Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Bir Kütle Sitometri Platformunda Hücre Döngüsü Fazları Oluşturmak için Pirimidin Analogu, 5-İyodo-2′-Deoksiüridin (IdU) Hücre Döngüsü Belirteçleri ile Kullanımı

2.8K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/60556

⸱

22 Ekim 2021

 , 
1Ohio State Comprehensive Cancer Center, Division of Hematology, The Ohio State University

Bu makalede

Özet

Bu protokol, hücre döngüsü ölçümlerini bir kütle sitometri platformunda kullanılmak üzere uyarlar. Kütle sitometrisinin çok parametreli yetenekleriyle, iyot katılımının doğrudan ölçümü, S-fazındaki hücrelerin tanımlanmasına izin verirken, hücre içi döngü belirteçleri, her bir hücre döngüsü durumunun bir dizi deneysel koşulda karakterizasyonunu sağlar.

Özet

Hücre döngüsü fazının düzenlenmesi, hücresel proliferasyon ve homeostazın önemli bir yönüdür. Hücre döngüsünü yöneten düzenleyici mekanizmaların bozulması, kanser de dahil olmak üzere bir dizi hastalığın bir özelliğidir. Hücre döngüsünün incelenmesi, hücre döngüsü ilerlemesinin her bir bölümündeki hücre sayısını tanımlamanın yanı sıra her hücre döngüsü fazı arasında açıkça tanımlama yeteneğini gerektirir. Kütle sitometrisinin (MCM) ortaya çıkışı, elementel izotopların doğrudan ölçümleri yoluyla yüksek verimli tek hücre analizi için muazzam bir potansiyel sağlar ve MCM tarafından hücre döngüsü durumunu ölçmek için bir yöntemin geliştirilmesi, MCM'nin faydasını daha da genişletir. Burada, bir MCM sisteminde 5-bromo-2'-deoksiüridin (BrdU) benzeri 5-iodo-2′-deoksiüridin (IdU) 'yi doğrudan ölçen bir yöntemi açıklıyoruz. Bu IdU tabanlı MCM'nin kullanımı çeşitli avantajlar sağlar. İlk olarak, IdU, sentezi sırasında DNA'ya hızla dahil edilir ve S-fazındaki hücrelerin 10-15 dakika kadar kısa inkübasyonlarla güvenilir bir şekilde ölçülmesini sağlar. İkincisi, IdU, ikincil antikorlara ihtiyaç duymadan veya DNA yıkımına ihtiyaç duymadan ölçülür. Üçüncüsü, IdU boyaması, siklin B1, fosforile retinoblastoma proteini (pRb) ve fosforile histon H3 (pHH3) ölçümü ile kolayca birleştirilebilir ve bu da toplu olarak beş hücre döngüsü fazının net bir şekilde tanımlanmasını sağlar. Bu hücre döngüsü belirteçlerinin MCM ile mümkün olan çok sayıda parametre ile kombinasyonu, diğer birçok metrikle kombinasyona izin verir.

Giriş

Kütle sitometrisi, kütle spektroskopisinin yüksek çözünürlüklü ve kantitatif doğasından yararlanarak yaklaşık 40 parametrenin tespit edilmesini sağlar. Metal etiketli antikorlar, daha fazla sayıda kanala izin veren ve minimum yayılma üreten florofor konjuge antikorlar yerine kullanılır 1,2. MCM, akış sitometrisine kıyasla hücre döngüsü analizi açısından avantaj ve dezavantajlara sahiptir. MCM'nin en büyük avantajlarından biri, çok sayıda parametrenin, oldukça heterojen örneklerde çok sayıda immünofenotipik olarak farklı T hücresi tipinde hücre döngüsü durumunun eşzamanlı olarak ölçülmesini sağlamasıdır. MCM, insan kemik iliği3 ve telomeraz eksikliğinin transgenik murin modellerinde normal hematopoez sırasında hücre döngüsü durumunu ölçmek için başarıylakullanılmıştır. Akut miyeloid lösemide (AML) hücre döngüsü durumunun analizi, hücre döngüsünün klinik tedavilere bilinen yanıtlarla ilişkili olduğunu ve tedavi seçimlerini bilgilendirebilecek fonksiyonel özelliklere in vivo bir bakış açısı sağladığını göstermiştir5. Kütle sitometrik hücre döngüsü analizinin ikinci bir avantajı, hücre döngüsü durumu ile ilişkili olabilecek çok sayıda başka fonksiyonel belirteci ölçme yeteneğidir. Son zamanlarda yapılan çalışmalar, protein ve RNA sentezini, BRU ve rRNA6'ya karşı IdU ve metal etiketli antikorların kullanımı yoluyla hücre döngüsü durumu ile ilişkilendirebilmiştir. Bir farklılaşma sürekliliğinde çok sayıda popülasyonda hücre döngüsü durumunu ölçen bu tür yüksek parametrik analizler, mevcut akış sitometri teknolojisi ile neredeyse imkansız olacaktır. MCM'nin en büyük dezavantajı, floresan akış sitometrisinde kullanılanlarla karşılaştırılabilir DNA veya RNA lekelerinin olmamasıdır (örneğin, DAPI, Hoechst, Pyronin Y, vb.). Floresan boyalar, DNA ve RNA içeriğinin nispeten hassas ölçümlerini verebilir, ancak bu hassasiyet yalnızca nükleotid bazları arasındaki interkalasyon sırasında meydana gelen bu boyaların floresan özelliklerindeki değişiklikler nedeniyle mümkündür. MCM analizi bu nedenle DNA veya RNA içeriğini benzer hassasiyetle ölçemez. Bunun yerine, kütle sitometrik hücre döngüsü analizi, siklin B1, fosforile retinoblastoma proteini (pRb) ve fosforile Histon H3 (pHH3) gibi hücre döngüsü durumuyla ilgili proteinlerin ölçümlerine ve IdU'nun S-faz hücrelerine dahil edilmesinden iyot atomunun doğrudan ölçümüne dayanır. Bu iki ölçüm yaklaşımı, normal hücresel proliferasyon sırasında oldukça benzer sonuçlar verir, ancak hücre döngüsü ilerlemesi bozulduğunda potansiyel olarak uyumsuz olabilir.

