Method Article

Dizili Kütüphanelerin Orta İşleç Lik Taraması ve Çift Luciferase Tabanlı Muhabir kullanılarak Transkripsiyon Faktörü Düzenleyicilerin Tanımlanması

DOI:

10.3791/60582

⸱

March 27th, 2020

 , 
1Department of Molecular & Cellular Physiology, Albany Medical College

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Transkripsiyon faktörlerinin yeni düzenleyicilerini belirlemek için, çift luciferase tabanlı transkripsiyonel muhabir testi kullanarak dizili lentiviral veya retroviral RNAi kitaplıklarını taramak için bir yaklaşım geliştirdik. Bu yaklaşım, tek bir deneyde yüzlerce adayı taramak için hızlı ve nispeten ucuz bir yol sunar.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Transkripsiyon faktörleri onları anti-kanser tedavileri için iyi hedefler haline downstream süreçlerin çeşitli etkileyen çok sayıda hedef genlerin ekspresyonu değiştirebilirsiniz. Ancak, transkripsiyon faktörlerinin doğrudan hedef alınması genellikle zordur ve bir veya daha fazla erişkin dokuda transkripsiyon faktörü gerekliyse yan etkilere neden olabilir. Bu proteinlerin ilaçlanması kolaysa, kanser hücrelerindeki transkripsiyon faktörlerini anormal bir şekilde aktive eden upstream regülatörlerinin belirlenmesi daha uygulanabilir bir alternatif sunar. Burada, dizili orta ölçekli lentiviral kütüphaneleri birleştirmek için kullanılabilecek bir protokol ve kanser hücrelerindeki transkripsiyon faktörlerinin yeni düzenleyicileri belirlemek için çift luciferase tabanlı transkripsiyonel muhabir test açıklar. Yaklaşımımız, yüzlerce geni tek bir deneyde test etmek için hızlı, kolay ve ucuz bir yol sunar. Bu yaklaşımın kullanımını göstermek için, Hippo yolunun alt etkileri olan iki transkripsiyonel koaktivatörler olan PDZ bağlayıcı motifli (TAZ) ile Evet ilişkili protein (YAP) ve transkripsiyonel koaktivatörün çeşitli düzenleyicileri içeren dizili lentiviral RNAi kütüphanesinin bir ekranını gerçekleştirdik. Ancak, bu yaklaşım hemen hemen herhangi bir transkripsiyon faktörü veya co-faktör düzenleyiciler için ekrana değiştirilebilir ve aynı zamanda CRISPR/CAS9, cDNA veya ORF kitaplıklarını taramak için de kullanılabilir.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu takınç amacı nispeten hızlı ve ucuz bir şekilde transkripsiyon faktörlerinin düzenleyicileri belirlemek için viral kütüphaneler kullanmaktır. Anormal transkripsiyonel aktivite kanser ve metastaz ile ilişkili1,2,3,4,5,6,bu yüzden kanser hücrelerinde transkripsiyon faktörleri hedefleme umut verici bir tedavi yaklaşımıdır. Ancak, transkripsiyon faktörleri genellikle farmakolojikolarak 7 hedef zordur ve birçok yetişkin dokularda normal hücresel fonksiyon için gereklidir8,9,10. Anormal hastalığı sürücü transkripsiyon faktörleri etkinleştirmek kanser ile ilişkili yolları hedefleme daha az şiddetli yan etkilere sahip potansiyeli ile daha uygulanabilir bir yaklaşımdır. Dizili lentiviral ve retroviral RNAi, CRISPR/CAS9, cDNA veya ORF kütüphanelerinin ticari kullanılabilirliği, araştırmacıların tek bir deneyde çok sayıda genin önemini test etmesine olanak tanır. Ancak, değiştirilmiş transkripsiyonel etkinlik için güvenilir bir okuma gereklidir.

