Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Koroner Anjiyogenezin In Vitro Modeli

8K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/60558

⸱

10 Mart 2020

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biology, Ball State University, 2Department of Biology, Stanford University

Bu makalede

Özet

Koroner anjiyogenezin in vitro modelleri koroner anjiyogenezin hücresel ve moleküler mekanizmalarının keşfinde kullanılabilir. Sinüs venöz ve endkard dokularının in vitro eksplant kültürleri VEGF-A'ya yanıt olarak sağlam bir büyüme gösterir ve in vivo olarak coup-TFII ekspresyonunun benzer bir modelini gösterir.

Özet

Burada, koroner anjiyogenezi incelemek için in vitro kültür analizini tanımlıyoruz. Koroner damarlar kalp kasını besler ve klinik öneme sahiptir. Bu damarlarda kusurları ateroskleroz gibi ciddi sağlık riskleri temsil, hangi hastalarda miyokard enfarktüsü ve kalp yetmezliğine yol açabilir. Sonuç olarak, koroner arter hastalığı dünya çapında önde gelen ölüm nedenlerinden biridir. Klinik önemine rağmen, hasarlı koroner arterlerin nasıl yenilenecekkonusunda nispeten az ilerleme kaydedilmiştir. Bununla birlikte, koroner damar gelişiminin hücresel kökeni ve farklılaşma yollarının anlaşılmasında son zamanlarda ilerleme kaydedilmiştir. Araştırmacıların flüoresanslı ata hücrelerini etiketlemelerine, kaderlerini takip etmelerine ve in vivo'da ataları görselleştirmelerine olanak tanıyan araç ve teknolojilerin ortaya çıkışı, koroner damar gelişimini anlamada etkili olmuştur. In vivo çalışmalar değerlidir, ancak deneysel tasarımda hız, erişilebilirlik ve esneklik açısından sınırlamalar vardır. Alternatif olarak, koroner anjiyogenezin in vitro modelleri bu sınırlamaları aşabilir ve araştırmacıların önemli biyolojik soruları hız ve esneklikle sorgulamalarına olanak sağlar. Uygun in vitro model sistemlerinin eksikliği koroner damar büyümesinin hücresel ve moleküler mekanizmalarının anlaşılmasında ilerlemeyi engellemiş olabilir. Burada, sinüs venöz (SV) ve endokardyum (Endo), koroner damarların çoğu ortaya çıkan iki ata dokularından koroner damarlar büyümek için bir in vitro kültür sistemi açıklar. Ayrıca kültürlerin bilinen in vivo mekanizmaların bazılarını doğru bir şekilde özetlediğini de doğruladık. Örneğin, SV'den gelen kültürdeki anjiyojenik filizlerin in vivo gözlenene benzer COUP-TFII ifadesini etkisiz kizlediğini gösteriyoruz. Buna ek olarak, vivo'da iyi bilinen bir anjiyojenik faktör olan VEGF-A'nın hem SV hem de Endo kültürlerinden anjiyogenezi sağlam bir şekilde uyardığını gösteriyoruz. Koroner anjiyogenezi incelemek için topluca doğru bir in vitro kültür modeli tasarladık.

Giriş

Kalbin kan damarları genellikle koroner damarlar denir. Bu damarlar arterler oluşur, damarlar, ve kılcal damarlar. Geliştirme sırasında, yüksek dallı kılcal damarlar ilk kurulur, daha sonra koroner arterler ve damarlar içine remodel1,2,3,4,5. Bu ilk kılcal damarlar proepicardium bulunan endotel progenitor hücreleri inşa edilmiştir, sinüs venöz (SV), ve endokardiyum (Endo) dokular1,6,7,8. SV embriyonik kalbin giriş organı dır ve Endo kalp lümen iç astar olduğunu. SV ve Endo bulunan endotel progenitor hücreleri koroner vaskülatür çoğunluğu oluşturmak, proepikardiyum bunun nispeten küçük bir kısmına katkıda ise2. Koroner damarların kılcal ağ önceden varolan öncü hücrelerinden kalpte büyümek hangi süreci koroner anjiyogenez denir. Koroner arter hastalığı dünya çapında önde gelen ölüm nedenlerinden biridir ve henüz bu hastalık için etkili bir tedavi eksiktir. Koroner anjiyogenezin ayrıntılı hücresel ve moleküler mekanizmalarını anlamak, hasarlı koroner arterleri onarmak ve yenilemek için yeni ve etkili tedavilerin tasarımında yararlı olabilir.