Her hücre döngüsü fazındaki hücre sayısının ölçülmesi, normal hücre döngüsü gelişiminin yanı sıra kanserlerde ve immünolojik hastalıklarda yaygın olarak gözlenen hücre döngüsü bozulmasını anlamada önemlidir. MCM, metal etiketli antikorlar kullanarak hücre dışı ve hücre içi faktörlerin güvenilir ölçümünü sağlar; Bununla birlikte, iridyum bazlı DNA interkalatörü 2N ve 4N DNA arasında ayrım yapamadığı için S-fazının ölçümü sınırlıydı. Hücre döngüsü fazlarını tanımlamak için Behbehani, kütle sitometresinin aralığına giren ve S-faz3'teki hücrelerin doğrudan ölçülmesine izin veren 127 kütleli IdU'yu kullanan bir yöntem geliştirdi. Bu doğrudan ölçüm, ikincil antikorlara olan ihtiyacı veya asit veya DNaz gibi DNA denatüre edici ajanların kullanımını ortadan kaldırır. Hücre içi döngü belirteçleri ile birlikte, deneysel modellerde hücre döngüsü dağılımının yüksek çözünürlüğüne izin verir.

Bu protokol, hücre döngüsü ölçümlerini MCM için ortak akış sitometri protokollerinden uyarlar. Yöntemlerimiz, hücre döngüsü parametrelerini dahil etmek için uygun ve basit bir yol sağlar. İn vitro numunelerin IdU ile dahil edilmesi, 37 ° C'de sadece 10 ila 15 dakikalık inkübasyon gerektirir; bu, birkaç saatlik inkübasyon süreleri öneren çoğu BrdU boyama protokolünden daha kısadır 3,7. IdU ve BrdU dahil numuneler bir proteomik stabilizatör kullanılarak sabitlenebilir ve daha sonra -80 ° C'lik bir dondurucuda bir süre saklanabilir. Bu, çok sayıda IdU boyalı numunenin, numune kalitesinde bir azalma olmadan parti analizi için arşivlenmesini sağlar.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

1. IDU stoklarının hazırlanması

  1. DMSO'da 5-iodo-2'-deoksiüridin (IdU) 50 mM'lik bir konsantrasyona çözün. Steril filtre, 10-50 μL tüplere aliquot ve -80 ° C'de saklayın
  2. IdU'yu dondurucudan çıkarın ve oda sıcaklığında çözün. 1 mM'lik son konsantrasyonda çalışan bir çözelti oluşturmak için RPMI-1640'ta IdU'yu seyreltin. Pipet yukarı ve aşağı veya karıştırmak için vorteks.
    1. Tipik olarak, konsantre IdU'yu hücrelerin kültürlendiği ortama (örneğin DMEM, IMDM, vb.) seyreltin veya doğrudan periferik kan veya kemik iliği aspirat örneklerine eklemek için PBS'ye seyreltin. Bu ön seyreltme adımı, DMSO'nun ilgili hücrelerin sulu ortamı ile karıştırılmasını kolaylaştırır.
      NOT: İnkübasyon sırasında nihai IdU konsantrasyonu 10 μM olmalıdır; 1 mM'lik bir çözelti, her 1 mL ortama 10 μL oranında eklenebilir.