Burada, kanser hücrelerindeki transkripsiyon faktörlerini düzenleyen proteinleri tanımlamak için çift luciferase tabanlı transkripsiyonel muhabir testin ve dizili lentiviral kütüphanelerin kullanımını tanımlıyoruz. Bu araştırmada, kanserle ilişkili genleri hedef alan shRNA'lar lentiviral transdüksiyon yoluyla memeli kanser hücrelerine ulaştırılır ve hücreler puromisin kullanılarak kararlı entegrasyon için seçilir. Hücreler sonraki araştırılmaktadır transkripsiyon faktörü ne özgü bir organizatör tarafından yönlendirilen firefly luciferase ve araştırılan transkripsiyon faktörü yanıt vermeyen bir kurucu aktif organizatörü renilla luciferase ifade eden bir kontrol yapısı tarafından yönlendirilen firefly luciferase ifade eden bir muhabir yapısı ile transfeced vardır. Biz YAP ve TAZ düzenleyicileri için bir proof-of-concept ekran ile bu yaklaşımı göstermek, Hippo yolukritikdownstream efektörleri 8,10,11. YAP ve TAZ anormal aktivite metastatik basamak birkaç adım teşvik11 ve birçok kanserlerde gözlenen11,12,13. Ancak, YAP ve TAZ'ın bazı kanser hücrelerinde nasıl anormal bir şekilde aktive olduğu henüz tam olarak anlaşılamamıştır. YAP ve TAZ DNA'yı bağlamaz, ancak bunun yerine diğer transkripsiyon faktörleri tarafından organizatörlere istihdam edilir. ÇAY etki alanı (TEAD) transkripsiyon faktörleri ailesinin üyeleri YAP ve TAZ için en önemli bağlayıcı ortaklardır ve çoğu YAP ve TAZ'a bağımlı fonksiyonlar için kritik öneme sahiptir. Muhabirimiz yapı bir YAP/TAZ-TEAD duyarlı organizatörü nden firefly luciferase ifade eder ve önceki çalışmalar da sadakatle YAP-TEAD ve TAZ-TEAD transkripsiyonel aktivite2,,14,15değişiklikleri algılar göstermiştir .

Yaklaşımımız hızlı, orta iş lenmedir ve tarama tesisleri, otomatik robotlar veya havuzlu kütüphanelerin derin sıralamasını gerektirmez. Maliyetler nispeten düşüktür ve aralarından seçim yapabileceğiniz çok sayıda ticari kütüphane vardır. Gerekli ekipman ve reaktifler de çoğu laboratuvarda nispeten standart. Luciferase tabanlı bir muhabir varsa veya oluşturulursa hemen hemen her transkripsiyon faktörü düzenleyicileri için ekran için kullanılabilir. Bu yaklaşımı kanser hücrelerinde shRNA'ları taramak için kullanıyoruz, ancak makul bir verimlilikle aktarılabilen herhangi bir hücre hattı, her türlü dizili kütüphanede kullanılabilir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

NOT: Bu protokolün şematik bir özeti Şekil 1'degösterilmiştir.

1. Lentiviral vektör kütüphane hazırlama

NOT: Gösterilen ekran 96-iyi plakalar gliserol stokları olarak satın alınan bir dizili shRNA kütüphane kullanılan, ancak kütüphaneler de adayların bir listesine göre el ile monte edilebilir. Uygun denetimler dikkate alınmalı ve herhangi bir kitaplıkta yer almalıdır. Buna, hedefsiz bir kontrol shRNA (shNTC), transkripsiyon faktörünü hedefleyen bir kontrol shRNA'sı ve mümkünse firefly luciferase'i hedefleyen bir shRNA dahildir.

  1. 96-derin kuyu plakasının her bir kuyuya 100 g/mL ampisilin içeren 100 mL luria suyu (LB) (%1 bacto-trypton, %0,5 maya özü, %1 NaCl, pH 7,5) ekleyin. Her kuyuyu 2 μL gliserol stoku ile inoculate ve 225 rpm sürekli ajitasyon ile bir gecede 37 °C'de büyümek.
  2. Her bakteri kültürünü 1,5 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın ve bakterileri 10 dk boyunca 4 °C'de 21.000 x g'de santrifüj ile peletleyin.
  3. Üreticinin protokolünü izleyerek her vektörü bakteriyel bir mini hazırlık kiti kullanarak arındırın.
  4. Bir spektrofotometre kullanarak her vektörün konsantrasyonu belirleyin.
  5. Plazmidleri -20 °C'de saklayın.
    NOT: Protokol burada duraklatılabilir.

2. Dizili lentiviral kütüphanenin ambalajı

NOT: Lentivirus içeren tüm çalışmalar, paketleme, enfeksiyon ve enfekte hücrelerin sonraki culturing dahil kesinlikle kurumsal biyogüvenlik kuralları ve yönetmeliklere uygun olmalıdır.