Son zamanlarda, koroner damarların nasıl geliştiğine olan anlayışımızda bir dalgalanma kısmen yeni araçlar ve teknolojilerin geliştirilmesi ile sağlanmıştır. Özellikle, in vivo soy etiketleme ve gelişmiş görüntüleme teknolojileri koroner damarların hücresel kökenli ve farklılaşma yollarını ortaya çıkarmak için çok yararlı olmuştur9,10,11,12. Bu in vivo araçlarının avantajlarına rağmen, hız, esneklik ve erişilebilirlik açısından sınırlamalar vardır. Bu nedenle, sağlam in vitro model sistemleri yüksek iş lenme li bir şekilde koroner anjiyogenezin hücresel ve moleküler mekanizmalarını açıklığa kavuşturmak için in vivo sistemleri tamamlayabilir.

Burada koroner anjiyogenezin in vitro modelini tanımlıyoruz. Biz iki ata dokuları, SV ve Endo koroner damarlar büyümek için bir in vitro ekplant kültür sistemi geliştirdik. Bu model ile, in vitro doku eksplant kültürleri büyüme ortamı tarafından uyarıldığında koroner damar filizi büyümek olduğunu göstermektedir. Ayrıca, eksplant kültürleri vasküler endotelyal büyüme faktörü A (VEGF-A), son derece güçlü bir anjiyojenik protein tarafından uyarıldığında kontrol ile karşılaştırıldığında hızla büyür. Ayrıca, SV kültüründen anjiyojenik filizlerin venöz defarkyasyona (COUP-TFII ekspresyonu kaybı), vivo1'dekiSV anjiyogenezine benzer bir mekanizmaya maruz kaldığımız saptandı. Bu veriler, in vitro explant kültür sisteminin in vivo'da meydana gelen anjiyojenik olayları sadakatle yeniden ortaya attığını göstermektedir. Burada açıklanan anjiyogenezin in vitro modelleri, koroner anjiyogenezin hücresel ve moleküler mekanizmalarını yüksek iş ve erişilebilir bir şekilde araştırmak için idealdir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Bu protokoldeki tüm hayvanların kullanımı Ball State University Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) yönergelerine uymaktadır.

1. Fare Yetiştiricileri Kurulması ve Zamanlanmış Gebelikler için Vajinal Fişler Tespit

  1. Yabani tip erkek ve dişi fareler ile bir fare üreme kafesi kurmak. Üreme farelerinin yaşının 6-8 hafta arasında olduğundan emin olun. Üremeiçin bir çift (1 erkek ve 1 kadın) veya üçlü (1 erkek ve 2 kadın) ayarlayın.
  2. Ertesi sabah vajinal fiş olup yok. Vajinal açılış içine takarak derin bir fiş tespit etmek için açılı bir metal prob kullanın. Pozitif vajinal fişin sabahını embriyonik gün 0.5 (e0.5) olarak belirleyin.
    NOT: Vajinal fiş yüzeysel (kolayca görülebilir, bkz. Şekil 1)veya derin (kolayca görülemez) olabilir. Derin bir fişin varlığı probun tam olarak eklenmesini engellerken, bir fişin yokluğu direnç olmadan tam takılmaya olanak sağlar.
  3. Embriyolar hasat edilecekleri e11.5'e ulaşana kadar zamanlanmış gebeliği koruyun. Embriyo ları hasat etmeden önce gebeliği doğrulamak için dişi farelerin ağırlığını e7.5 ve e11.5 arasında kaydedin.
    NOT: Annenin kilosundaki günlük artış başarılı bir gebeliğe işaret ederken, kiloda herhangi bir değişiklik başarısız bir gebeliğe işaret eder.

2. Hamile Farelerden Embriyo Toplama

NOT: Başlamadan önce aşağıdaki ekipman ve reaktiflere sahip olduğunuzdan emin olun: CO2 ötenazi odası, %70 etanol, kağıt havlu, düzenli forseps, ince forseps, makas, 1x steril fosfat tamponlu salin (PBS), 10 cm steril Petri yemekleri, buzlu konteyner, delikli kaşık, diseksiyon stereomikroskop.