2. IDU inkübasyonu ve numune koruma

  1. Numuneleri nemlendirilmiş 37 °C inkübatörde saklayın. Numuneyi inkübatörden çıkarın ve numuneyi bir biyogüvenlik başlığına taşıyın.
  2. Her 1 mL numuneye 10 μL 1 mM IdU ekleyin.
    1. 6 delikli bir plaka için, her bir kuyucuktaki 3 mL kültür ortamına 30 μL 1 mM IdU ekleyin. IdU, kemik iliği aspiratlarında ve murin çalışmalarında doğrudan kullanılabilir4.
  3. Numuneyi 10-15 dakika boyunca 37 ° C'de inkübatöre geri yerleştirin. S-fazının en doğru ölçümünü elde etmek için hücreleri IdU maruziyeti sırasında ilgilenilen optimum büyüme koşulları altında tutun.
  4. IdU inkübasyonundan sonra, numuneyi çıkarın ve konik bir tüpe aktarın.
  5. Numuneyi oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 400 x g'de döndürün.
  6. Süpernatantı aspire edin ve 200 μL PBS'de yeniden askıya alın.
    1. Gerekirse, fiksasyon ve donmadan önce ölü hücreleri işaretlemek için bu adımda canlı / ölü bir leke (cisplatin kullanarak) uygulayın.
      NOT: Rodyum canlı/ölü boyama, metanol geçirgenliğinden sonra iyi performans göstermez, bu nedenle hücre döngüsü analizlerinde kullanılması önerilmez.
  7. %1,5 PFA'lık nihai konsantrasyon için PBS'ye 18,75 μL% 16 paraformaldehit (PFA) ekleyin. Oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin. Numuneyi oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 400 x g'de döndürün.
  8. PBS/PFA çözeltisini aspire edin ve numuneyi dondurmadan önce 500 μL Hücre Boyama Ortamında (CSM; %0,5 BSA ve %0,02 sodyum azid içeren 1x PBS) + %10 DMSO'da yeniden askıya alın.
    1. Ticari Proteomik Stabilizatör kullanıyorsanız, 200 μL PBS'de (1:1.4) yeniden askıya alınan numuneye 280 μL Proteomik Stabilizatör ekleyin. Numuneleri oda sıcaklığında 10 dakika boyunca inkübe edin ve ardından doğrudan -80 ° C'ye yerleştirin.
      NOT: IdU'nun 37 ° C'de 10-15 dakikalık inkübasyonda etkili bir şekilde birleştiği gösterilmiştir. 10-15 dakikadan daha uzun süren IdU inkübasyonları, Id etiketli hücreler S fazından ayrılıp G2 veya M fazına ilerledikçe, S ve G2 fazı popülasyonlarının çözünürlüğünü kademeli olarak azaltacaktır. Ayrıca IdU ile uzun süreli inkübasyonun hücre ölümüne ve hücre döngüsü artefaktlarına neden olabileceğini gözlemledik. IdU dahil edilmesini takiben sonraki hücre işleme ve antikor boyaması, S-faz hücrelerine dahil edilmemiş artık IdU'yu temizlemek için yeterlidir. Burada açıklanan in vitro protokolü kullanırken önemli İyot arka planı gözlemlemedik; Bununla birlikte, klinik örneklerde iyot kontaminasyonunu çok nadiren gözlemledik. Bu, BT taramasındaki iyot kontrastı gibi tıbbi prosedürlerden veya iyot içeren ilaçlardan kaynaklanabilir. Büyük miktarda IdU arka planı gözlenirse, kütle sitometresinin dedektörüne zarar vermemek için numune çalıştırılmamalıdır.

