Bu protokol, hücre döngüsü ölçümlerini bir kütle sitometri platformunda kullanılmak üzere uyarlar. Kütle sitometrisinin çok parametreli yetenekleriyle, iyot katılımının doğrudan ölçümü, S-fazındaki hücrelerin tanımlanmasına izin verirken, hücre içi döngü belirteçleri, her bir hücre döngüsü durumunun bir dizi deneysel koşulda karakterizasyonunu sağlar.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Bir Kütle Sitometri Platformunda Hücre Döngüsü Fazları Oluşturmak için Pirimidin Analogu, 5-İyodo-2′-Deoksiüridin (IdU) Hücre Döngüsü Belirteçleri ile Kullanımı
Bu makalede
Özet
Özet
Hücre döngüsü fazının düzenlenmesi, hücresel proliferasyon ve homeostazın önemli bir yönüdür. Hücre döngüsünü yöneten düzenleyici mekanizmaların bozulması, kanser de dahil olmak üzere bir dizi hastalığın bir özelliğidir. Hücre döngüsünün incelenmesi, hücre döngüsü ilerlemesinin her bir bölümündeki hücre sayısını tanımlamanın yanı sıra her hücre döngüsü fazı arasında açıkça tanımlama yeteneğini gerektirir. Kütle sitometrisinin (MCM) ortaya çıkışı, elementel izotopların doğrudan ölçümleri yoluyla yüksek verimli tek hücre analizi için muazzam bir potansiyel sağlar ve MCM tarafından hücre döngüsü durumunu ölçmek için bir yöntemin geliştirilmesi, MCM'nin faydasını daha da genişletir. Burada, bir MCM sisteminde 5-bromo-2'-deoksiüridin (BrdU) benzeri 5-iodo-2′-deoksiüridin (IdU) 'yi doğrudan ölçen bir yöntemi açıklıyoruz. Bu IdU tabanlı MCM'nin kullanımı çeşitli avantajlar sağlar. İlk olarak, IdU, sentezi sırasında DNA'ya hızla dahil edilir ve S-fazındaki hücrelerin 10-15 dakika kadar kısa inkübasyonlarla güvenilir bir şekilde ölçülmesini sağlar. İkincisi, IdU, ikincil antikorlara ihtiyaç duymadan veya DNA yıkımına ihtiyaç duymadan ölçülür. Üçüncüsü, IdU boyaması, siklin B1, fosforile retinoblastoma proteini (pRb) ve fosforile histon H3 (pHH3) ölçümü ile kolayca birleştirilebilir ve bu da toplu olarak beş hücre döngüsü fazının net bir şekilde tanımlanmasını sağlar. Bu hücre döngüsü belirteçlerinin MCM ile mümkün olan çok sayıda parametre ile kombinasyonu, diğer birçok metrikle kombinasyona izin verir.
Giriş
Kütle sitometrisi, kütle spektroskopisinin yüksek çözünürlüklü ve kantitatif doğasından yararlanarak yaklaşık 40 parametrenin tespit edilmesini sağlar. Metal etiketli antikorlar, daha fazla sayıda kanala izin veren ve minimum yayılma üreten florofor konjuge antikorlar yerine kullanılır 1,2. MCM, akış sitometrisine kıyasla hücre döngüsü analizi açısından avantaj ve dezavantajlara sahiptir. MCM'nin en büyük avantajlarından biri, çok sayıda parametrenin, oldukça heterojen örneklerde çok sayıda immünofenotipik olarak farklı T hücresi tipinde hücre döngüsü durumunun eşzamanlı olarak ölçülmesini sağlamasıdır. MCM, i....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
1. IDU stoklarının hazırlanması
- DMSO'da 5-iodo-2'-deoksiüridin (IdU) 50 mM'lik bir konsantrasyona çözün. Steril filtre, 10-50 μL tüplere aliquot ve -80 ° C'de saklayın
- IdU'yu dondurucudan çıkarın ve oda sıcaklığında çözün. 1 mM'lik son konsantrasyonda çalışan bir çözelti oluşturmak için RPMI-1640'ta IdU'yu seyreltin. Pipet yukarı ve aşağı veya karıştırmak için vorteks.