  1. Bir e11.5 hamile fareyi temiz bir CO2 ötenazi odasına yerleştirin. Farenin kaçmasını önlemek için odanın kapağını kapatın.
  2. Fare ötanazi odasında sabitledikten sonra CO2'yiaçın. IACUC önerileri başına CO2'nin akış hızını (yani dakikada %10-30 yer değiştirme) düzenlediğinden emin olun. Fare tamamen ötenazi olduktan sonra, ölümü sağlamak için servikal çıkığı gerçekleştirin.
  3. Sprey% 70 etanol ile fare. Forseps kullanarak karın üzerinde deri kaldırın, makas bir çift kullanarak küçük bir kesi yapmak ve yanal kesi uzatmak. Kesiyi diyaframa kadar anteriora kadar büyütün ve embriyoları içeren rahim boynuzunu ortaya çıkarın(Şekil 2).
  4. Embriyo dizisini (rahim boynuzu + embriyolar) rahmi kavrayarak ve serbest keserek çekin. Buz gibi steril 1x PBS embriyo dize yerleştirin.
  5. Rahim boynuzundaki embriyoları rahim boynuzundan, rahim kasını, sarısı kesesini ve amniyonu tek tek(Şekil 3A-F)stereomikroskop altında sökerek ayırın. Temizlenmiş embriyoları delikli bir kaşıkla buz üzerinde steril 1x PBS içeren petri kabına aktarın. Embriyoları soğuk tuttuğundan emin ol.

3. E11.5 Embriyolardan Kalpleri Yalıtan

NOT: Başlamadan önce, aşağıdaki ekipman ve reaktiflere sahip olduğunuzdan emin olun: düzenli forsepsler, ince forsepsler, 1x steril PBS, 10 cm steril Petri kabı, 6 cm steril Petri kabı, buzlu konteyner, delikli kaşık, diseksiyon stereomikroskop.

  1. Stereomikroskop altında buz gibi steril 1x PBS ile yeni bir Petri kabı kurun. Kalbi parçalamak için 2.5.
  2. Forceps kullanarak embriyo nun başını çıkarın. İlk olarak, bir eliyle forseps arasında baş sıkmak ve daha sonra kapalı forseps kullanarak diğer el ile kazıyarak baş kaldırmak(Şekil 4A-C).
  3. Başı çıkardıktan sonra, embriyoyu ventral tarafıyla tek eliyle karnında forsepslerle tutarak yönlendirin(Şekil 4D).
  4. Diğer taraftan, ilk ince forseps kullanarak diyafram biraz üzerinde göğüs küçük bir kesi yaparak embriyonun göğüs duvarını açın. Daha sonra, kapalı çerkesler takarak ve forceps açarak göğüs duvarı yırtılma tarafından çok dikkatli bir şekilde kesi büyütün. Kalbe zarar verebilir çok derin itme değil emin olun. Forceps yardımıyla, göğüs duvarı geniş göğüs boşluğunda kalp ve akciğerler ortaya çıkarmak için açık tutmak (Şekil 4E).
  5. İnce forceps kullanarak, kalbi hafifçe (90°) hareket ettirin ve dorsal aort/damarı ortaya çıkarın. Kalbin tabanındadorsal aort /ven yakalayarak kalbi/akciğerleri anteriora çekin(Şekil 4F-H).
    NOT: Kalbin dorsal tarafında bulunan SV,.
  6. Kan hücrelerini temizlemek için soğuk 1x PBS ile kalp / akciğerleri durular.
  7. Kalan embriyolardan kalp/akciğerleri çıkarmak için 3.1-3.6 adımlarını tekrarlayın. İzole edilmiş kalp/akciğerleri buzda tuttuğundan emin olun.

4. E11.5 Embriyonik Fare Kalplerinden SV ve Ventriküllerin İzine

  1. SV'leri ve tüm ventrikülleri izole etmek için Petri kabını 3.7. İnce forceps kullanarak akciğerlerin bağlı loblarını kökünden tektek sök.
  2. Onun dorsal tarafında kalp Orient ve SV yırtılma olmadan anteriorly SV çevreleyen atria ve bitişik doku kaldırın. Tabanında tutarak ve ince forseps kullanarak kazıyarak kalpten sol ve sağ atria çıkarın(Şekil 5B). Benzer bir teknikle SV'yi çevreleyen bitişik dokuyu çıkarın(Şekil 5C).
    NOT: Sağ atriyumun SV'ye bağlı olduğunu unutmayın, bu nedenle sadece atriyumu çıkarmaya dikkat edin.
  3. SV izole etmek için, ilk sırt tarafı yukarı bakan kalp yönlendirmek (SV sırt tarafında olduğu için) ve yavaşça forseps ile ventriküllerde kalp tutarak bu pozisyonda kalbi tutmak.
    NOT: SV kalbin dorsal tarafında atria arasında yatan bir embriyonik kalp bir giriş organıdır.
  4. SV'yi bağlı olduğu kalpten dikkatlice soyarak veya SV'yi ince çerkeslerle ekinin tabanında tutarak ve kapalı çişlerle kazıyarak çıkarın(Şekil 5D,E).
  5. İzole Edilmiş SV'yi steril transfer pipetiyle buz üzerinde buz gibi steril 1x PBS içeren yeni bir 6 cm Petri kabına aktarın ve Petri kabını SV olarak etiketlendirin.
  6. Tüm ventrikülleri izole etmek için, SV çıkarıldıktan sonra kalpten çıkış yolu (aort ve pulmoner gövde) çıkarın(Şekil 5F,G).
  7. Steril transfer pipeti kullanarak buz üzerinde steril 1x PBS içeren yeni bir 6 cm Petri kabına tüm ventrikülleri aktarın ve Petri kabını ventrikül olarak etiketlendirin. İzole SV ve ventrikülleri buzüzerinde tutun.
  8. Kalan kalplerden SV ve ventrikülleri izole etmek için 4.1-4.7 adımlarını tekrarlayın.