3. Kütle sitometrisi için boyama numuneleri

  1. Numuneleri -80 °C'den çıkarın ve yüzey lekelenmesinden önce çözülmeye bırakın.
    1. SmartTube sabitleme yöntemini kullanıyorsanız, numuneler ısınırken ek fiksasyonu önlemek için numuneleri 0-4 ° C'de çözün.
  2. Numuneler çözüldükten sonra, yaklaşık 1-2 milyon hücreyi 5 mL'lik bir FACS tüpüne aktarın.
  3. FACS tüpünü 5 dakika boyunca 600 x g'de santrifüj edin ve hücreleri yıkamak için FACS tüpünü hücre boyama maddesi (CSM) ile doldurun. Bir kez daha tekrarlayın.
    1. Hücrelerin birbirine yapıştığı biliniyorsa, hücreden hücreye teması önlemek için CSM yıkamalarına 400 U / mL heparin ekleyin, ancak bu kesinlikle gerekli değildir.
  4. Hücreleri, oda sıcaklığında 10 dakika boyunca FC-bloke edici ajan, 100 μL hücre başına 5 μL ajan ile inkübe edin.
  5. Hücrelerin yüzeyini veya hücre dışı kısmını lekeleyecek bir antikor karışımı hazırlayın. Toplam boyama karışımı, her testte 1-2 milyon hücre başına 100 μL olacaktır. Boyama karışımı kokteyl ve FACS tüpünde CSM ve heparin ile buna göre dengelenecektir.
    NOT: Bu adımda CSM'nin eklenmesi, spesifik olmayan boyama yapılarını da azaltacaktır8. Bu boyama karışımı tamamen ilgilenilen hedeflere ve yüzey fenotipine bağlıdır (örneğin, T-hücrelerini içeren bir çalışma, CD45, CD3, CD4, CD8, vb. yüzey karışımını kullanacaktır). Numune işleme ve boyama ile ilgili ayrıntılı bir protokol Behbehani ve McCarthy ve ark.9,10'da bulunabilir.
  6. Yüzey boyama karışımını hücrelere ekleyin ve oda sıcaklığında 30-60 dakika boyunca sürekli çalkalayarak inkübe edin.
  7. Boyama işleminden sonra, FACS tüpünü CSM ile doldurun ve 5 dakika boyunca 600 x g'de döndürün.
  8. CSM ile iki kez daha yıkayın, numuneyi 5 dakika boyunca 600 x g'de döndürün ve her CSM yıkamasını aspire edin.
  9. %10 CSM ve %1.5 PFA ile 1 mL PBS ekleyerek hücre dışı antikorları sabitleyin.
  10. PBS/CSM/PFA karışımını içeren FACS tüpünü CSM ile doldurun. 5 dakika boyunca 600 x g'de aşağı doğru döndürün ve süpernatanı aspire edin.
  11. -20 °C'de metanol ekleyin.
  12. Tek bir hücre süspansiyonu elde etmek ve tüm hücre kümelerinin yeniden askıya alındığını doğrulamak için numuneyi 1-2 dakika boyunca vorteks edin.
  13. Numune yavaşça vorteks yaparken, filtre ucu olan 1.000 μL'lik bir pipet kullanarak hızla 1 mL buz gibi soğuk metanol ekleyin.
  14. FACs tüpünü ışığa kadar tutun ve görünür kümeler olmadığından emin olun; bulutluluk bekleniyor. Herhangi bir kümelenme, numuneyi sonraki MCM analizi için kullanılamaz hale getirecektir.
  15. Numuneyi -20 °C'de 10-20 dakika saklayın.
  16. Bu süre zarfında hücre içi boyama karışımını hazırlayın. Hücre içi boyama karışımı, ilgilenilen hedeflere bağlı olacaktır. Hücre döngüsü analizi için, bu boyama karışımına CyclinB1, pRb, Ki67 ve pHH3 ekleyin, ancak gerektiğinde diğer hücre içi belirteçler eklenebilir.
  17. -20 ° C'de 10-20 dakika sonra, numuneyi çıkarın, 1,5 mL PBS ekleyin ve geri kalanını CSM ile doldurun.
  18. Numuneyi 600 x g'yi 5 dakika boyunca santrifüj edin ve süpernatanı aspire edin.
  19. CSM ile iki kez daha yıkayın, numuneyi 5 dakika boyunca 600 x g'de döndürün ve her seferinde süpernatantı aspire edin.
  20. Son CSM yıkamasından sonra, numuneyi santrifüj edin ve yaklaşık 50 μL'lik bir kalıntı hacmi bırakın.
  21. Hazırlanan antikor karışımını numuneye ekleyin (tipik olarak 100 μL'lik son boyama hacmine ulaşmak için 50 μL antikor boyama kokteyli ekleyin) ve oda sıcaklığında 30 ila 60 dakika boyunca çalkalayan bir platformda inkübe edin.
  22. Boyama işleminden sonra CSM ekleyin ve 5 dakika boyunca 600 x g'de santrifüj yapın.
  23. CSM'yi aspire edin, CSM ile tekrar yıkayın, 5 dakika boyunca 600 x g'de döndürün, CSM'yi aspire edin, ardından PBS ekleyin.
  24. Hücre içi boyamanın tamamlanmasından sonra, hücreleri, antikorları hücrelere sabitleyen ve tanımlamayı sağlamak için her hücrenin DNA'sını boyayan bir interkalatör çözeltisine yerleştirin. İnterkalatör çözeltisi, üreticinin stok çözeltisinden 500 μM'lik bir konsantrasyonda eklenen izotopik olmayan saf iridyum interkalatör (pentametilsiklopentadienil-Ir (III)-dipiridofenazin) içerir. İridyum interkalatör çözeltisini, eşit şekilde boyamak ve aşırı lekelenmeyi önlemek için milyon hücre başına 100-200 μL'de ekleyin.
    NOT: Bu interkalartör çözeltisindeki iridyum, singlet gating için hücreleri tanımlamayı amaçlamaktadır, canlı / ölü lekeler için kullanılmamalıdır. Canlı / ölü lekeler isteniyorsa, yukarıda ve McCarthy ve ark.9'da belirtildiği gibi fiksasyondan önce yapılması gerekir.
  25. Numuneleri, CyTOF'ta numune almadan önce iki haftaya kadar interkalatör çözeltisinde 4 °C'lik bir buzdolabında saklayın.

4. Kütle sitometresinin çalışması

NOT: Kütle sitometrisi işlemi makineye özgü olabilir. İşlemden önce CyTOF kullanım kılavuzunu kontrol etmeniz her zaman tavsiye edilir. Ek olarak, şu anda makine çalıştırma ve bakım 9,11 ile ilgili iki JoVE makalesi bulunmaktadır.

