Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Sıçanlarda Kompleks Bölgesel Ağrı Sendromu Tip-I kronik Post-Iskemi Ağrı Modeli

7.3K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/60562

⸱

21 Ocak 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Neurobiology and Acupuncture Research, The Third Clinical Medical College, Zhejiang Chinese Medical University, Key Laboratory of Acupuncture and Neurology of Zhejiang Province, 2Academy of Chinese Medical Sciences, Zhejiang Chinese Medical University

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Burada verilen kronik post-iskemi ağrı (CPIP) bir hayvan modeli kurmak için adımları ayrıntıları bir protokoldür. Bu insan kompleks bölgesel ağrı sendromu tip-I taklit iyi tanınan bir modeldir. Mekanik ve termal hipersensitiviteler daha da değerlendirilir, ayrıca CPIP sıçan modelinde gözlenen kapsaisin kaynaklı nosifensif davranışlar.

Özet

Kompleks bölgesel ağrı sendromu tip-I (CRPS-I) hastalar arasında şiddetli ağrıya neden olan ve çözülmemiş bir tıbbi durum olmaya devam eden nörolojik bir hastalıktır. Ancak, CRPS-I'ın altında yatan mekanizmalar henüz açıklanmadı. İskemi/reperfüzyonun CRPS-I'a neden olan önde gelen faktörlerden biri olduğu bilinmektedir. Uzun süreli iskemi ve arka ekstremitenin reperfüzyonu ile CRPS-I'ı taklit etmek için sıçan kronik iskemi sonrası ağrı (CPIP) modeli oluşturulmuştur. CPIP modeli CRPS-I mekanizmaları incelemek için iyi tanınan bir hayvan modeli haline gelmiştir. Bu protokol, anestezi de dahil olmak üzere CPIP sıçan modelinin kurulmasında yer alan ayrıntılı prosedürleri açıklar, ardından arka ekstremitenin iskemi/reperfüzyonu. Sıçan CPIP modelinin özellikleri, arka ekstremitenin mekanik ve termal hipersensitivitelerinin yanı sıra akut kapsaisin enjeksiyonuna verilen nosifensive yanıtları ölçülerek daha da değerlendirilir. Sıçan CPIP modeli, arka ekstremite ödemi ve hiperemi de dahil olmak üzere, kuruluşundan sonra erken evrede, kalıcı termal ve mekanik hipersensitiviteler ve akut kapsaisin enjeksiyonuna karşı artan nosifensive yanıtları da dahil olmak üzere çeşitli CRPS-I benzeri belirtiler sergiler. Bu özellikler crps-I'de yer alan mekanizmaların daha fazla araştırılması için uygun bir hayvan modeli haline getirmelidir.

Giriş

Kompleks bölgesel ağrı sendromu (CRPS) kırıklar, travma, cerrahi, iskemi veya sinir yaralanması1,2,3kaynaklanan kompleks ve kronik ağrı belirtileri reprents . CRPS 2 alt kategoriye ayrılır: CRPS tip-I ve tip-II (CRPS-I ve CRPS-II)4. Epidemiyolojik çalışmalar CRPS prevalansının yaklaşık 1:20005olduğunu ortaya koymuştur. CrPS-I, belirgin bir sinir hasarı gösterir, kronik ağrıya neden olabilir ve önemli ölçüde hastaların yaşam kalitesini etkiler. Mevcut tedaviler yetersiz terapötik etkileri göstermektedir. Bu nedenle, CRPS-I hala ele alınması gereken önemli ve zorlu bir klinik sorun olmaya devam etmektedir.

