Diferansiye İnsan Monosit türevi Makrofajlarda Hücre Dışı Tuzak Salınımının İn Vitro Stimülasyon ve Görselleştirilmesi

Nötrofillerden edinen ET salınımı ilk olarak bakteriyel enfeksiyon tarafından tetiklenen doğuştan gelen bir immün yanıt olarak tanımlanmıştır^1. Nötrofil elastaz ve miyeloperoksidaz²gibi anti-bakteriyel özelliklere sahip çeşitli granül proteinlerin bağlı olduğu bir DNA omurgası oluşur. Nötrofil ETs birincil rolü (NETs) patojenleri yakalamak ve bunların ortadan kaldırılması kolaylaştırmak^{tır 3}. Bununla birlikte, immün savunmada ET'lerin koruyucu rolüne ek olarak, özellikle inflamasyona dayalı hastalıkların (örneğin romatoid artrit ve ateroskleroz⁴). ET salınımı interlökin 8 (IL-8) ve tümör nekroz faktörü alfa (TNFα)^5,6dahil olmak üzere çeşitli pro-inflamatuar sitokinler tarafından tetiklenebilir ve ET'lerin lokalize birikimi doku hasarı artırabilir ve bir uyandırmak pro-inflamatuar yanıt⁷. Örneğin, ET'ler ateroskleroz gelişiminde nedensel bir rol oynadığı için karıştığı edilmiştir⁸, tromboz teşvik⁹, ve kardiyovasküler risk tahmin¹⁰.

Şimdi nötrofiller ek olarak, diğer bağışıklık hücreleri (yani, mast hücreleri, eozinofiller, ve makrofajlar) ayrıca mikrobiyal veya pro-inflamatuar stimülasyon 11 ,¹²maruz kalma ET'ler serbest bırakabilirsiniz kabul edilmektedir. Bu durum, kronik inflamatuar hastalıkların gelişiminde, düzenlenmesinde ve çözümünde kilit rol oynadıkları göz önünde bulundurularak makrofajlar açısından özellikle önemli olabilir. Bu nedenle, makrofajlar et sürümü ve inflamasyona bağlı hastalık gelişimi arasındaki potansiyel ilişki daha iyi anlaşılması önemlidir. Son çalışmalar sağlam insan aterosklerotik plaklar ve organize trombüs¹³METs ve NETs varlığını göstermiştir. Benzer şekilde, METs inflamatuar yanıtların düzenlenmesi ile böbrek hasarı sürüş karıştığı edilmiştir¹⁴. Ancak nötrofillerin aksine makrofajlardan MET oluşumu mekanizmaları hakkında sınırlı veri vardır. MET oluşumuinsan in vitro modellerini kullanarak yapılan son çalışmalar, her hücre tipinde yer alan yollarda bazı farklılıklar göstermektedir (yani, makrofajlarla histon sitrullination yokluğu ile ilgili)⁶. Ancak, bazı NET sürümü de histon sitrullination yokluğunda oluşabilir göstermiştir¹⁵.

Bu protokolün genel amacı, MET salınımını klinik olarak ilgili bir makrofaj modelinde değerlendirmek için basit ve doğrudan bir yöntem sağlamaktır. MET'leri incelemek için kullanılan farklı in vitro makrofaj hücre modelleri vardır (yani, THP-1 insan monosit hücre hattı ve çeşitli murine makrofaj hücre hatları)¹⁶. Bu modeller ile ilişkili bazı sınırlamalar vardır. Örneğin, THP-1 monositlerinin makrofajlara farklılaşması genellikle protein kinaz C (PKC) bağımlı yolları aktive eden phorbol myristate asetat (PMA) eklenmesi gibi bir astar adım gerektirir. Bu işlem ET salınımı^tetiklediği bilinmektedir 4 ve THP-1 hücrelerinden düşük bazal MET sürümü ile sonuçlanır. Diğer çalışmalar pma tedavi THP-1 hücreleri¹⁷ile karşılaştırıldığında in vivo makrofajlar tarafından monte biyoaktivite ve inflamatuar yanıtları bazı farklılıklar vurgulamıştır.

Benzer şekilde, farklı murine makrofaj benzeri hücre hatlarının davranışı ve inflamatuar yanıtları tamamen birincil insan makrofajlarının yanıt spektrumu temsil etmez¹⁸. Bu nedenle, klinik ortamda makrofaj ET oluşumunu araştırmak amacıyla, birincil insan monosit kaynaklı makrofajlar (HMDM) monositik veya murine makrofaj benzeri hücre hatları yerine daha alakalı bir model olduğuna inanılmaktadır.