5. Ekler ve Ekstrasellüler Matris Kaplama ile Doku Kültürü Plakaları Kurma

NOT: Başlamadan önce, aşağıdaki ekipman ve reaktiflere sahip olduğunuzdan emin olun: ticari hücre dışı matris çözeltisi (ECM; örneğin, Matrigel), 8,0 μM polietilen tereftalat (PET) kültür ekler, 24 kuyu plakası, 37 °C, %5 CO2 kuluçka makinesi.

  1. ECM çözeltisinin buzüzerinde erimesine izin verin. Katılaşmayı önlemek için ECM çözeltisini buzüzerinde tutun.
  2. PET membran kültür kesici uçlarını (gözenek boyutu = 8,0 μm, filtrasyon alanı = 0,3 cm2, filtre çapı = 6,5 mm) doku dışı kültürün 24 kuyu plakasının kuyularına yerleştirin. Plakaları sırasıyla SV veya endokardiyal anjiyogenez tahlilleri için SV veya ventrikül olarak etiketlayın.
    NOT: Her iki kültürü aynı anda gerçekleştirirken uçları SV ve ventriküller için ayrı plakalar halinde ayarlayın. Tüm deneysel numuneler ve kontroller için yeterli kuyu lar kurduğunuzdan emin olun.
  3. ECM çözeltisi çözüldükten sonra, önceden soğutulmuş bazal ortamda (ebm-2 bazal ortamda ECM 1:2) yeterli hacimde (100 μL/insert x uç sayısı)hemen seyreltin.
    NOT: Örneğin, altı kesici uç varsa, toplam hacim 100 μL x 6 = 600 μL olacaktır.
  4. 100 μL taze seyreltilmiş ECM ile uçları doğrudan membranın üzerine ekleyerek katlandı. ECM'nin katılaşabilmesi için plakayı en az 30 dakika 37 °C'de kuluçkaya yatırın.
    NOT: Kontaminasyonu önlemek için laminar akış dokusu kültürü başlığı altında yapılmalıdır.

6. SVs ve Tüm Ventrikül Kültürleri

NOT: Başlamadan önce, aşağıdaki ekipman ve reaktifler olduğundan emin olun: 70% etanol, transfer pipet, stereomikroskop, forceps, laminar akış doku kültür başlık, mikrovasküler endotel hücre takviyesi kiti (Malzeme Tablosu), bazal orta, 1x steril PBS. Şekil 6, SV ve ventrikül kültürünün iş akışını göstermektedir.