CRPS-I'ı taklit eden klinik öncesi bir hayvan modelinin oluşturulması, CRPS-I'in altında yatan mekanizmaların araştırılması için çok önemlidir. Bu sorunu gidermek için, Coderre ve ark. CRPS-I6özetlemek için arka ekstremite için uzun süreli iskemi ve reperfüzyon uygulayarak bir sıçan modeli tasarladı. İskemi/reperfüzyon yaralanmasının CRPS-I7'ninbaşlıca nedenlerinden biri olduğu bilinmektedir. Sıçan CPIP modeli birçok CRPS-I-benzeri belirtiler sergiler, hangi model kurulması ndan sonra erken aşamada arka ekstremite ödemi ve hiperemi dahil, kalıcı termal ve mekanik hipersensitiviteler ile takip6. Bu modelin yardımıyla, merkezi ağrı sensitizasyonu, periferik TRPA1 kanal aktivasyonu ve reaktif oksijen türleri üretimi, vb CRPS-I8katkıdaönerilmektedir ,9,10. Biz son zamanlarda başarıyla CPIP sıçan modeli kurulan ve dorsal kök gangliyonu RNA-sıralama yapıldı (DRGs) etkilenen arka pençe innerve11. CRPS-I11'inağrı hipersensitivitelerine aracılık eden bazı potansiyel mekanizmalar keşfettik. Ayrıca DRG nöronlarında geçici reseptör potansiyeli vanilloid 1 (TRPV1) kanalını CRPS-I12'ninmekanik ve termal hipersensitivitelerine önemli bir katkıda bulunan olarak belirledik.

Bu çalışmada CPIP fare modelinin oluşturulmasında yer alan ayrıntılı prosedürler açıklanmıştır. Ayrıca, sıçan CPIP modelini mekanik ve termal hipersensitivitelerin yanı sıra akut kapsaisin sorununa karşı duyarlılığını ölçerek değerlendirdik. Biz sıçan CPIP modeli CRPS-I dahil mekanizmaların daha fazla soruşturma için güvenilir bir hayvan modeli olabileceğini öneriyoruz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Hayvan protokolleri Zhejiang Çin Tıp Üniversitesi Hayvan Etik Komitesi tarafından onaylandı.

1. Hayvanlar

  1. Şangay Laboratuvar Hayvan Merkezi'nden erkek Sprague-Dawley (SD) sıçan (280-320 g, 8-10 hafta) alın. Ev Zhejiang Çin Tıp Üniversitesi Laboratuvar Hayvan Merkezi'nde hayvanlar. Üreme koşullarının 12 saat/ 2h açık/koyu çevrimiçermesi ve sıcaklığı 24 °C'de sabit tutması gerektiğini unutmayın. Su ve gıda reklam libitumsağlayın. Bu çalışmada toplam 48 sıçan kullanıldığını unutmayın. Bir not, bu modelde, biz tüm süreç boyunca ağrı yanıtı gözlemlemek gerekir. Ağrı kesici uygulanırsa, o zaman başarıyla ağrı modeli kurmak değildir. Deneylerden sonra fareler kurban edilir.

2. CPIP model kurulumu

  1. Sodyum fenobarbital (50 mg/kg, intraperitoneal enjeksiyon [i.p.]) ile tüm sıçanları (sahte ve CPIP model grupları dahil) anestezik. Gerekirse 20 mg/kg/h fenobarbital [i.p.] ile anesteziyi koruyun. Her hayvanın reflekslerini, arka patisini veya kuyruk ucunu forceps kullanarak çimdikleyerek kontrol edin. Farelerin model kurulmadan önce tepki vermediğinden emin olun. İşlem sırasında kuruluk önlemek için gözlere veteriner merhem yerleştirin. Aşağıdaki işlem için 37 °C'de tutulan ısıtılmış bir ped üzerine anestezili sıçanları yerleştirin.
  2. Arka patinin iskemi ve reperfüzyonu
    1. Sıçan anestezi sonra gliserol ile sağ arka pençe ve ayak bileği yağlamak.
    2. 7/32" (5,5 mm) dahili çapı 1,5 mL Eppendorf borunun daha büyük tarafına (kullanmadan önce kopan kapakla) bir Nitril 70 Durometre O-halkası kaydırın. Dikkatle alt ulaşana kadar içi boş Eppendorf tüp içine arka pençe takın.
    3. Yavaş yavaş 3 saat için ayak bileği eklemi ve yer yakın sağ arka ekstremite için tüp O-halka kaydırın.
    4. Iskemi adımından sonra O-ring3 saat kesin. Sert recumbency korumak için yeterli bilinç iyileşene kadar dikkatle sıçan izleyin. Anestezi alan sıçan, tamamen iyileşene kadar diğer sıçanların şirketine geri yerleştirilmemelidir.