  1. 293FT hücreleri tam büyüme ortamı (Dulbecco'nun modifiye Kartal orta (DMEM) içeren 4 mM L-glutamin, 4.500 mg / L glukoz ve sodyum piruvat, ile takviye 293FT hücreleri genişletin 100 adet / mL penisilin, 100 μg/mL streptomisin antibiyotik ve 2 mM L-L-glutamin).
  2. 1.4 adımdan itibaren kütüphanedeki her vektör için 1 x 105 293FT hücreli bir 24-iyi tohum.
    NOT: Bir kontrol viral vektör bazı ekstra kuyular paketlenmiş ve adım 3 (aşağıya bakın) geçmeden önce virüsün titresini test etmek için kullanılması önerilir.
  3. Hücreleri 37 °C'de %5 CO2 ile 24 saat kuluçkaya yatırın.
    NOT: Daha önce14 olarak tanımlanan ambalaj lentivirus için genel bir protokol bu protokol için 24 kuyuya küçültülmüştür. Bu bir kat protein olarak lentiviral ambalaj ve VSVG için psPAX2 kullanır. Ektropik virüs isteniyorsa, VSVG yerine Eco'u teslim eden bir vektör kullanılabilir. Bu protokolün, hedef hücrelerin %30-70 enfeksiyon verimi veren viral bir titreyi elde etmek için optimize edilmesi önerilir (bkz. Kullanılan tüm vektörlerin listesi için Ek Tablo 1'e bakın.
  4. Aşağıda açıklandığı gibi Adım 1.4'ten her viral vektör için bir transfeksiyon karışımı ayarlayın. Her transfeksiyon 250 ng viral vektör, 125 ng psPAX2, 125 ng VSVG, 1.25 μL transfeksiyon reaktifi 1 ve 23.75 μL transfeksiyon tamponu içermelidir (Bkz. Malzeme Tablosu).
    1. Her lentiviral vektörü nükleaz içermeyen suyla 50 ng/μL'ye seyreltin ve ardından 5 μL'yi (250 ng) 96 kuyulu pcr plakalı bir kuyuya aktarın.
    2. Transfeksiyon süper karışımını 1,25 μL * X transfeksiyon reaktifi 1 ve 23,75 μ L * X'i önceden ısıtılmış transfeksiyon tamponunun "X" transfeksiyon larının toplam sayısı nın yanı sıra pipetleme sırasında hacim kaybını hesaba katmak için birkaç ekstra olduğu bir şekilde karıştırarak süper karışım yapın.
    3. 5 dakika oda sıcaklığında transfection süper karışımı kuluçka.
    4. Adım 2.4.3 transfeksiyon süper karışımı tüpüne psPAX2 125 ng * X psPAX2 ve 125 ng * X VSVG ekleyin ve yavaşça yukarı ve aşağı karıştırmak için pipet. Hızla Adım 2.4.5'e geçin.
    5. Hemen adım 2.4.4 bir PCR şerit her tüp içine karışımı aliquot ve daha sonra adım 2.4.1 viral vektör içeren her kuyuya 25 μL karışımı aktarmak için çok kanallı pipet kullanın.
    6. 20 dk oda sıcaklığında kuluçka.
    7. Adım 2.4.6'dan her 96 kuyudan 30°L'nin tümünün 2.3'ten 293 FT hücre içeren 24 kuyuluk bir kuyuya aktarın.
  5. Hücreleri 37 °C'de 24 saat için %5 CO2 ile kuluçkaya yatırın ve ardından 24 kuyulu plakanın her kuyudaki ortamı 500 μL taze tam büyüme ortamıyla değiştirin. Hücreleri 37 °C'de %5 CO2 ile 24 saat daha kuluçkaya yatırın.
  6. Çok kanallı bir pipet kullanarak, her bir kuyudan viral süpernatant toplayın ve her biri iki 96-wells içine 220 μL (Adım 3'te 1 enfeksiyon artı bazı ekstra hacim için yeterli) alın. Bunlar dizili viral süpernatant plakalar.
  7. Dizili viral supernatant plakaları -80 °C'de saklayın.
    NOT: Protokol burada duraklatılabilir. Ayrıca, Adım 3'e geçmeden önce enfekte edilecek hücrelerde paketlenmiş (yukarıya bakın) ekstra kontrol virüsünün bir kısmını test etmek önerilir. Bu titre en az% 30 enfeksiyon verimliliği elde etmek için yeterli olduğundan emin olmaktır.

3. Ekran için hücrelerin enfeksiyonu

NOT: İnsan melanom hücreleri (A375) bu yaklaşımı göstermek için kullanılmıştır, ancak bu yöntem lentivirus ile enfekte herhangi bir yapışık hücrelere uygulanabilir. Ancak, hücre kültürü ve kaplama koşulları her hücre satırı için optimize edilmelidir (Bkz. Tartışma).

