Bu protokolün amacı, melez hücreler oluşturmak için iki farklı hücre türünü birleştirmektir. Erimiş hücrelerin floresan mikroskobu analizi hücresel organellerin menşe hücresini izlemek için kullanılır. Bu tetki, hücre yapısı nın ve fonksiyonun hücre füzyonu ile tedirginlik lere nasıl tepki verdiğinin araştırılması için kullanılabilir.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Hücresel Yapı ve Fonksiyonun Perturbasyonu için Genom Düzenlenmiş Hücre Hatları hücre-hücre Füzyon
Bu makalede
Özet
Özet
Yaşam, hücre ve organeller içinde farklı moleküler durumların izole oluşumunu sağlamak için lipid membranları içinde mekansal olarak bölümlenir. Hücre füzyonu, tek bir hücreyi oluşturmak için iki veya daha fazla hücrenin birleşmesidir. Burada iki farklı hücre türünün hücre füzyonu için bir protokol salıyoruz. Erimiş hibrid hücreler akış sitometri tabanlı sıralama ile zenginleştirilmiş, hibrid hücre yapısı ve fonksiyonufloresan mikroskobu takip. Genom düzenleme tarafından üretilen floresan etiketli proteinler erimiş hücrelerin içinde görüntülenir, hücre yapıları floresan emisyona göre tespit ve kökeni hücre tipine geri başvurulmasını sağlar. Bu sağlam ve genel yöntem, hücresel yapıyı ve işlevi bir dizi temel biyolojik soru da anlamak için farklı hücre tiplerine veya ilgi organlarına uygulanabilir.
Giriş
Hücresel yapının homeostatik bakımı yaşam için çok önemlidir. Hücreler karakteristik morfolojilere, hücre altı organel sayılarına ve iç biyokimyasal bileşimlere sahiptir. Bu temel özelliklerin nasıl oluşturulduğunu ve hastalık sırasında nasıl ters gittiklerini anlamak, onları tedirgin etmek için laboratuvar araçları gerektirir.
Hücre füzyonu iki veya daha fazla ayrı hücrenin birleşmesidir. Hücre füzyonu ökaryotik yaşamın ortaya çıkması için kritik olabilir1. İnsan vücudunda, hücre füzyonu nispeten nadirdir, sınırlı gelişimsel durumlar ve doku tipleri sırasında meydana gelen, döllenme veya kas oluşumu sırasında gibi, ....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
1. Diferansiyel Floresan Hücre Etiketleme
- CRISPR Cas9 ile gen etiketleme
- CrispR Cas9 genom düzenlemesini kullanarak insan kanser hücresi hatlarındaki floresan proteinler meGFP veya mScarlet-I ile rootletin (veya diğer ilgi genlerini) etiketleyin.
NOT: Genom düzenleme için ayrıntılı protokoller başka bir yerde24,25,26kapsamaktadır.
- CrispR Cas9 genom düzenlemesini kullanarak insan kanser hücresi hatlarındaki floresan proteinler meGFP veya mScarlet-I ile rootletin (veya diğer ilgi genlerini) etiketleyin.