3. Nosifesif davranış testleri

  1. Bir örgü katta oturan şeffaf bir Pleksiglas odasına sıçan yerleştirin. Herhangi bir davranış testi nden önce fareyi 0,5 saat eve alışın.
  2. Mekanik allodynia
    1. Test için von Frey filamentlerini (0.4, 0.6, 1.0, 2.0, 4.0, 6.0, 8.0, 15.0 ve 26.0 g filamentleri) kullanın. Testi orta filamentten (4.0 g) başlatın. Filamentleri arka patinin orta plantar yüzeyine dikey olarak uygulayın. Filamenti 5 s'ye kadar bükmek için uygun kuvveti hafifçe uygulayın. Uyaranlara yanıt olarak arka pençe ani bir geri çekilme bir nosfensive davranış olarak kabul edilir. Mekanik allodynia testini -3, -2, -1 günlerinde ve 13.
    2. Eşiği test etmek için yukarı-aşağı test yöntemini uygulayın. % 50 pençe çekilme eşiği (PWT)13,14,15hesaplamak için Dixon yöntemiuygulayın.
  3. Termal hiperaljezi
    1. Termal hiperaljeziyi incelemek için Hargreaves'in yöntemini kullanın. Doğrudan pençe çekilmesi gecikme (PWL) ölçmek için arka pençe bir ampul (50 W) yayılan ışık Demeti hedefliyoruz. Isıtma aşırı yaralanmayı önlemek için kesme eşik olarak 20 s ayarlayın.
    2. Her arka pençe için 5 dakika aralıklarla her test 3x tekrarlayın. Her sıçan16PWL olarak bu üç testlerin ortalama alın. Termal hiperaljezi testini -3, -2, -1 günlerinde ve 13.
  4. Kapsaisin kaynaklı akut nositif davranış
    1. Dimethyl sulfoxide (DMSO) kullanarak kapsaisin stok çözeltisi (200 mM) hazırlayın ve arka pençe enjeksiyonu için steril fosfat tamponlu salin (PBS) içinde 1:1000'e kadar seyreltin. PBS'de son DMSO konsantrasyonu %0.1'dir (araç sadece PBS'de %0.1 DMSO içerir). 1 mL şırıngaya bağlı 30 G iğne kullanarak 50°L'lik bir hacimle arka patiye (intraplantar enjeksiyon) kapsaisin veya araç enjekte edin.
    2. Kayıt nocifensive davranış (yani, yalama, ısırma, yalama, yalama, yalama, yalama, yalama, yalama, yalama, yalama, ya da enjekte pençe flinching) enjeksiyon dan hemen sonra 10 dakika için bir video kamera kullanarak ve daha önce açıklandığı gibi bundan sonra ölçülen17,18,19.
  5. Hind pençe ödemi değerlendirmesi: Pati çapındaki artışı ölçerek arka pati ödemini değerlendirin. Dijital kaliper ile ölçün ve bazal değer ile farklı zaman noktalarında gözlenen test değeri arasındaki farkı hesaplayın. Model inå aatından sonra 15 dk, 24 h, 48 h ve 72 h olarak pati kısındaki deÄ iÅ iklikleri deÄ erlendirin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Ayak bileği üzerine O-halka yerleştirdikten sonra, ipsilateral arka pençe deri siyanoz gösterdi, doku hipoksi bir göstergesi (Şekil 1A). O-halkakestikten sonra, ipsilateral arka pençe kan ile doldurmaya başladı ve hiperemi yoğun bir işareti gösterdi sağlam şişlik gösterdi (Şekil 1A). Pati şişmesi yavaş yavaş azaldı ve iskemik / reperfüzyon prosedürü (Sidak post-hoc testi ile iki yönlü ANOVA, Şekil 1...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Bu protokol, sıçanların arka ekstremitelerine iskemi/reperfüzyon uygulayarak bir sıçan CPIP modeli oluşturmak için ayrıntılı yöntemleri açıklamaktadır. Kapsaisin enjeksiyonuna yanıt olarak arka ekstremite görünümü, ödem, mekanik/termal hipersensitiviteler ve akut nosifensif davranışların değerlendirilmesini içerir.