  1. Hücreleri tam büyüme ortamında enfekte olacak şekilde genişletin.
  2. Tohum 24-iyi plakalar 1 x 105 hücreleri ile 0.5 ml tam büyüme ortamı başına iyi. Tohum her viral vektör için iyi test edilecek (kontroller dahil) ve Adım 3.7 ilaç seçimi için bir kontrol olarak hizmet edecek enfekte olmayacak ekstra bir kuyu içerir.
  3. Hücreleri 37 °C'de %5 CO2 ile 24 saat kuluçkaya yatırın.
  4. Aşağıdaki gibi dondurulmuş dizili lentiviral supernatant farklı bir viral supernatant ile Adım 3.2 her kuyu enfekte.
    1. 20 μg/mL polibren içeren tam büyüme ortamı hazırlayın.
    2. Adım 2.7 oda sıcaklığına dizili lentiviral kütüphane supernatants çözültün.
    3. Adım 3.2'deki 24 kuyuplakadan büyüme ortamını aspire edin ve hemen her kuyuya 200 μL polibren içeren büyüme ortamı ekleyin.
    4. Çok kanallı pipet kullanarak, Adım 3.4.2'den Step 3.4.3'ten 24 kuyuya her 96 kuyudan 200 μL viral süpernatant aktarın.
  5. Hücreleri 37 °C'de %5 CO2 ile 24 - 48 saat kuluçkaya yatırın.
    NOT: Bazı hücre hatları shRNA'ları ifade etmek ve puromisin dirençli hale gelmek için 24 saatten uzun sürebilir. Burada kullanılan viral vektör puroR 3'UTR bir miR30 tabanlı shRNA ile Turbo-GFP-IRES-puroR sunar (Şekil 1). Püromisin direnç geni ve shRNA'nın enfeksiyon etkinliği ve ekspresyonu yeşil floresan protein ile izlendi.
  6. 2,5 g/mL puromisin içeren tam büyüme ortamı hazırlayın.
    NOT: Püromisin seçim konsantrasyonu hücre çizgileri arasında değişir. Her hücre hattının ekrandan önce taranması için bir antibiyotik öldürme eğrisi yapılması önerilir.
  7. Her kuyudan ortam aspire ve puromisin içeren tam büyüme ortamı 500 μL ile değiştirin.
    NOT: Ayrıca puromisin seçimi tamamlandığından emin olmak için sonraki adımlarda kullanılabilecek bir kontrol enfekte olmayan kuyuya puromisin eklemek için emin olun.
  8. Hücreleri 37 °C'de %5 CO2 ile 48 saat kuluçkaya yatırın.
    NOT: 48 saat için seçmek en iyisidir, bu nedenle kaplama yoğunluğu ve viral titre, hücrelerin 48 saatten önce aşırı etkili olmaması için optimize edilmelidir.
  9. Enfekte hücrelerin floresan mikroskobu altında yeşil olduğundan emin olun, ve bir kontrol olmayan enfekte olmayan püromisin ile tedavi hücrelerinin adım 4 geçmeden önce tüm ölü.

4. Çift luciferase muhabiritransfeksiyon için tohum hücreleri

NOT: Her yeni hücre hattı için en uygun tohumlama yoğunluğunu belirlemek için bir test transfeksiyonu yapılmalıdır.

  1. Adım 3.9'dan her kuyuyu deneyin ve yaklaşık 1 x 105 hücreyi aşağıdaki gibi yeni 24 kuyuplakası üzerindeki ilgili konumdaki kuyulara aktarın.
    NOT: Bu protokol, enfekte hücrelerin her kuyuyu saymak mümkün olmayacaktır bu yüzden shRNA'lar yüzlerce kütüphanelerin taranması için tasarlanmıştır. Bu nedenle, kabaca eşit kaplama yoğunluğu sağlamak için aşağıdaki adımlar her kuyuda hücre numaralarını tahmin etmek için kullanılmıştır.
    1. 3.9'dan 3'e ayrılan kuyuları gruplandırın- bir gruptaki tüm kuyuların benzer hücre yoğunluğuna sahip olduğu 4 gruba.
    2. 37 °C'de 5 dk için 200 μL trypsin-EDTA (0,5 mM EDTA ve %0,1 tripsin ile desteklenmiş 1x PBS) ile her gruptan 1 temsilci iyi bir destek elde edin. Daha sonra tam büyüme ortamı içeren 400 μL puromisin ekleyerek tripsin-EDTA'yı nötralize edin.
    3. Toplam hücre sayısını belirlemek için her temsilciyi iyi sayın ve hücre süspansiyonuna her temsilciden tam büyüme ortamını kullanarak 2 x 105 hücre/mL'ye seyreltin.
    4. Tohum 0.5 mL (1 x 105 hücreleri) Adım 4.1.3 yeni bir 24-well plaka üzerinde ilgili konuma her kuyunun ve 24 saat için% 5 CO2 ile 37 °C bu yeni 24-well plaka kuluçka.
    5. Adım 4.1.1'den her grup için, ortaya çıkan hücre süspansiyonunun 1 x 106 hücre/mL olması için her kuyuya eklemek üzere tripsin-EDTA hacmini hesaplamak için Adım 4.1.3'te belirlenen toplam hücre numarasını kullanın.
    6. Her kuyuya uygun trypsin-EDTA hacmini ekleyin ve 37 °C'de 5 dakika kuluçkaya yatırın.
      NOT: Daha büyük bir ekran için, hücrelerin canlılığını sağlamak için 24 kuyulu plakaların tek seferde değil, gruplar halinde denip edilmesi ve yenilenmesi önerilir.
    7. Yukarıdaki kuluçka sırasında, 24 kuyulu yeni bir plaka üzerindeki ilgili kuyulara 400 μL puromisin içeren tam büyüme ortamı eklemek için çok kanallı bir pipet kullanın.
    8. Adım 4.1.7'de hazırlanan yeni 24 kuyulu plakalar üzerindeki karşılık gelen konuma her kuyudan 100 μL hücre süspansiyonu (yaklaşık 1 x 105 hücre) aktarın.
    9. Adım 4.1.1'den gruplanmış kuyuların tüm plakaları için 4.1.6'dan 4.1.8'e kadar adımları tekrarlayın.
  2. Hücreleri 37 °C'de %5 CO2 ile 24 saat kuluçkaya yatırın.