  1. Kütle sitometresini çalıştırmadan önce nebülizörü herhangi bir tıkanıklık, çatlak ve diğer düzensizlikler açısından kontrol edin.
  2. Nebülizörü sitometreye bağlayın ve ısınma prosedürüne başlayın. Nebülizör yerinde olmadan kitle sitometresini başlatmayın.
  3. Kütle sitometresi ısınmayı bitirdikten sonra numune hatlarından su akıtın. Ayar veya numune analizi yapmadan önce püskürtme odasının yaklaşık 200 ° C'ye ulaşması gerekir.
  4. 5-10 dakika su akıtın. 5-10 dakika sonra, ayarlama çözümünü yükleyin ve ayarlama yöneticisini seçin. Ayarlama çözeltisi, sabit konsantrasyonlarda metal içeren ve numune alımından önce kütle sitometresini optimize etmek için kullanılan bir çözeltidir
  5. Ayarlama yöneticisinde, otomatik ayarlama işlemine başlamak için ayarlama çözümü kararlı bir durum isabet kaydına ulaştığında Önizleme'yi seçin.
  6. Ayarlama tamamlandıktan sonra numune alma cihazına su yükleyin ve numune işleme sırasında suyun numune hatlarından geçmesine izin verin. Günlük sitometre çalışması ve ayarlanması için ayrıntılı protokol Leipold11'de bulunabilir.
  7. Bazen, otomatik ayar optimum makine performansına ayarlanmaz. Bunu düzeltmek için ayarlama prosedürünü tekrarlayın.
  8. Numuneyi almadan önce numuneyi CSM ile bir kez ve saf deiyonize suyla iki kez yıkayın. Artık tuzu PBS/CSM'den uzaklaştırmak için suyla yıkamak önemlidir.
  9. Üretici tarafından sağlanan denge boncuklarını, bilinen metal konsantrasyonlarıyla yüklü polistiren boncukları kullanarak hassasiyeti ve numune akışını kontrol edin.
  10. Alma modunu ayarlamadan olay yakalama moduna değiştirin. Edinimi durdurmak için zaman sınırını 120 sn'de ayarlayın. Kaydet'i seçmeden önce 45 saniye bekleyin.
  11. Kütle sitometresi 120 saniye sonra numune alımını otomatik olarak durduracaktır. Eu151 ve Eu153 yoğunluğunu kontrol etmek için yağmur grafiği görüntüleyiciyi kullanın.
  12. Denge boncuklarını saf deiyonize suda 1:20 oranında seyreltin.
  13. Örnek almadan önce deneme yöneticisini kontrol edin. Kanallara adlar atamak ve kaydedilecek kanalları eklemek için deneme yöneticisini kullanın.
    1. IdU kullanıyorsanız 127-I kanalının eklendiğinden emin olun.
    2. Numune alımından önce gerekli parametreleri (örneğin, IdU) ölçmek için kütle sitometresini ayarlamanın gerekli olduğunu unutmayın. Kanallar önceden seçilmezse, seçilmemiş herhangi bir kanaldan veri toplanmaz ve kurtarılamaz.
  14. 1:20 saf deiyonize su ve denge boncuk karışımını kullanarak hücreleri yaklaşık 1-2 x 106 / mL'lik bir konsantrasyona seyreltin. Artık kümeleri çıkarmak için hücreleri filtre tepeli FACS tüpünden geçirin.
  15. Numuneyi yükleyin ve edinme süresini değiştirin.
  16. Önizleme tuşuna basın ve saniyedeki olay sayısının dengelenmesini bekleyin.
    1. Olayları saniyede 400'den fazla olay çalıştırmayın, bu önemli miktarda çifte ve döküntüye yol açacaktır. Genellikle en az 20.000 ila 50.000 hücre olayı toplarız, ancak optimum sayı deneysel tasarıma bağlı olacaktır. 2 milyona kadar hücrenin boyanması tipik olarak 300.000 ila 400.000 hücre olayı verecektir. Tüm olayların hücre olmayacağını unutmayın (olay sayısına dahil edilen enkaz ve boncuk olayları olacaktır).
  17. Numune alımı tamamlandıktan sonra bir yıkama çözeltisi yükleyin, numune indüksiyonunu başlatın ve 5-10 dakika çalıştırın. 5-10 dakika sonra numune indüksiyonunu durdurun ve 10-20 dakika boyunca su akıtın. Yıkama çözeltisi, artık metali numune hatlarından çıkarmak için tasarlanmış zayıf bir hidroflorik asit çözeltisidir.
  18. Kütle sitometresini kapatın ve nebülizörü çıkarın. Nebülizatör sıcak olacak, kullanım sırasında dikkatli olun.