Ekstremite iskemi/reperfüzyonu insan hastalarında CRPS-I'ye katkıda bulunan yaygın bir faktördür12. Bu protokol, insan CRPS-I6özetlem...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar bu çalışmada çıkar çatışması beyan etmezler.

Teşekkürler

Bu proje Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (81873365 ve 81603676), Zhejiang İl Doğa Bilimleri Fonları Seçkin Genç Akademisyenler (LR17H270001) ve Zhejiang Çin Tıp Üniversitesi araştırma fonları ( Q2019J01, 2018ZY37, 2018ZY19).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
1.5 ml Eppendorf tüpüEppendorf22431021
DMSOSigma-AldrichD1435
KapsaisinAPEXBIOA3278
Dijital kumpasMeinaiteNA
O-ringO-Halkalar BatıNitril 70 Durometre7/32 inç
iç çap
Plantar Test CihazıUGO Basile, İtalya37370
von Frey filamentleriUGO Basile, İtalyaNC12775

Kaynaklar

  1. Goh, E. L., Chidambaram, S., Ma, D. Complex regional pain syndrome: a recent update. Burns, Trauma. 5 (1), 2(2017).
  2. Birklein, F., Ajit, S. K., Goebel, A., Rsgm, P., Sommer, C. Complex regional pain syndrome - phenotypic characteristics and potential biomarkers. Nature Reviews Neurology. 14 (5), (2018).
  3. Shim, H., Rose, J., Halle, S., Shekane, P. Complex regional pain syndrome: a narrative review for the practising clinician. British Journal of Anaesthesia. , (2019).
  4. Urits, I., Shen, A. H., Jones, M. R., Viswanath, O., Kaye, A. D. Complex Regional Pain Syndrome, Current Concepts and Treatment Options. Current Pain, Headache Reports. 22 (2), 10(2018).
  5. Helyes, Z., et al. Transfer of complex regional pain syndrome to mice via human autoantibodies is mediated by interleukin-1-induced mechanisms. Proceedings of National Academy Sciences of the United States of America. 116 (26), 13067-13076 (2019).
  6. Coderre, T. J., Xanthos, D. N., Francis, L., Bennett, G. J. Chronic post-ischemia pain (CPIP): a novel animal model of complex regional pain syndrome-Type I (CRPS-I; reflex sympathetic dystrophy) produced by prolonged hindpaw ischemia and reperfusion in the rat. Pain. 112 (1), 94-105 (2004).
  7. Coderre, T. J., Bennett, G. J. A hypothesis for the cause of complex regional pain syndrome-type I (reflex sympathetic dystrophy): pain due to deep-tissue microvascular pathology. Pain Medicine. 11 (8), 1224-1238 (2010).
  8. Klafke, J. Z., et al. Acute and chronic nociceptive phases observed in a rat hind paw ischemia/reperfusion model depend on different mechanisms. Pflugers Archiv European Journal of Physiology. 468 (2), 229-241 (2015).
  9. Tang, Y., et al. Interaction between astrocytic colony stimulating factor and its receptor on microglia mediates central sensitization and behavioral hypersensitivity in chronic post ischemic pain model. Brain Behavioral Immunology. 68, 248-260 (2018).
  10. Kim, J. H., Kim, Y. C., Nahm, F. S., Lee, P. B. The Therapeutic Effect of Vitamin C in an Animal Model of Complex Regional Pain Syndrome Produced by Prolonged Hindpaw Ischemia-Reperfusion in Rats. International Journal of Medical Sciences. 14 (1), 97-101 (2017).
  11. Yin, C., et al. Transcriptome profiling of dorsal root ganglia in a rat model of complex regional pain syndrome type-I reveals potential mechanisms involved in pain. Journal of Pain Research. 12, 1201-1216 (2019).
  12. Hu, Q., et al. TRPV1 Channel Contributes to the Behavioral Hypersensitivity in a Rat Model of Complex Regional Pain Syndrome Type 1. Frontiers in Pharmacology. 10, 453(2019).
  13. Dixon, W. J. Efficient analysis of experimental observations. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 20, 441-462 (1980).