5. Çift luciferase muhabirinin transfeksiyonu

  1. Transfect her iyi Adım 4.2 çift luciferase muhabiri ile aşağıdaki gibi inşa eder.
    NOT: Bu taslamayı başlatmadan önce DNA'nın toplam miktarı ve ateş böceği luciferase muhabiri vektörünün Renilla luciferase vektörü kontrol etmek için optimal oranı belirlenmelidir. Burada 400 ng'lik DNA karışımında 20 parça ateş böceği luciferase muhabiri ve 1 parça kontrol renilla luciferase kullanıldı.
    1. Transfeksiyon seyreltme karışımı (Tüp A) ve muhabir seyreltme karışımını (Tüp B) her reaktifin belirtilen hacimlerini(Tablo 1)karıştırılarak toplam transfeksiyon sayısıyla (artı birkaç ekstra) karıştırın.
      NOT: Bu protokol transfeksiyon reaktifi 2 için optimize edilmiştir (bkz. Malzeme Tablosu). Farklı bir transfeksiyon reaktifi kullanılırsa, transfeksiyon bu adımdan önce optimize edilmelidir.
    2. Transfeksiyon seyreltme karışımını (Tüp A) muhabiri seyreltme karışımı (Tüp B) ile karıştırın ve transfeksiyon karışımı üretmek için 15 dakika oda sıcaklığında kuluçkaya yatırın.
    3. Yukarıdaki kuluçka sırasında, 0,25 mL fosfat tampon salini (PBS) ile Step 4.2'den her 24-iyi durulayın ve her kuyuya 447 μL tam büyüme ortamı ekleyin.
    4. 15 dk kuluçkadan sonra, 24 kuyulu plakaların her bir kuyuya 53°L transfeksiyon karışımı dağıtmak için çok kanallı bir pipet kullanın.
  2. Hücreleri 37 °C'de %5 CO2 ile 24 saat kuluçkaya yatırın.