  1. Buz üzerinde ek kiti içeriğini eritin. Sertifikalı bir laminar akış doku kültürü başlık altında bazal orta 500 mL içine ek kiti tüm içeriğini ekleyerek tam orta hazırlayın. Orta iyi karıştırın ve 50 mL aliquots içine dağıtın.
  2. Stereomikroskop tabanını ve çevresindeki çalışma alanını %70 etanol ile sterilize edin.
  3. 5.4. adımdan doku kültürü plakalarını alın. Bir transfer pipet iyardımıyla, eksersekleri kesici uç zarının üzerine dikkatlice 4.7 adıma aktarın. Stereomikroskop altında ve temiz çerseps yardımıyla, eklerin köşesine sıkışmadığından veya yan duvarlara bağlı kalmadığından emin olmak için eksekleri kesici uçların ortasına yerleştirin.
  4. Ekseler yerleştirilen ve ekler inorta edildikten sonra, kesici uçlardan ekstra PBS'leri dikkatlice çıkarın ve plakaların kapaklarını kapatın.
  5. Laminar akış dokusu kültür başlığı altında, uçların üzerine önceden ısıtılmış komple ortamın 100 μL'sini ekleyin ve 200°L'lik kısmı kuyulara ekleyerek hava-sıvı arabirimindeki ekskbitkileri kültüre sokarak, kesici uçtaki bazal yüzeyin orta ile temas halinde olduğunu , ama üst yüzeyi havaya maruz kalır.
    NOT: Farklı boyut uçları/kuyu plakaları kullanıyorsanız, hava-sıvı arabirimi elde etmek için ses seviyesini ayarladıktan emin olun.
  6. 24 kuyu plakasının kullanılmayan kuyularına 300 μL PBS ekleyin ve kapakla kaplayın. Plakayı 37 °C, %5 CO2 kuluçka makinesinde kuluçkaya yatırın ve kültürleri 5 gün boyunca büyütün.
  7. İlerleyen günlerde, eksplant kültürlerinin durumunu değerlendirmek için ters ışık mikroskobu altında kültürleri rutin olarak gözlemleyin. Eksplants kontraktil dayak sergilemek ve tüm ekstesyenler ECM ile gömülü membran ın altına bağlı olduğundan emin olun. Yüzen eksplants dikkat edin.
    NOT: Ekstremitelerin periyodik olarak daralması canlı olduklarını gösterir. Kayan eksponisler analizden çıkarılmalıdır.
  8. Kültür durumunu değerlendirdikten sonra kültür plakasını tekrar kuvöze koyun ve kültürü 5 güne kadar büyütmeye devam edin.

7. VEGF-A (Pozitif Kontrol) ile Kültürlerin Tedavisi

NOT: Başlamadan önce, aşağıdaki ekipman ve reaktifler olduğundan emin olun: laminar akış doku kültür başlık, 1x PBS, bazal orta + 1% fetal büyükbaş serum (FBS), bazal orta + VEGF-A, pipetler ve pipet ipuçları.

  1. Bazal orta + 1% FBS ve bazal orta + VEGF-A hazırlayın.
    1. Bazal orta + 1% FBS hazırlamak için, ilk kontrol kuyuları gerekli sayısını belirleyin. Örneğin, üç kontrol kuyusu varsa, 300 μL/well x 3 = 900 μL gereken toplam hacimdir. Bazal orta +% 1 FBS yapmak için bazal orta 891 μL içine FBS 9 μL ekleyin.
    2. Bazal orta + VEGF-A hazırlamak için öncelikle VEGF-A ortamına ihtiyaç duyan toplam kuyu sayısını belirleyin. Üç kuyu varsa, 300 μL/iyi x 3 = 900 μL toplam hacim dir ve 50 ng/iyi x 3 = 150 ng VEGF-A'dır. Bazal orta + VEGF-A yapmak için bazal orta 900 μL içine VEGF-A 150 ng ekleyin.
      NOT: Bu çözümü, her deneme için yeterli sayıda daha küçük aliquots sigortalamak için hesaplanandan daha büyük bir hacimde birleştirin.
  2. 2. gün, ortamı her iki odadan (ekler ve kuyular) çıkarın. Uçlara 100 μL ve kuyulara 200 μL ekleyerek 300 μL 1x PBS ile kültürleri yıkayın. Sıkıca plakaları birkaç kez girdap ve PBS kaldırın.
  3. Kültürleri 24 saat aç kalmak için 300 μL bazal ortam + %1 FBS (kesici uç içine 100 μL ve kuyulara 200°L) ekleyin.
  4. 3. gün, açlıktan sonra, kontrol kuyularına ve bazal ortama (50 ng/well) sırasıyla 300°L bazal orta + %1 FBS (kesici uç içine 100°L ve kuyulara 200°L) ekleyin.
  5. Tedaviden sonra, kuvözdeki kültürleri büyütmeye devam edin.

8. Fiksasyon ve İmmünBoyama

NOT: Başlamadan önce, aşağıdaki ekipman ve reaktiflere sahip olduğunuzdan emin olun: %4 paraformaldehit (PFA), 1x PBS, primer ve sekonder antikorlar, sarsıcı, PBS'de (PBT) %0.5 niyonik yüzey aktif madde.