5. Veri analizi

  1. Boncukları çıkarmak ve ayrıca numune alımı sırasında sinyal sapmasını düzeltmek için, FCS dosyalarını Fluidigm yazılımını veya Finck12 tarafından geliştirilen uygulamayı kullanarak normalleştirin.
  2. FCS'yi Cytobank'a veya başka bir akış sitometri analiz yazılımına yükleyin. FCS dosyaları herhangi bir uyumlu yazılımda kullanılabilir, bu protokolün amaçları için tüm geçit ve daha fazla analiz Cytobank13'te yapılmıştır.
  3. Hücre döngüsü kapıları çizilmeden önce, aşağı akış analizinden herhangi bir çift veya hücre enkazını hariç tutun, bu, Olay Uzunluğu vs 191-Ir'nin çift eksenli grafiği kullanılarak yapılabilir (Şekil 1a). Hücreler, çiftleri ve kalıntıları dışlamak için kullanılabilecek farklı, parlak bir popülasyon oluşturacaktır. Bu singlet kapısıdır. Bu geçit yöntemi tipik olarak çift hücre olaylarının yaklaşık% 50-60'ını ortadan kaldırır, bu nedenle kalan çift hücre olaylarını kaldırmak için ek stratejiler gerekebilir.
    1. Tekli geçişe yardımcı olmak için hücrelerin daha belirgin görünmesini sağlamak için olay uzunluğu ölçeğini (minimum ve maksimum) değiştirin.
    2. Gauss parametrelerini, Artık ve Ofseti kullanarak çiftleri ve kalıntıları daha da kaldırın. Daha düşük Ofsetli daha yüksek bir Kalıntı da enkaz ve çiftlerdir ve bu popülasyonun etrafındaki geçit çiftleri ve kalıntıları daha da kaldırabilir (Şekil 1b,c).
  4. S-faz geçidi – S-fazı, çizilmesi en kolay kapıdır, ancak aynı zamanda en önemlisidir. Bu kapıyı IdU vs pRb, Ki67 veya cyclinB1'in iki eksenli bir grafiğini kullanarak çizin. S-fazı IdU+ hücreleri, bu iki eksenli grafiklere bakıldığında ayrı bir popülasyon oluşturacaktır (Şekil 2b).
  5. G0 / G1 fazı, G2 / M faz geçidi - IdU vs CyclinB1 grafiğinde G0 / G1 ve G2 / M faz kapılarını kurun ve IdU birleştirme kullanımı, G0 / G1 ve G2 / M faz kapıları arasındaki sınırı belirlemek için çok önemlidir. G0 / G1 fazı CyclinB1düşük / IdU - ve G2 / M fazı CyclinB1yüksek / IdU- olacaktır. İyi CyclinB1 boyaması, G0-G1 ve G2-M popülasyonları arasında doğal bir popülasyon gösterecektir; Bununla birlikte, bu, deneysel koşullar altında numune ve hücre tipleri arasında değişecektir. Hücre döngüsü dağılımının etkilenebileceği ve CyclinB1, G0 / G1 fazı ve G2 / M fazı arasında daha az ayrım olduğu deneysel koşullarda, S fazını kullanmak, her spesifik deneyde belirli hücre tipleri için tutarlı bir geçit sağlayacaktır. Bu yöntem aşağıda detaylandırılmıştır.
    1. G0/G1 fazı ile G2/M fazı arasındaki ayrımı belirlemeye yardımcı olmak için yalnızca CyclinB1 ve IdU üzerindeki S-fazı hücrelerini çizin. CyclinB1yüksek popülasyonuna bir kapı çizin ve S-fazı popülasyonunun yaklaşık %5'i kapının içinde olana kadar ayarlayın (Şekil 2c). Bu, G0/G1 ve G2/M faz kapıları arasındaki kesme noktasını belirler (Şekil 2e,f). Aktif popülasyon ilgilenilen nüfusa değiştirilecek ve önceki kapının içinde ikamet eden kısım G2 / M fazı popülasyonu olurken, geri kalanı G0 / G1 fazı popülasyonu olacaktır.
  6. G0 fazlı geçit – pRb vs IdU grafiğinde G0 fazını kurun. G0 fazı bir pRbdüşük/IdU- popülasyonu ile temsil edilecektir. Aktif bisiklet popülasyonu, pRb ve IdU birleşmesinin yüksek ifadesine sahip olacaktır, G0 fazlı kapı, tipik olarak iki ayrı popülasyonda ifade edildiği gibi bu sınıra çizilebilir (Şekil 2g, i).
    1. Daha önce çizilen S-fazı popülasyonunu (Şekil 2b) aktif popülasyon yaparak ve pRbyüksek popülasyonunun en üst% 90-100'ünü içeren bir kapı çizerek G0 fazını tanımlayın. Bu, pRb + bisiklet popülasyonudur (Şekil 2i), bu kapının dışındaki pRbdüşük popülasyonu G0 popülasyonudur (Şekil 2j).
    2. pRb kullanılamıyorsa veya kaydedilemiyorsa, G0 fazı popülasyonunu oluşturmak için Ki67 vs IdU'yu kullanın. S-fazı popülasyonunun çoğunluğunu temsil eden bir kapı çizmek ve bu kapıyı Ki67 vs IdU için sınır olarak kullanmak, nüfusun geri kalanı G0 fazı olacaktır (Şekil 3a).
  7. M-faz geçidi – IdU vs pH3 çift eksenli grafiğinde M-fazını oluşturun. M-fazı, hücrelerin çok küçük bir kısmını temsil eder ve pH3yüksek popülasyonu üzerinde geçitlidir (Şekil 2d).
  8. IdU birleştirme başarısız oldu veya mümkün değildi – IdU kullanılamıyorsa, Ki67 ve pRb kullanarak döngü kesirlerini değil, hücre döngüsünü tanımlayın. Ki67 ve pRb, normal koşullarda, Ki67 yüksek / pRbyüksek ve Ki67 düşük / pRbdüşük olmak üzere iki ayrı popülasyon oluşturur. Çift pozitif popülasyon, G1 fazı, S fazı, G2 fazı ve M fazı ile ilişkili aktif döngü popülasyonunu temsil eder. Çift düşük popülasyon, G0 fazı ile ilişkili olarak bisiklete binmeyen popülasyonu temsil eder (Şekil 3b).
    NOT: Ki67 vs pRb kullanarak her bir fazı tanımlamak mümkün değildir, ancak göreceli döngü / bisiklet popülasyonları üzerindeki deneysel etkiler belirlenebilir.
  9. Hücre döngüsü analizi – Kapılar kurulduktan sonra, daha fazla analiz için sayısal değerleri kapılardan dışa aktarın. Her döngüdeki yüzdeler, tek popülasyonların birleşik popülasyonlardan çıkarılmasıyla elde edilebilir. pRb düşük IdU düşük, kapı yüzdesi üzerine çizilen G0 fazı, G1 faz yüzdesini bulmak için CyclinB1düşükIdUneg üzerine çizilen G0 / G1 fazındançıkarılabilir. Benzer şekilde, G2 faz yüzdesi, M faz kapısının G2 / M faz kapısından çıkarılmasından elde edilir. Bu, her bir hücre döngüsü aşaması için sayısal değerler üretecektir; G0, G1, S, G2 ve M. Her bir hücre döngüsü aşaması için üretilen sayısal değerler, grafik oluşturma ve istatistiksel analiz gibi daha ileri analizler için kullanılabilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