6. Çift luciferase aktivitesinin nicelleştirilmesi

  1. Aşağıda açıklandığı gibi bir plaka okuyucu ve çift luciferase muhabir işeyme kiti kullanarak luciferase aktivitesini ölçün.
    NOT: Bu protokol belirtilen muhabir test kiti için optimize edilmiştir (bkz. Malzemeler Tablosu)ve üreticinin önerdiği protokolü izler.
    1. Deiyonize su ile 5x pasif lysis tampon (kit te ve sağlanan) 1-5 seyreltme tarafından tüm kuyular için yeterli 1x pasif lysis tampon artı birkaç ekstra (75 μL kuyu başına gereklidir) hazırlayın. Ayrıca çözülme reaktifi A ve reaktif B Arabellek (kit, her kuyu için 100 μL gereklidir) sağlanır.
    2. Adım 5.2'den 24 kuyulu plakanın her kuyudan medyayı aspire edin.
    3. Her kuyuya 75 μL 1x pasif lisis tampon ekleyin ve oda sıcaklığında 30 dakika ara sıra sallayarak kuluçkaya yatırın.
    4. 50x reaktif B substratı (kitte sağlanan) 1:50 çözülmüş reaktif B tamponu ile seyrelterek Reaktif B hazırlayın.
    5. Boşalmak için 4 kuyuya 30 μL 1x pasif lisis tamponu ekleyin (Bkz. Ek Tablo 2).
    6. Adım 6.1.3'ten 30 μL'lik lysate'yi 96 kuyulu düz alt beyaz bir deneme plakasının yinelenen kuyularına aktarın.
    7. Her kuyuya 50 μL reaktif A eklemek için çok kanallı bir pipet kullanın ve bir plaka okuyucu ile firefly luciferase sinyalini okuyun.
    8. Her kuyuya Adım 6.1.4'ten 50 μL reaktif B eklemek için çok kanallı bir pipet kullanın ve Renilla luciferase sinyalini bir plaka okuyucuyla okuyun.
  2. Ham verileri aşağıdaki gibi işleme (ayrıntılı bir açıklama için Ek Tablo 2'yebakın).
    1. Düşük değerler viral yapının toksik olduğunu veya çok az transfected hücrenin test edildiğini gösterdiğinden, çok düşük Renilla luciferase sinyaline sahip örnekleri hariç tilebilir.
      NOT: Tartışmada açıklandığı gibi, önemli ölçüde "düşük" Renilla luciferase sinyala anormal sonuçlar neden olabilir. Burada, Renilla luciferase sinyalinin ortalamanın altında 1 standart sapmanın olduğu kuyular hariç tutulmuştu (Bkz. Ek Tablo 2). Bu hücrelerde bu muhabir sistemi kullanılarak yapılan önceki çalışmalara dayanıyordu14, ancak diğer hücre hatları farklı olabilir.
    2. Ateş böceği /Renilla oranı elde etmek için aynı kuyunun ham Renilla luciferase değeri her kuyunun ham firefly luciferase değerini normalleştirin.
    3. Tüm çoğaltmak kontrol kuyularının firefly /Renilla oranları ortalama ve daha sonra bir kat değişikliği elde etmek için bu sayıya her kuyunun firefly /Renilla oranı bölmek.
    4. Kontrol örneğini atayın ve firefly/Renilla oranı değerini 1'e ayarlayın.
    5. Yinelenen kuyuların ateş böceği/Renilla oranlarını ve standart sapmaile çizimi ortalama.
      NOT: Standart sapma istatistiksel analiz için değil, bunun yerine çoğaltmaların önemli ölçüde farklı olduğu kuyuları tanımlamak için bir araç olarak kullanılır.