  1. Culturing altıncı gününde, oda sıcaklığında 1x PBS (RT) ile orta ve yıkama kültürleri çıkarın.
    1. Kuyulara %4 PFA çözeltisi ve kesici uçlara 100°L ekleyerek kültürleri düzeltin. 4 °C'de 20 dk sallarken kültürleri düzeltin.
    2. 20 dk fiksasyondan sonra, duman kaputundaki kültürlerden PFA'yı çıkarın ve kuyulara 200 μL ve kesici uçlara 100°L ekleyerek kültürleri 1x PBS ile yıkayın.
    3. Tekrar yıkama 3x, 10 dk her, sallanan iken. Sonra immünboyama gerçekleştirmek için devam edin.
      NOT: Tüm yıkama adımları RT'deki bir tezgah üzerinde gerçekleştirilir.
  2. Bloklama çözeltisinde primer antikorları (anti-VE-Kadherin, anti-ERG 1/2/3) seyreltin (%5 eşek serumu, %0.5 PBT). 300 μL primer antikor çözeltisi (alt kuyularda 200 μL ve kesici uçlara 100°L) ekleyin. Sallanan sırasında 4 °C'de bir gecede primer antikorlarda kuluçka kültürleri.
    NOT: Anti-VE-Kadherin endotel hücre zarını etiketlemek için kullanılır ve anti-ERG 1/2/3 endotel hücrelerinin anjiyojen filizlerini görselleştirmek için endotel hücre çekirdeğini etiketlemek için kullanılır.
  3. Ertesi gün, yıkama ve% 0.5 PBT 10x kültür plakaları kaya, Her 10 dakika PBT değiştirerek.
  4. İkincil antikorları (eşek anti-sıçan Alexa Fluor 488 ve eşek anti-tavşan Alexa Fluor 555) engelleme çözeltisi seyreltin. Adım 8.2'deki gibi sekonder antikordan 300 μL ekleyin ve sallanan sırasında kültürleri bir gecede 4 °C'de kuluçkaya yatırın. Ertesi gün, ikincil antikorları 10x'i PBT'de yıkayın ve her 10 dakikada bir PBT'yi değiştirin.
    NOT: En az 10x yıkayın ama daha fazla yıkayın daha iyidir. Yıkıntılar tamamlandıktan sonra, kültürler slaytlara monte edilene kadar 1x PBS ile saklanabilir.

9. Kültürlerin Slaytlara Monte Edilmesi, Görüntüleme ve Analiz

NOT: Başlamadan önce, aşağıdaki ekipman ve reaktifler olduğundan emin olun: ince çiller, slaytlar, 4', 6-diamidino-2-fenilindole (DAPI), coverslips ve konfokal mikroskop ile montaj orta. Sekonder antikor boyama sonra, aşağıdaki adımları kullanarak görüntüleme için slaytlar üzerine kültürleri monte.

  1. İnce pratisyen ler kullanarak kesici uçtan membranı dikkatlice soyun ve membran tarafını aşağı koyup eksplant kültürlerini yukarı doğru yerleştirerek slaytlara aktarın. Çoğaltma örneklerini aynı slaytlara yerleştirin ve slaytları denetim veya VEGF-A olarak etiketleyin. DAPI ile birkaç damla montaj ortamını doğrudan membranın üzerine ekleyin ve slaytları kapak fişleri ile kapatın.
    NOT: Kapakları yerleştirirken hava kabarcıklarından kaçındıktan emin olun.
  2. Açık oje ile slaytların kenarlarını kapatın ve kurumasını bekleyin.
    NOT: Slaytlar uzun süreli depolama için -20 °C'de saklanabilir.
  3. Konfokal mikroskop kullanarak görüntü kaydırıyor.
  4. Anjiyojenik büyümenin uzunluğunu ölçmek için analiz yapın. Ventrikül kültürlerindeki ERG 1/2/3+ hücrelerinin iç sınırından ve SV kültürlerindeki SV ekbitkilerinin merkezinden genişletilmiş endotel hücrelerinin (Ve-Kadherin+/ERG 1/2/3+) uzaklıklarını ölçerek anjiyojenik büyüme uzunluğunu ölçün.
    1. FIJI/ImageJ kullanarak niceliklendirme gerçekleştirmek için önce FIJI yazılımLarını indirin.
    2. FIJI'de resim dosyalarını açın: Dosyaya git | Aç | Klasör | Dosya Adı | Aç.
    3. Analize Git | Ölçümleri Ayarla | Çevre'yi seçin.
    4. Ana pencereden Düz Çizgi aracını seçin.
    5. Adım 9.4'te önerildiği gibi bir filizin uzunluğu boyunca bir çizgi çizin.
    6. Analize Git | Ölçün.
      NOT: Uzunluk ölçümleri yeni pencerede görüntülenir.
    7. Rasgele seçilen en az üç görüş alanını temsil eden görüntülerde nicelik lendirme gerçekleştirin. Filiz uzunluğu ölçümlerini ortalaman ve ortalama ± standart sapma olarak bildirin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