HL-60 hücreleri ve bir insan kemik iliği aspiratı kullanarak, deneysel koşulların hücre döngüsü dağılımını ve analizini nasıl etkileyebileceğini göstermek mümkündür. İlk olarak, hücre döngüsü fazlarının nasıl türetildiğini göstermek için geçit stratejisi oluşturulmalıdır. Şekil 1'de, hücresel enkaz ve çiftlerin ayrılmasında önemli olan singlet kapısının kurulmasını, tek bir hücre popülasyonunun oluşturulmasını gösteriyoruz. Hücre çizgileri için singlet kapısı, hücre döngüsü analizine geçmek ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Burada sunulan örnekler, hücre döngüsü dağılımını analiz etmek için bir MCM platformunun nasıl kullanılacağını göstermektedir. Ayrıca, hücre döngüsü analizinin zaman ve sıcaklık gibi deneysel koşullara duyarlı olduğu gösterilmiştir; bu, araştırmacıların hücre döngüsü analizleri için MCM'yi düşünürken göz önünde bulundurmaları gereken önemli bir husustur14. Bir saatten fazla olmamak üzere kısa bir süre için depoda bırakılan örnekler, normal durumlarıyla karşılaştırılabilir IdU katılımına sahip olac...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Dr. Behbehani, Fluidigm'den seyahat desteği alıyor. Fluidigm ayrıca laboratuvar kullanımı için reaktifler ve malzemeler satın aldı.

Teşekkürler

Yazarlar, deneysel destekleri için Palak Sekhri, Hussam Alkhalaileh, Hsiaochi Chang ve Justin Lyeberger'in çabalarına teşekkür eder. Bu çalışma Pelotonia Burs Programı tarafından desteklenmiştir. Bu materyalde ifade edilen herhangi bir görüş, bulgu ve sonuç, yazar(lar)a aittir ve Pelotonia Burs Programı'nınkileri yansıtmak zorunda değildir."

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Sığır Serum Albümini (BSA)SigmaA3059CSM
SantrifüjBileşeni Thermo Scientific75-217-420Örnek santrifüjleme
Cleaved-PARP (D214)BD BiosciencesF21-852Apoptotik hücrelerin tanımlanması
Cyclin B1BD BiosciencesGNS-1G2 Çözünürlük
Dimetilsülfoksit (DMSO)SigmaD2650Kriyokoruyucu
EQ Dört Elemanlı Kalibrasyon BoncuklarıFluidigm201078CyTOF performansı için dahili metal standardı
FACS Tüp, ağ süzgeciile Corning08-771-23CyTOF çalıştırmadan önce kümeleri/kalıntıları çıkarmak için hücre süzgeci
Fetal Sığır Serumu (FBS)VWR97068-085Hücre kültürü büyüme takviyesi
HeliosFluidigmCyTOF Sistemi/Platformu
HeparinSigmaH3393Spesifik olmayan lekelenmeyi önlemek için boyama katkı maddesi
IdU (5-İyodo-2 & prim; -deoksiuridin)SigmaI7125S fazı
Ki-67eBiosciences'aSolA15G0 / G1
MaxPar Çoklu Etiket Kitinin OnayıFluidigm201300Metal etiketleme kiti, metalleri ekler antikorlara
Mikroplaka ÇalkalayıcıThermo Scientific88880023Boyama sırasında numunelerin karıştırılması
Paraformaldehit (PFA)Elektron Mikroskobu Hizmetleri15710Fiksatif
pentametilsiklopentadienil-Ir (III) -dipiridofenazinFluidigm201192CyTOF edinimi sırasında hücre tanımlama
p-H2AX (S139)MilliporeJBW301DNA hasarının tespiti
p-HH3 (S28)BiolegendHTA28M-faz Çözünürlük
Fosfat Tamponlu Tuzlu Tuz (PBS)Gibco14190-144Hücre kültürü için yıkama çözeltisi ve fiksatif çözeltinin bileşeni
p-Rb (S807/811)BD BiosciencesJ112906G0/G1 Çözünürlük
Proteomik StabilizatörSmartTube IncPROT1Örnek sabitleyici
RPMI 1640Gibco21870-076Hücre kültürü büyüme ortamı
Sodyum AzideAcros OrganiklerAC447810250CSM / Antikor tamponunun bileşeni, biyosit
, dahil olur