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bizim YAP / TAZ-TEAD muhabir yapısı (pGL3-5xMCAT (SV)-492,14,15) kanonik TEAD bağlayıcı elemanı (MCAT)15 ateşböceği luciferase gen sürüş 5 tekrarları ile minimal Bir SV-49 organizatörü içerir ( Şekil1). Constitutively aktif HSV TK organizatörü renilla luciferase ifade PRL-TK kontrol vektörü (Promega) ile birlikte hücrelere transfeced ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışmada, transkripsiyon faktörlerinin yeni düzenleyicilerini tanımlamak ve test etmek için kullanılabilecek çift luciferase tabanlı transkripsiyonel muhabir testi ile birlikte dizili viral kütüphanelerin orta iş bölümü taraması için bir yaklaşım gösterilmiştir. Herhangi bir ekrandan önce her hücre hattı için muhabir sistemini karakterize etmek ve optimize etmek çok önemlidir. Muhabirin incelenmekte olan transkripsiyon faktörünün değiştirilmiş aktivitesine duyarlı olduğunu doğrulamak için deneyler yapılmalı ve hareke...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Emily Norton ve Mikaelan Cucciarre-Stuligross'a shRNA vektörlerinin hazırlanmasına yardımcı olan için teşekkür ederiz. Bu çalışma kısmen J.M.L.'ye (#CCR17477184) verilen Susan G. Komen Career Catalyst Grant tarafından desteklenmiştir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
2.0 ml 96 oyuklu derin kuyu polipropilen plakaUSA Scientific1896-2000Bakteriyel mini hazırlık için
Tripsin -% 2.50Gibco15090-046Tripsin-EDTA
96 kuyu bileşeni düz tabanlı beyaz tahlil plakasıCorning3922Çift lusiferaz testi için
Ampisilin - 100 mg / mlSigma-Aldrich45-10835242001-EABakteriyel mini hazırlık için
Bacto-tripton - tozSigma-Aldrich95039LB suyu
bileşeni LAR II reaktifi (reaktif A) içeren çift lusiferaz raportör test sistemi, Durdur & Glo substrat (reaktif B substratı) ve Stop & Glo tamponu (reaktif B tamponu) - KitPromegaE1960Çift lusiferaz tahlili için
Dulbecco'nun fosfat tamponlu salin, kalsiyum, magnezyum ve fenol kırmızısı içermez - 9,6 g/LHimediaTS1006PBS
EDTA için - 0,5 MVWR97061-406Tripsin-EDTA
Bakteriyel mini hazırlık%100Pharmco-AAPER
111000200 Sığır Serumu -% 100VWR97068-085Tam büyüme ortamının bileşeni
Heksadimetrin bromür (Polibren) - 8 mg / mlSigma-Aldrich45-H9268Virüs enfeksiyonu için
HyClone DMEM / Yüksek glikoz - 4 mM L-Glutamin; 4500 mg/L glikoz; sodyum piruvatGE Healthcare yaşam bilimleriSH30243.01Tam büyüme ortamının bileşeni
I3-P/i3 Çok Modlu Mikroplaka/EAMoleküler cihazlarÇift lusiferaz deneyi için
L-Glutamin - 200 mMGibco25030-081Tam büyüme ortamının bileşeni
Lipofektamin 3000 (Transfeksiyon Reaktifi 2) - %100Yaşam teknolojileriL3000008Transfeksiyonlar için
Moleküler Biyoloji Su - %100VWR02-0201-0500Virüs paketleme için shRNA vektörünün seyreltilmesi için
NaCl - tozBDHBDH9286LB et suyu
bileşeni NanoDrop Bir Mikro Hacimli UV-Vis SpektrofotometreTermo bilimselVektör DNA konsantrasyonunu ölçmek için
Opti-MEM (Transfeksiyon Tamponu) -% 100Gibco31985-062Transfeksiyonlar için
Penisilin Streptomisin - 10.000 Birim / ml (Penisilin); 10.000 ve mikro; g/ml (Streptomisin)Gibco15140-122Tam büyüme ortamının bileşeni
PureLink Hızlı Plazmid Miniprep Kiti - KitThermo Fisher ScientificK210010Bakteriyel mini hazırlık için
Puromycin - 2.5 mg/mlSigma-Aldrich45-P7255Enfeksiyon sonrası antibiyotik seçimi için
TC20 otomatik hücre sayacıBio-RadHücre sayımı için
X-tremeGENE 9 DNA transfeksiyon reaktifi (Transfeksiyon Reaktifi 1) - %100Roche6365787001Virüs paketleme için
Maya özü - tozVWRJ850LB suyu
P3000 bileşeni (Transfeksiyon Reaktifi 3) - %100YaşamteknolojileriL3000008Transfeksiyonlar için
Etanol Bileşeni - için