In vivo SV anjiyogenezinin en çarpıcı özelliklerinden biri, belirli bir yolu izlemesi ve basmakalıp zamanlarda vekonumlardameydana gelen hücre defarklılaşması ve yeniden farklılaşma olaylarını izlemesidir 1 . İlk SV hücreleri kalp ventrikülüne doğru büyüdükçe COUP-TFII gibi venöz belirteçler üretmeyi bırakırlar (Şekil 7). Daha sonra, koroner filiz iki göç yolları almak, ya kalp yüzeyinde ya da miyokardinin derinliklerinde. Yüzey damarl...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

SV ve Endo ata dokularından başarılı bir şekilde büyüyen koroner damarlar için en kritik adımlardan bazıları şunlardır: 1) SV kültürü için SV dokusunun doğru tanımlanması ve izole edilmesi; 2) doğru Endo kültürü için e11−11.5 yaşları arasında embriyolardan ventriküller kullanarak; 3) diseksiyon süresi boyunca steril koşulları korumak ve dokuları her zaman soğuk tutmak; ve 4) ortamda yüzen doku önlemek için ECM kaplı membran bağlı eksplants tutmak.

İlk olarak, SV dokusunun izolasyon zor olabili...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan etmezler.

Teşekkürler

Yazarlar destekleyici bir araştırma ortamı sağlamak için Sharma laboratuvar üyelerine teşekkür ederiz. Fare kolonimizi koruyan ve önemseyen Diane (Dee) R. Hoffman'a özel teşekkürlerimizi sunmayı seviyoruz. Ayrıca Dr. Philip J. Smaldino ve Carolyn Vann'a el yazmasının iyice kanıtlanması ve yararlı yorumlar da sunulması için teşekkür ederiz. Bu çalışma Ball State Üniversitesi Provost Office ve Biyoloji Bölümü B.S, Indiana Academy of Sciences Senior Research Grant fonları B.S ve NIH (RO1-HL128503) ve New York Kök Hücre Vakfı fonlarından K.R.'ye kadar desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
100 x 20 MM Doku Kültürü KabıFisher Scientific877222Protokolde Petri kabı olarak anılır
24 oyuklu plakalarFisher Scientific08-772-51
8.0 uM PET membran kültürü ekleriMillipore SigmaMCEP24H48
Alexa Fluor Eşek tavşan karşıtı 555Fisher ScientificA31572İkincil antikor
Alexa Fluor Eşek anti-sıçan 488Fisher ScientificA21206İkincil antikor
Açılı Metal ProbGüzel bilim araçları10088-15Açılı 45 derece, derin tıkaçları tespit etmek için kullanılır
Anti-ERG 1/2/3 antikoruAbcamAb92513Birincil antikor
Anti-VE-Cadherin antikoruFisher ScientificBDB550548Birincil antikor, üretici BD BioSciences
CO2< / sub> gaz tankıÇeşitli tedarikçilerN / A
CO2< / sub> İnkübatörFisher Scientific1399822337 & deg için; C,% 5 CO2< / sub> inkübasyon
Diseksiyon stereomicrosopeLeicaS9iLeica S9i Stereomikroskop
EBM-2 bazal medyaLonzaCC-3156Endotel hücre büyümesi bazal medya
ECM çözümüCorning354230Ticari olarak Matrigel
EGM-2 MV Singlequots KitLonzaCC-4147olarak bilinirMikrovasküler endotel hücre takviyesi kiti; Bu, EGM-2'yi eksiksiz hale getirmek için EBM-2'ye karıştırılır
Fetal Sığır Serumu (FBS)Fisher ScientificSH3007003IR
FiJiNIHNAGörüntü işleme yazılımı (https://imagej.net/Fiji/Downloads)
İnce ForsepsGüzel bilim araçları11412-11Embriyo için kullanılır diseksiyon
Fisherbrand Düz Bıçaklı çalıştırma makasıFisher Scientific13-808-4
Hiklon Fosfat Tamponlu Tuzlu Su (1X)Fisher ScientificSH-302-5601LR
Laminer akış doku kültürü başlığıFisher Scientificçeşitli modeller mevcuttur
Orta VektörLaboratuvarlarıH-1200Vectashield DAPI ile
Paraformaldehit (PFA)Elektron Mikroskobu/Fisher50-980-494Bu %32'de mevcuttur; %4'e kadar seyreltilmesi gerekiyor
Delikli kaşıkGüzel bilim araçları10370-18Bir çözeltiden embriyo / dokuların çıkarılmasında faydalıdır
Rekombinant Murin VEGF-A 165PeproTech450-32
Standart forseps, Dumont #5Güzel bilim araçları11251-30
Sure-Seal Fare / Sıçan odasıEasysystemincEZ-1785Ötenazi odası
Montaj