Kaynaklar

  1. Ornatsky, O., Baranov, V. I., Bandura, D. R., Tanner, S. D., Dick, J. Multiple cellular antigen detection by ICP-MS. Journal of Immunological Methods. 308 (1-2), 68-76 (2006).
  2. Ornatsky, O. I., et al. Study of cell antigens and intracellular DNA by identification of element-containing labels and metallointercalators using inductively coupled plasma mass spectrometry. Analytical Chemistry. 80 (7), 2539-2547 (2008).
  3. Behbehani, G. K., Bendall, S. C., Clutter, M. R., Fantl, W. J., Nolan, G. P. Single-cell mass cytometry adapted to measurements of the cell cycle. Cytometry A. 81 (7), 552-566 (2012).
  4. Raval, A., et al. Reversibility of Defective Hematopoiesis Caused by Telomere Shortening in Telomerase Knockout Mice. PLoS One. 10 (7), 0131722(2015).
  5. Behbehani, G. K., et al. Mass Cytometric Functional Profiling of Acute Myeloid Leukemia Defines Cell-Cycle and Immunophenotypic Properties That Correlate with Known Responses to Therapy. Cancer Discovery. 5 (9), 988-1003 (2015).
  6. Kimmey, S. C., Borges, L., Baskar, R., Bendall, S. C. Parallel analysis of tri-molecular biosynthesis with cell identity and function in single cells. Nature Communications. 10 (1), 1185(2019).
  7. Rabinovitch, P. S., Kubbies, M., Chen, Y. C., Schindler, D., Hoehn, H. BrdU-Hoechst flow cytometry: a unique tool for quantitative cell cycle analysis. Experimental Cell Research. 174 (2), 309-318 (1988).
  8. Rahman, A. H., Tordesillas, L., Berin, M. C. Heparin reduces nonspecific eosinophil staining artifacts in mass cytometry experiments. Cytometry A. 89 (6), 601-607 (2016).
  9. McCarthy, R. L., Duncan, A. D., Barton, M. C. Sample Preparation for Mass Cytometry Analysis. Journal of Visualized Experiments. (122), e54394(2017).
  10. Behbehani, G. K. Immunophenotyping by Mass Cytometry. Methods in Molecular Biology. 2032, 31-51 (2019).
  11. Leipold, M. D., Maecker, H. T. Mass cytometry: protocol for daily tuning and running cell samples on a CyTOF mass cytometer. Journal of Visualized Experiments. (69), e4398(2012).
  12. Finck, R., et al. Normalization of mass cytometry data with bead standards. Cytometry A. 83 (5), 483-494 (2013).
  13. Kotecha, N., Krutzik, P. O., Irish, J. M. Web-based analysis and publication of flow cytometry experiments. Current Protocols in Cytometry. , Chapter 10, Unit10 17(2010).
  14. Devine, R. D., Sekhri, P., Behbehani, G. K. Effect of storage time and temperature on cell cycle analysis by mass cytometry. Cytometry A. 93 (11), 1141-1149 (2018).
  15. Campos, L., et al. Expression of immunological markers on leukemic cells before and after cryopreservation and thawing. Cryobiology. 25 (1), 18-22 (1988).
  16. Kadic, E., Moniz, R. J., Huo, Y., Chi, A., Kariv, I. Effect of cryopreservation on delineation of immune cell subpopulations in tumor specimens as determinated by multiparametric single cell mass cytometry analysis. BMC Immunology. 18 (1), 6(2017).
  17. Shabihkhani, M., et al. The procurement, storage, and quality assurance of frozen blood and tissue biospecimens in pathology, biorepository, and biobank settings. Clinical Biochemistry. 47 (4-5), 258-266 (2014).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

H cre D ng s AnaliziIdU EtiketlemeSiklin B1Fosforile RbFosforile Histon H3Ak SitometrisiTek H cre AnaliziH cre Proliferasyonu
Bir Kütle Sitometri Platformunda Hücre Döngüsü Fazları Oluşturmak için Pirimidin Analogu, 5-İyodo-2′-Deoksiüridin (IdU) Hücre Döngüsü Belirteçleri ile Kullanımı
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.