
SükrozFisher ScientificS5-3
SükrozFisherS512
TegoseptGenesee Scientific20-259
Trehaloz dihidratChem-Impex Uluslararası, Inc.00766
Sarı Mısır UnuQuaker
Zeiss LSM 780 konfokal mikroskopCanlı görüntüleme içinZeiss
Mikroskop Zeiss SteREO Discovery.V8 mikroskobuDiseksiyonlar için ZeissMikroskobu

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ferguson, E. L., Anderson, K. V. Decapentaplegic acts as a morphogen to organize dorsal-ventral pattern in the Drosophila embryo. Cell. 71 (3), 451-461 (1992).
  2. Ferguson, E. L., Anderson, K. V. Localized enhancement and repression of the activity of the TGF-beta family member, decapentaplegic, is necessary for dorsal-ventral pattern formation in the Drosophila embryo. Development. 114 (3), 583-597 (1992).
  3. Wharton, K. A., Ray, R. P., Gelbart, W. M. An activity gradient of decapentaplegic is necessary for the specification of dorsal pattern elements in the Drosophila embryo. Development. 117 (2), 807-822 (1993).
  4. Raftery, L. A., Twombly, V., Wharton, K., Gelbart, W. M. Genetic screens to identify elements of the decapentaplegic signaling pathway in Drosophila. Genetics. 139 (1), 241-254 (1995).
  5. Raftery, L. A., Sanicola, M., Blackman, R. K., Gelbart, W. M. The relationship of decapentaplegic and engrailed expression in Drosophila imaginal disks: do these genes mark the anterior-posterior compartment boundary. Development. 113 (1), 27-33 (1991).
  6. Blackman, R. K., Sanicola, M., Raftery, L. A., Gillevet, T., Gelbart, W. M. An extensive 3' cis-regulatory region directs the imaginal disk expression of decapentaplegic, a member of the TGF-beta family in Drosophila. Development. 111 (3), 657-666 (1991).
  7. de Celis, J. F. Expression and function of decapentaplegic and thick veins during the differentiation of the veins in the Drosophila wing. Development. 124 (5), 1007-1018 (1997).
  8. De Celis, J. F. Pattern formation in the Drosophila wing: The development of the veins. Bioessays. 25 (5), 443-451 (2003).
  9. Letsou, A., et al. Drosophila Dpp signaling is mediated by the punt gene product: a dual ligand-binding type II receptor of the TGF beta receptor family. Cell. 80 (6), 899-908 (1995).
  10. Nellen, D., Affolter, M., Basler, K. Receptor serine/threonine kinases implicated in the control of Drosophila body pattern by decapentaplegic. Cell. 78 (2), 225-237 (1994).
  11. Raftery, L. A., Sutherland, D. J. TGF-beta family signal transduction in Drosophila development: from Mad to Smads. Developmental Biology. 210 (2), 251-268 (1999).
  12. Dahal, G. R., Pradhan, S. J., Bates, E. A. Inwardly rectifying potassium channels regulate Dpp release in the Drosophila wing disc. Development. 144 (15), 2771-2783 (2017).
  13. Dahal, G. R., et al. An inwardly rectifying K+ channel is required for patterning. Development. 139 (19), 3653-3664 (2012).
  14. George, L. F., et al. Ion Channel Contributions to Wing Development in Drosophila melanogaster. G3. 9 (4), Bethesda. 999-1008 (2019).
  15. Huang, H., Liu, S., Kornberg, T. B. Glutamate signaling at cytoneme synapses. Science. 363 (6430), 948-955 (2019).
  16. Teleman, A. A., Cohen, S. M. Dpp gradient formation in the Drosophila wing imaginal disc. Cell. 103 (6), 971-980 (2000).
  17. Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).
  18. Dahal, G. R., Pradhan, S. J., Bates, E. A. Inwardly rectifying potassium channels influence Drosophila wing morphogenesis by regulating Dpp release. Development. 144 (15), 2771-2783 (2017).
  19. Duffy, J. B. GAL4 system in Drosophila: a fly geneticist's Swiss army knife. Genesis. 34 (1-2), 1-15 (2002).
  20. Hazegh, K. E., Reis, T. A Buoyancy-based Method of Determining Fat Levels in Drosophila. Journal of Visualized Experiments. (117), e54744(2016).
  21. Feng, Y., Ueda, A., Wu, C. F. A modified minimal hemolymph-like solution, HL3.1, for physiological recordings at the neuromuscular junctions of normal and mutant Drosophila larvae. Journal of Neurogenetics. 18 (2), 377-402 (2004).
  22. Hsiung, F., Ramirez-Weber, F. A., Iwaki, D. D., Kornberg, T. B. Dependence of Drosophila wing imaginal disc cytonemes on Decapentaplegic. Nature. 437 (7058), 560-563 (2005).
  23. Roy, S., Hsiung, F., Kornberg, T. B. Specificity of Drosophila cytonemes for distinct signaling pathways. Science. 332 (6027), 354-358 (2011).
  24. Kornberg, T. B., Roy, S. Cytonemes as specialized signaling filopodia. Development. 141 (4), 729-736 (2014).
  25. Roy, S., Huang, H., Liu, S., Kornberg, T. B. Cytoneme-mediated contact-dependent transport of the Drosophila decapentaplegic signaling protein. Science. 343 (6173), 1244624(2014).
  26. Kornberg, T. B., Roy, S. Communicating by touch--neurons are not alone. Trends in Cell Biology. 24 (6), 370-376 (2014).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Konfokal MikroskopiFloresan G r nt lemeBMP Sinyal yoluGFP EtiketlemeSitonem DinamikleriKanat Diski DiseksiyonuZaman Atlamal G r nt lemeGenetik Fakt rler

İlgili makaleler