M1 polarize HMDM et sürümü farklı inflamatuar uyaranların bir dizi bu hücrelerin maruz kalma sonrasında gösterilmiştir, miyeloperoksidaz türetilmiş oksidan hipokloröz asit de dahil olmak üzere (HOCl), PMA, TNFα, ve IL-8⁶. Burada açıklanan M1 fenotip HMDMs polarize etmek ve bu inflamatuar uyaranlara maruz kalma üzerine sonraki MET sürümü görselleştirmek için bir protokoldür. PMA nötrofil kullanmış önceki çalışmalara karşılaştırmaları kolaylaştırmak için MET sürümü bir uyarıcı olarak kullanılır. Daha da önemlisi, HOCl, IL-8, ve TNFα da MET salınımını uyarmak için kullanılır, hangi in vivo inflamatuar ortamın daha iyi modelleri olduğuna inanılmaktadır. ET salınımını görselleştirme için mikroskobik yöntem, önceki nötrofil çalışmalarında başarıyla uygulanmış bir geçirimsiz floresan yeşil nükleik asit lekesi olan SYTOX yeşili kullanılarak canlı hücre kültürlerinde hücre dışı DNA'nın boyanmasını içerir. Bu yöntem ET salınımının hızlı ve nitel olarak değerlendirilmesine olanak sağlar, ancak ET salınım kapsamının nicelleştirilmesi için tek başına bir yöntem olarak uygun değildir. Farklı tedavi koşullarından veya müdahalelerden kaynaklanan ET salınımının kapsamını karşılaştırmak için niceleme gerekiyorsa alternatif metodoloji kullanılmalıdır.

HMDM, Sydney Yerel Sağlık Bölgesi'nin etik onayı ile kan bankası tarafından sağlanan insan buffy ceket preparatlarından izole edildi.

1. HMDM Kültürü

1. Lenfositleri izole etmek için ticari olarak kullanılabilir bir hazırlık kullanarak sağlıklı insan donörlerin periferik kan hazırlanan buffy kat preparatları monositler izole, karşı akım santrifüj elutriation takip^{19, 20. yıl.}
2. Monosit karakterizasyonu için modifiye Giemsa lekesi ile sitospinning ve boyama ile monositvarlığını onaylayın¹⁹.
3. Steril koşullarda, serumsuz RPMI-1640 ortam ını kullanarak monosityoğunluğunu 1 x 10⁶ hücre/mL olarak ayarlayın. 12 kuyu doku kültürü plaka her kuyuya bu hücre süspansiyon 1 mL ekleyin. Doku kültürü plakasına bağlılığı teşvik etmek için %5 CO₂ ila 2 saat içinde 37 °C'de bir hücre kuluçka makinesinde kültür.
4. Steril koşullar altında, hücre ortamını çıkarın ve %10 (v/v) havuzlu insan serumu ve 20 mM L-glutamin içeren komple RPMI-1640 kültür ortamı ile değiştirin.
5. Bir hücre kuluçka makinesinde %5 CO₂ varlığında 37 °C'deki hücreleri 8 gün boyunca kültürlendirerek, 2 günde bir ortam değiştirin.

2. HMDM'nin Kutuplaşması

1. Steril koşullar altında, RPMI-1640 kültür ortamının tamamına interferon γ (IFNγ; 20 ng/mL) ve lipopolisakkarit (LPS; 1 μg/mL) ekleyerek M1 astar ortamını hazırlayın. Komple RPMI-1640 kültür ortamına interlökin 4 (IL-4; 20 ng/mL) ekleyerek M2 astar ortamını hazırlayın.
2. Steril koşullar altında, bölüm 1'de açıklandığı gibi tohumlanmış ve kültürlü hmdm içeren doku kültürü plaka kuyularından aspire ortamı.
3. Hücreleri içeren kuyuları steril PBS (önceden 37 °C'ye Önceden ısıtılmış) ile 1 mL aliquots PBS kullanarak dikkatlice yıkayın.
4. HMDM içeren her kuyuya (deneme için uygun olan) M1 veya M2 astar lı ortamdan 1 mL ekleyin.
5. Hücreleri 37 °C'de 48 saat boyunca bir hücre kuluçka makinesinde %5 CO₂ varlığında kuluçkaya yatırın.