  14. Chai, W., et al. Electroacupuncture Alleviates Pain Responses and Inflammation in a Rat Model of Acute Gout Arthritis. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine. 2018, 2598975(2018).
  15. Chaplan, S. R., Bach, F. W., Pogrel, J. W., Chung, J. M., Yaksh, T. L. Quantitative assessment of tactile allodynia in the rat paw. Journal of Neuroscience Methods. 53 (1), 55-63 (1994).
  16. Fang, J. Q., et al. Parameter-specific analgesic effects of electroacupuncture mediated by degree of regulation TRPV1 and P2X3 in inflammatory pain in rats. Life Sciences. 200, 69-80 (2018).
  17. Tai, Y., et al. Involvement of Transient Receptor Potential Cation Channel Member A1 activation in the irritation and pain response elicited by skin-lightening reagent hydroquinone. Scientific Reports. 7 (1), 7532(2017).
  18. Liu, B., et al. TRPM8 is the principal mediator of menthol-induced analgesia of acute and inflammatory pain. Pain. 154 (10), 2169-2177 (2013).
  19. Liu, B., et al. Oxidized Phospholipid OxPAPC Activates TRPA1 and Contributes to Chronic Inflammatory Pain in Mice. PLoS One. 11 (11), 0165200(2016).
  20. Terkelsen, A. J., Gierthmuhlen, J., Finnerup, N. B., Hojlund, A. P., Jensen, T. S. Bilateral hypersensitivity to capsaicin, thermal, and mechanical stimuli in unilateral complex regional pain syndrome. Anesthesiology. 120 (5), 1225-1236 (2014).
  21. Drummond, P. D., Morellini, N., Finch, P. M., Birklein, F., Knudsen, L. F. Complex regional pain syndrome: intradermal injection of phenylephrine evokes pain and hyperalgesia in a subgroup of patients with upregulated alpha1-adrenoceptors on dermal nerves. Pain. 159 (11), 2296-2305 (2018).
  22. Minert, A., Gabay, E., Dominguez, C., Wiesenfeld-Hallin, Z., Devor, M. Spontaneous pain following spinal nerve injury in mice. Experimental Neurology. 206 (2), 220-230 (2007).
  23. Kingery, W. S., et al. Capsaicin sensitive afferents mediate the development of heat hyperalgesia and hindpaw edema after sciatic section in rats. Neuroscience Letters. 318 (1), 39-43 (2002).
  24. Xu, J., et al. Activation of cannabinoid receptor 2 attenuates mechanical allodynia and neuroinflammatory responses in a chronic post-ischemic pain model of complex regional pain syndrome type I in rats. European Journal of Neuroscience. 44 (12), 3046-3055 (2016).
  25. Coderre, T. J., Xanthos, D. N., Francis, L., Bennett, G. J. Chronic post-ischemia pain (CPIP): a novel animal model of complex regional pain syndrome-type I (CRPS-I; reflex sympathetic dystrophy) produced by prolonged hindpaw ischemia and reperfusion in the rat. Pain. 112 (1-2), 94-105 (2004).
  26. Weissmann, R., Uziel, Y. Pediatric complex regional pain syndrome: a review. Pediatric Rheumatology Online Journal. 14 (1), 29(2016).
  27. Kim, H., Lee, C. H., Kim, S. H., Kim, Y. D. Epidemiology of complex regional pain syndrome in Korea: An electronic population health data study. PLoS One. 13 (6), 0198147(2018).
  28. Tang, C., et al. Sex differences in complex regional pain syndrome type I (CRPS-I) in mice. Journal of Pain Research. 10, 1811-1819 (2017).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

İskemi ReperfüzyonArka EkstremiteMekanik AllodiniTermal HiperaljeziKapsaisin EnjeksiyonuVon Frey FilamentleriHargreaves YöntemiNosifensif Davranış
Sıçanlarda Kompleks Bölgesel Ağrı Sendromu Tip-I kronik Post-Iskemi Ağrı Modeli
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.