Kaynaklar

  1. Red-Horse, K., et al. Coronary arteries form by developmental reprogramming of venous cells. Nature. 464 (7288), 549-553 (2010).
  2. Chen, H. I., et al. The sinus venosus contributes to coronary vasculature through VEGFC-stimulated angiogenesis. Development. 141 (23), 4500-4512 (2014).
  3. Volz, K. S., et al. Pericytes are progenitors for coronary artery smooth muscle. Elife. 4, (2015).
  4. Chen, H. I., et al. VEGF-C and aortic cardiomyocytes guide coronary artery stem development. Journal of Clinical Investigation. 124 (11), 4899-4914 (2014).
  5. Chang, A. H., et al. DACH1 stimulates shear stress-guided endothelial cell migration and coronary artery growth through the CXCL12-CXCR4 signaling axis. Genes and Development. , (2017).
  6. Tian, X., et al. Subepicardial endothelial cells invade the embryonic ventricle wall to form coronary arteries. Cell Research. 23 (9), 1075-1090 (2013).
  7. Wu, B., et al. Endocardial Cells Form the Coronary Arteries by Angiogenesis through Myocardial-Endocardial VEGF Signaling. Cell. 151 (5), 1083-1096 (2012).
  8. Katz, T. C., et al. Distinct compartments of the proepicardial organ give rise to coronary vascular endothelial cells. Developmental Cell. 22 (3), 639-650 (2012).
  9. Das, S., Red-Horse, K. Cellular plasticity in cardiovascular development and disease. Developmental Dynamics. 246 (4), 328-335 (2017).
  10. Sharma, B., Chang, A., Red-Horse, K. Coronary Artery Development: Progenitor Cells and Differentiation Pathways. Annual Review of Physiology. 79, 1-19 (2017).
  11. Tian, X., Pu, W. T., Zhou, B. Cellular origin and developmental program of coronary angiogenesis. Circulation Research. 116 (3), 515-530 (2015).
  12. Wu, B., et al. Endocardial cells form the coronary arteries by angiogenesis through myocardial-endocardial VEGF signaling. Cell. 151 (5), 1083-1096 (2012).
  13. Gerhardt, H., et al. VEGF guides angiogenic sprouting utilizing endothelial tip cell filopodia. Journal of Cell Biology. 161 (6), 1163-1177 (2003).
  14. Ruhrberg, C., et al. Spatially restricted patterning cues provided by heparin-binding VEGF-A control blood vessel branching morphogenesis. Genes and Development. 16 (20), 2684-2698 (2002).
  15. Kikuchi, R., et al. An antiangiogenic isoform of VEGF-A contributes to impaired vascularization in peripheral artery disease. Nature Medicine. 20 (12), 1464-1471 (2002).
  16. Folkman, J., et al. Isolation of a tumor factor responsible for angiogenesis. Journal of Experimental Medicine. 133 (2), 275-288 (1971).
  17. Ferrara, N. The role of VEGF in the regulation of physiological and pathological angiogenesis. Experientia Supplementum. (94), 209-231 (2005).
  18. Ferrara, N., Bunting, S. Vascular endothelial growth factor, a specific regulator of angiogenesis. Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 5 (1), 35-44 (1996).
  19. Sharma, B., et al. Alternative Progenitor Cells Compensate to Rebuild the Coronary Vasculature in Elabela- and Apj-Deficient Hearts. Developmental Cell. 42 (6), 655-666 (2017).
  20. Rhee, S., et al. Endothelial deletion of Ino80 disrupts coronary angiogenesis and causes congenital heart disease. Nature Communications. 9 (1), 368(2018).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Sinus VenosusEndokardVEGF A UygulamasKonfokal MikroskopiDoku K lt rEmbriyonik KalpProgenit r H crelerEkstrasel ler MatriksH cre K lt r
Koroner Anjiyogenezin In Vitro Modeli
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.