- Floresan boya etiketleme
- 37 °C'de %10 fetal sığır serumu (FBS), L-glutamin ve 37 °C'de 100 μg/mL penisilin/streptomisin ve %5 CO 2 nemli bir inkuvtörde %5 CO2 ile destek....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Uygun şekilde etiketlenmiş hücreler akış sitometrisi sırasında floresan sinyali ile etiketlenmemiş kontrol hücrelerinden daha yüksek görünür(Şekil 2A). Kapılar çift pozitif hücrelerin ayıklanması için ayarlanmış, daha fazla mikroskobik analizler için görüntüleme yemekleri doğrudan bu popülasyon zenginleştirmek. Erimiş hücreler farklı çift floresan pozitif hücreler olarak saptanabilir ve nüfusun yaklaşık ~ 1% oluşturmaktadır.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Hücreleri eritmek ve hücre melezlerinin sonraki mimarisini mikroskopi ile görselleştirmek için kolay ve uygun maliyetli bir protokol gösteriyoruz, baştan sona yaklaşık iki gün sürüyor. Bu protokolün kritik bölümleri, erimiş hücrelerin hücre sıralaması (protokol bölüm 3) ile zenginleşmesi ve erimiş hücrelerin mikroskopi ile dikkatli bir şekilde doğrulanmasıdır (protokol bölümü 4). Bu bölümler, erimiş hücrelerin kolayca elde edilmesini ve iyi niyetli heterokaryonlar olmasını sağlar. Konsantrasyonlar ve kuluçka süreleri uyu.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Teşekkürler
Bu çalışma Wellcome Trust Henry Wellcome Bursu ile R.M. (https://wellcome.ac.uk/grant numarası 100090/12/Z) tarafından finanse edilmiştir. Funder çalışma tasarımı, veri toplama ve analizi, yayımlama kararı, ya da el yazması hazırlanmasında hiçbir rolü vardı. Ashok Venkitaraman ve Paul French'e proje hakkında eleştirel tavsiyeler ve rehberlik için teşekkür ederiz. Biz mükemmel destek için Cambridge Enstitüsü Tıbbi Araştırma Akış Cytometry tesisinde Chiara Cossetti ve Gabriela Grondys-Kotarba teşekkür ederiz. Taslağı doğruldukları için Liam Cassiday, Thomas Miller ve Gianmarco Contino'ya teşekkür ederiz.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 15 mL tüp | Sarstedt | 62554502 | |
| %37 formaldehit çözeltisi | Sigma-Aldrich | F8875 | |
| 880 Lazer Taramalı Konfokal Airyscan Mikroskobu | Carl Zeiss | ||
| 8 kuyulu görüntüleme çanakları | Ibidi | 80826 | |
| Anti-GFP alpaka GFP güçlendirici nanobody | Chromotek | gba-488 | |
| BD Akışı Hücre Sıralayıcı: | BD Biosciences, | ||
| Sığır serum albümini, | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Hücre Filtreleri (70 &; m) | Biofil | CSS010070 | |
| CellTrace Uzak Kırmızı | ThermoFisher Scientific | C34572 | |
| CellTrace Menekşe | ThermoFisher Scientific | C34571 | |
| Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı (DMEM), yüksek glikoz, GlutaMAX, piruvat | ThermoFisher Scientific | 31966021 | |
| Fetal Sığır Serumu | Sigma-Aldrich | 10270-106 | |
| FluoTag-X2 anti-mScarlet-I alpaka nanobody | NanoTag Biyoteknoloji | N1302-At565 | |
| L15 CO2< / sub> bağımsız görüntüleme ortamı | Sigma-Aldrich | 21083027 | |
| Fenol kırmızı içermeyen DMEM, yüksek glikoz | ThermoFisher Scientific | 21063029 | |
| Fosfat tamponlu tuzlu su (1x PBS) | 8 g NaCl, 0,2 g KCl, 1,44 g Na2HPO4, 0,24 g KH2HPO4, dH2O, 1 L'ye kadar | ||
| Polietilen Glikol Hybri-Max 1450 | Sigma-Aldrich | P7181 | |
| Polipropilen tüpler | BD Falcon | 352063 | |
| Triton X-100 | Fisher BiyoReaktifleri | BP151 | noniyonik yüzey aktif madde |
| Tripsin | Sigma-Aldrich | T4049 | |
| Tween 20 | Fisher BioReagents | BP337 | noniyonik deterjan |
Kaynaklar
- Lane, N. Power, Sex, Suicide: Mitochondria and the meaning of life. , Oxford University Press. Oxford, UK. (2006).
- Brukman, N. G., Uygur, B., Podbilewicz, B., Chernomordik, L. V. How cells fuse. The Journal of Cell Biology. 218 (5), 1436-1451 (2019).
- Köhler, G., Milstein, C.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