3. MET Salınımını sağlamak için HMDM'nin uyarılması

1. Steril koşullar altında, MET salınımının farklı uyarıcılarını içeren kültür ortamını (deney için uygun olan) tam RPMI-1640 ortama hazırlayın: PMA (25 nM), insan rekombinantTTNFα (25 ng/mL) veya insan rekombinant IL-8 (50 ng/mL ).
2. HOCl stimülasyon deneyleri için, hücrelere ilave edilmeden hemen önce HBSS'de (önceden 37 °C'ye ısınmış) HOCl (200 μM) hazırlayın. HOCl'un tam hücre li ortamiçinde hazırlanmadığından emin olun.
   NOT: HOCl stok çözeltisinin konsantrasyonu çözeltinin UV emmesinin 292 nm ve pH = 11^6'da ölçülmesi ve 350 M^-1cm^-121'likbir tükenme katsayısı kullanılarak ölçülür.
3. Bölüm 2'de açıklanan polarizasyon tedavisinden sonra, hücre ortamını her kuyudan aspire edin ve hücreleri 3x'i 1 mL aliquots ile dikkatlice yıkayın: steril PBS (PMA, TNFα ve IL-8 için) veya HBSS (HOCl için), önceden ısıtılmış olan 37 °C'ye kadar ısıtın.
4. PMA, TNFα veya IL-8 ile yapılan deneyler için: Son yıkama adımında PBS'yi çıkardıktan sonra PMA, TNFα veya IL-8 içeren tüm ortamlardan 1 mL ekleyin.
5. TNFα ile yapılan deneyler için, hücreleri 37 °C'de 6 saat kuluçkaya yatırın ve hücre kuvözde %5 CO₂ bulunur. PMA ve IL-8 ile yapılan deneylerde, hücreleri 37 °C'de 24 saat boyunca bir hücre kuluçka makinesinde %5 CO₂ varlığında kuluçkaya yatırın.
6. HOCl ile yapılan deneyler için, son yıkama adımında HBSS'yi çıkardıktan sonra HBSS'ye 1 mL HOCl ekleyin. Daha sonra, bir hücre kuluçka makinesinde %5 CO₂ varlığında hücreleri 37 °C'de 15 dakika kuluçkaya yatırın.
   1. Hücre supernatant'ı dikkatlice aspire edin ve 3.3 adımda açıklandığı gibi hücreleri 1 mL HBSS ile 3x yıkayın.
   2. HBSS'yi son yıkama adımından çıkardıktan sonra 1 mL tam RPMI-1640 kültür ortamı ekleyin. Daha sonra, bir hücre kuluçka makinesinde %5 CO₂ varlığında hücreleri 37 °C'de 24 saat kuluçkaya yatırın.

4. Canlı Hücre Kültüründe MET'nin Görselleştirilmesi

1. HBSS'de 40 μM konsantrasyonda SYTOX yeşil boya hazırlayın.
2. MET salınımını sağlamak için bölüm 3'te açıklanan tedavilerin sonunda, hmdm içeren her kuyuya doğrudan 25 μL 40 μM boya ekleyin.
3. Karanlıkta 5 dakika oda sıcaklığında (RT) hücreleri kuluçka.
4. HMDM'yi doku kültürü kuyularına, görüntüleme için ters floresan mikroskobun mikroskop aşamasına yerleştirin.
5. Mikroskop prosedürleri
   1. Geniş spektrumlu floresan ışık kaynağını, parlak alan ışık kaynağını ve yüksek çözünürlüklü renkli dijital fotoğraf makinesiyle yüklü ters mikroskobu açın (Bkz. Malzeme Tablosu).
   2. Filtre tekerleğini, doku kültürü kuyularında bulunan yeşil lekeli örneklerin görüntülenmesi için yeşil floresan (uyarma = 504 nm, emisyon = 523 nm) için "2 numara" konumuna döndürün.
   3. 5x hedefini kullanarak, görüntüyü kaba odakla odaklayın, ardından mikroskopüzerinde ince odaklama topuzları, görüntü mikroskop merceğinde nivesal, net ve odaklanmış görünene kadar.
   4. Mikroskobu kamera moduna geçirin.
   5. İlişkili yazılımı başlatın.
   6. Yazılımdaki Yakalama sekmesini seçin.
   7. Görüntüyü önizlemek için Oynat düğmesini tıklatın ve görüntü net, net ve yazılım önizleme penceresinde odaklanana kadar mikroskoptaki ince odak düğmesini ayarlayın.
   8. Yakala düğmesini tıklatın.
      NOT: Yakalanan görüntü otomatik olarak eşlik eden yazılımda görüntülenir.
   9. Yazılım içinde Dosya | Gerekli görüntü dosyası türü olarak kaydedin.
   10. Mikroskopta, filtre tekerleğini brightfield görüntüleme için "5 numara" konumuna döndürün ve ilgili brightfield görüntüsünü elde etmek için 4.5.2-4.5.9 adımlarını tekrarlayın.
   11. Sonraki görüntü edinimi için gerekli olan 4.5.2-4.5.10 adımlarını tekrarlayın.

Hücre farklılaşması için uyaranlara yanıt olarak HMDM'nin morfolojik değişikliklerini gösteren brightfield görüntüleri Şekil 1'degösterilmiştir. IFNγ ve LPS'ye maruz kalan HMDM ile yapılan deneylerdeki M1 polarize makrofajlar, Şekil 1'deki (orta panel) siyah oklarda gösterildiği gibi uzamış ve mil benzeri bir hücre şekli gösterdi. Karşılaştırma için, HMDM'nin 48 saat il-4'e maruz kalmasından sonra M2 polarize makrofajların morfolojisi şekil 1'deki (en sağ daki panel) siyah oklarda belirtildiği gibi tipik olarak yuvarlak ve.