- Tipik olarak, konsantre IdU'yu hücrelerin kültürlendiği ortama (örneğin DMEM, IMDM, vb.) seyreltin veya doğrudan periferik kan veya kemik iliği aspirat örneklerine eklemek için PBS'ye seyreltin. Bu ön seyreltme adımı, DMSO'nun ilgili hücrelerin sulu ortamı ile karıştırılmasını....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
HL-60 hücreleri ve bir insan kemik iliği aspiratı kullanarak, deneysel koşulların hücre döngüsü dağılımını ve analizini nasıl etkileyebileceğini göstermek mümkündür. İlk olarak, hücre döngüsü fazlarının nasıl türetildiğini göstermek için geçit stratejisi oluşturulmalıdır. Şekil 1'de, hücresel enkaz ve çiftlerin ayrılmasında önemli olan singlet kapısının kurulmasını, tek bir hücre popülasyonunun oluşturulmasını gösteriyoruz. Hücre çizgileri için singlet kapısı, hücre döngüsü analizine geçmek .......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Burada sunulan örnekler, hücre döngüsü dağılımını analiz etmek için bir MCM platformunun nasıl kullanılacağını göstermektedir. Ayrıca, hücre döngüsü analizinin zaman ve sıcaklık gibi deneysel koşullara duyarlı olduğu gösterilmiştir; bu, araştırmacıların hücre döngüsü analizleri için MCM'yi düşünürken göz önünde bulundurmaları gereken önemli bir husustur14. Bir saatten fazla olmamak üzere kısa bir süre için depoda bırakılan örnekler, normal durumlarıyla karşılaştırılabilir IdU katılımına sahip olac.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Dr. Behbehani, Fluidigm'den seyahat desteği alıyor. Fluidigm ayrıca laboratuvar kullanımı için reaktifler ve malzemeler satın aldı.
Teşekkürler
Yazarlar, deneysel destekleri için Palak Sekhri, Hussam Alkhalaileh, Hsiaochi Chang ve Justin Lyeberger'in çabalarına teşekkür eder. Bu çalışma Pelotonia Burs Programı tarafından desteklenmiştir. Bu materyalde ifade edilen herhangi bir görüş, bulgu ve sonuç, yazar(lar)a aittir ve Pelotonia Burs Programı'nınkileri yansıtmak zorunda değildir."
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Sığır Serum Albümini (BSA) | Sigma | A3059 | CSM |
| Santrifüj | Bileşeni Thermo Scientific | 75-217-420 | Örnek santrifüjleme |
| Cleaved-PARP (D214) | BD Biosciences | F21-852 | Apoptotik hücrelerin tanımlanması |
| Cyclin B1 | BD Biosciences | GNS-1 | G2 Çözünürlük |
| Dimetilsülfoksit (DMSO) | Sigma | D2650 | Kriyokoruyucu |
| EQ Dört Elemanlı Kalibrasyon Boncukları | Fluidigm | 201078 | CyTOF performansı için dahili metal standardı |
| FACS Tüp, ağ süzgeci | ile Corning | 08-771-23 | CyTOF çalıştırmadan önce kümeleri/kalıntıları çıkarmak için hücre süzgeci |
| Fetal Sığır Serumu (FBS) | VWR | 97068-085 | Hücre kültürü büyüme takviyesi |
| Helios | Fluidigm | CyTOF Sistemi/Platformu | |
| Heparin | Sigma | H3393 | Spesifik olmayan lekelenmeyi önlemek için boyama katkı maddesi |
| IdU (5-İyodo-2 & prim; -deoksiuridin) | Sigma | I7125 | S fazı |
| Ki-67 | eBiosciences'a | SolA15 | G0 / G1 |
| MaxPar Çoklu Etiket Kitinin Onayı | Fluidigm | 201300 | Metal etiketleme kiti, metalleri ekler antikorlara |
| Mikroplaka Çalkalayıcı | Thermo Scientific | 88880023 | Boyama sırasında numunelerin karıştırılması |
| Paraformaldehit (PFA) | Elektron Mikroskobu Hizmetleri | 15710 | Fiksatif |
| pentametilsiklopentadienil-Ir (III) -dipiridofenazin | Fluidigm | 201192 | CyTOF edinimi sırasında hücre tanımlama |
| p-H2AX (S139) | Millipore | JBW301 | DNA hasarının tespiti |
| p-HH3 (S28) | Biolegend | HTA28 | M-faz Çözünürlük |
| Fosfat Tamponlu Tuzlu Tuz (PBS) | Gibco | 14190-144 | Hücre kültürü için yıkama çözeltisi ve fiksatif çözeltinin bileşeni |
| p-Rb (S807/811) | BD Biosciences | J112906 | G0/G1 Çözünürlük |
| Proteomik Stabilizatör | SmartTube Inc | PROT1 | Örnek sabitleyici |
| RPMI 1640 | Gibco | 21870-076 | Hücre kültürü büyüme ortamı |
| Sodyum Azide | Acros Organikler | AC447810250 | CSM / Antikor tamponunun bileşeni, biyosit |
Kaynaklar
- Ornatsky, O., Baranov, V. I., Bandura, D. R., Tanner, S. D., Dick, J. Multiple cellular antigen detection by ICP-MS. Journal of Immunological Methods. 308 (1-2), 68-76 (2006).
- Ornatsky, O. I., et al.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