Farklılaştırılmış HMDM fenotiplerinin MET salgılayabilme yeteneği Şekil 2'desunulduğu gibi, SYTOX yeşili ile canlı hücre floresan görüntülemesi ile görselleştirildi. Şekil 2A, pro-inflamatuar uyaranların yokluğunda 24 saat kuluçkaya yatırılamış her HMDM fenotipten elde edilen kontrol verilerini göstermektedir. Bu durumda, bu lekenin hücre imperkast doğası göz önüne alındığında, beklendiği gibi, çok sınırlı yeşil boyama vardı. Şekil 2B, M1 HMDM'lerin HOCl, PMA, IL-8 veya TNFα'ya maruz kalmasından kaynaklanan metler için pozitif boyama gösterdi. MET'ler, hücre dışı DNA iplikçiklerinden kaynaklanan yeşil çizgiler olarak gösterilen beyaz oklarla gösterilir. HOCl ile, ekstrasellüler DNA boyama ek olarak, bazı yeşil boyama hücreleri belirgin oldu. Bu hücresel lekelenme de diğer uyaranlarla bir dereceye kadar gözlendi ve tedavi koşulları nın bir sonucu olarak ET-bağımsız hücre ölümü sonucu membran bütünlüğünün kaybını yansıttığına inanılmaktadır.

Şekil 2B ayrıca IL-4'e maruz kalan M2 HMDM'lerle yapılan ilgili deneyleri de göstermektedir. Bu durumda, hücre dışı DNA iplikçiklerinin/çizgilerin yokluğunda belirtildiği gibi, hücrelerden DNA salınımı yoktu; rağmen, HOCl ve TNFα ile yeşil floresan boya bazı hücresel alımı vardı. Karşılaştırmalı amaçlar için Şekil 3, 4 saat boyunca TNFα'ya (50 ng/mL) maruz kalan THP-1 makrofajlarından MET salınımı gösteren temsili verileri gösterir. Bu durumda, polarize olmayan hücre popülasyonunun kullanıldığı ve THP-1 monositlerinin daha önce22kez açıklandığı gibi PMA (72 saat için 50 ng/mL) ile ön tedavi ile makrofajlara farklılaştırıldığı unutulmamalıdır.

Şekil 1: Diferansiyel polarize HMDM'lerin morfolojik değişiklikleri. Farklılaşmamış ve farklılaştırılmış HMDM'lerden (n ≥5) gelen temsili brightfield görüntüleri. HMDM'ler, ifnγ ve LPS veya IL-4'e maruz kaldıktan sonra M1 veya M2 fenotipine girmeden önce 8 gün boyunca insan serumu ve glutamin içeren komple ortamla, sırasıyla 48 saat ölçek çubuğu = 200 μm için kültürlendi. Oklar M1 veya M2 HMDM'lerin morfolojik özelliklerini gösteren hücre örneklerini gösterir.

Şekil 2: HOCl, PMA, IL-8 ve TNFα stimülasyonu ndan sonra M1 HMDM'ler tarafından üretilen MET'ler. SYTOX yeşil lekeli HMDM temsili görüntüler (A) Non-uyarılmış M1 ve M2 HMDMs herhangi bir inflamatuar uyaranların yokluğunda 24 saat için kuluçkaya yatırıldı, MET serbest yokluğu gösteren kontrol olarak kullanılmıştır. (B) M1 ve M2 HMDM'ler 1) HOCl (200 μM, 15 dk), PMA (25 nM) veya IL-8 (50 ng/mL) 24 veya 2) TNFα (25 ng/mL) kuluçka ile tedavi edildi ve MET salınımına neden olmak için 6 saat kuluçka süresi verildi. MET'ler, M1 HMDM'lerin üst panelindeki beyaz oklarla gösterildiği gibi SYTOX yeşilinin eklenmesiyle görselleştirildi. M2 HMDM ile ilgili deneylerde METS görülmedi. Ölçek çubuğu = 500 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: TNFα stimülasyonu ndan sonra polarize olmayan THP-1 makrofajları tarafından üretilen METler. SYTOX yeşil lekeli TNP-1 makrofajlarının temsili görüntüleri, MET salınımını sağlamak için TNFα'nın yokluğunda veya varlığında 4 saat daha fazla kuluçkadan önce PMA (72 saat için 50 ng/mL) ile ön tedavi ile ayırt edildi. MET'ler SYTOX yeşili ilave edilerek görselleştirildi. Veriler, n ≥ 3 deneylerinden elde edilen kültür kuyularını temsil eder. Ölçek çubuğu = 100 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.