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Chen, K. S., Lim, J. W. C., Richards, L. J., Bunt, J. The convergent roles of the nuclear factor I transcription factors in development and cancer. Cancer Letters. 410, 124-138 (2017).
  2. Lamar, J. M., et al. The Hippo pathway target, YAP, promotes metastasis through its TEAD-interaction domain. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (37), E2441-E2450 (2012).
  3. Liu, C. Y., Yu, T., Huang, Y., Cui, L., Hong, W. ETS (E26 transformation-specific) up-regulation of the transcriptional co-activator TAZ promotes cell migration and metastasis in prostate cancer. Journal of Biological Chemistry. 292 (22), 9420-9430 (2017).
  4. Semenza, G. L. Hypoxia-inducible factor 1: oxygen homeostasis and disease pathophysiology. Trends in Molecular Medicine. 7 (8), 345-350 (2001).
  5. Willmer, T., Cooper, A., Peres, J., Omar, R., Prince, S. The T-Box transcription factor 3 in development and cancer. Bioscience Trends. 11 (3), 254-266 (2017).
  6. Zhu, C., Li, L., Zhao, B. The regulation and function of YAP transcription co-activator. Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai). 47 (1), 16-28 (2015).
  7. Dang, C. V., Reddy, E. P., Shokat, K. M., Soucek, L. Drugging the 'undruggable' cancer targets. Nature Reviews: Cancer. 17 (8), 502-508 (2017).
  8. Fu, V., Plouffe, S. W., Guan, K. L. The Hippo pathway in organ development, homeostasis, and regeneration. Current Opinion in Cell Biology. 49, 99-107 (2017).
  9. Hansen, C. G., Moroishi, T., Guan, K. L. YAP and TAZ: a nexus for Hippo signaling and beyond. Trends in Cell Biology. 25 (9), 499-513 (2015).
  10. Yu, F. X., Zhao, B., Guan, K. L. Hippo Pathway in Organ Size Control, Tissue Homeostasis, and Cancer. Cell. 163 (4), 811-828 (2015).
  11. Warren, J. S. A., Xiao, Y., Lamar, J. M. YAP/TAZ Activation as a Target for Treating Metastatic Cancer. Cancers. 10 (4), (2018).
  12. Janse van Rensburg, H. J., Yang, X. The roles of the Hippo pathway in cancer metastasis. Cellular Signalling. 28 (11), 1761-1772 (2016).
  13. Zanconato, F., Cordenonsi, M., Piccolo, S. YAP/TAZ at the Roots of Cancer. Cancer Cell. 29 (6), 783-803 (2016).
  14. Lamar, J. M., et al. SRC tyrosine kinase activates the YAP/TAZ axis and thereby drives tumor growth and metastasis. Journal of Biological Chemistry. 294 (7), 2302-2317 (2019).
  15. Mahoney, W. M., Hong, J. H., Yaffe, M. B., Farrance, I. K. The transcriptional co-activator TAZ interacts differentially with transcriptional enhancer factor-1 (TEF-1) family members. Biochemical Journal. 388 (Pt 1), 217-225 (2005).
  16. Codelia, V. A., Sun, G., Irvine, K. D. Regulation of YAP by mechanical strain through Jnk and Hippo signaling. Current Biology. 24 (17), 2012-2017 (2014).
  17. Cosset, E., et al. Glut3 Addiction Is a Druggable Vulnerability for a Molecularly Defined Subpopulation of Glioblastoma. Cancer Cell. 32 (6), 856-868 (2017).
  18. de Cristofaro, T., et al. TAZ/WWTR1 is overexpressed in papillary thyroid carcinoma. European Journal of Cancer. 47 (6), 926-933 (2011).
  19. Densham, R. M., et al. MST kinases monitor actin cytoskeletal integrity and signal via c-Jun N-terminal kinase stress-activated kinase to regulate p21Waf1/Cip1 stability. Molecular and Cellular Biology. 29 (24), 6380-6390 (2009).
  20. Eda, H., Aoki, K., Marumo, K., Fujii, K., Ohkawa, K. FGF-2 signaling induces downregulation of TAZ protein in osteoblastic MC3T3-E1 cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 366 (2), 471-475 (2008).
  21. Elbediwy, A., et al. Integrin signalling regulates YAP and TAZ to control skin homeostasis. Development. 143 (10), 1674-1687 (2016).
  22. Enomoto, M., Igaki, T. Src controls tumorigenesis via JNK-dependent regulation of the Hippo pathway in Drosophila. EMBO Reports. 14 (1), 65-72 (2013).
  23. Enomoto, M., Kizawa, D., Ohsawa, S., Igaki, T. JNK signaling is converted from anti- to pro-tumor pathway by Ras-mediated switch of Warts activity. Developmental Biology. 403 (2), 162-171 (2015).
  24. Fan, R., Kim, N. G., Gumbiner, B. M. Regulation of Hippo pathway by mitogenic growth factors via phosphoinositide 3-kinase and phosphoinositide-dependent kinase-1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (7), 2569-2574 (2013).
  25. Feng, R., et al. MAPK and Hippo signaling pathways crosstalk via the RAF-1/MST-2 interaction in malignant melanoma. Oncology Reports. 38 (2), 1199-1205 (2017).
  26. Fisher, M. L., et al. Transglutaminase Interaction with alpha6/beta4-Integrin Stimulates YAP1-Dependent DeltaNp63alpha Stabilization and Leads to Enhanced Cancer Stem Cell Survival and Tumor Formation. Cancer Research. 76 (24), 7265-7276 (2016).
  27. Haskins, J. W., Nguyen, D. X., Stern, D. F. Neuregulin 1-activated ERBB4 interacts with YAP to induce Hippo pathway target genes and promote cell migration. Science Signaling. 7 (355), (2014).
  28. Hoeing, K., et al. Presenilin-1 processing of ErbB4 in fetal type II cells is necessary for control of fetal lung maturation. Biochimica et Biophysica Acta. 1813 (3), 480-491 (2011).
  29. Hwang, J. H., et al. Extracellular Matrix Stiffness Regulates Osteogenic Differentiation through MAPK Activation. PloS One. 10 (8), e0135519(2015).
  30. Kaneko, K., Ito, M., Naoe, Y., Lacy-Hulbert, A., Ikeda, K. Integrin alphav in the mechanical response of osteoblast lineage cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 447 (2), 352-357 (2014).
  31. Kim, N. G., Gumbiner, B. M. Adhesion to fibronectin regulates Hippo signaling via the FAK-Src-PI3K pathway. Journal of Cell Biology. 210 (3), 503-515 (2015).
  32. Kuser-Abali, G., Alptekin, A., Cinar, B. Overexpression of MYC and EZH2 cooperates to epigenetically silence MST1 expression. Epigenetics. 9 (4), 634-643 (2014).
  33. Liu, N., et al. HDM2 Promotes NEDDylation of Hepatitis B Virus HBx To Enhance Its Stability and Function. Journal of Virology. 91 (16), (2017).
  34. Liu, X., et al. The EZH2- H3K27me3-DNMT1 complex orchestrates epigenetic silencing of the wwc1 gene, a Hippo/YAP pathway upstream effector, in breast cancer epithelial cells. Cellular Signalling. 51, 243-256 (2018).
  35. Omerovic, J., et al. Ligand-regulated association of ErbB-4 to the transcriptional co-activator YAP65 controls transcription at the nuclear level. Experimental Cell Research. 294 (2), 469-479 (2004).
  36. Pegoraro, S., et al. A novel HMGA1-CCNE2-YAP axis regulates breast cancer aggressiveness. Oncotarget. 6 (22), 19087-19101 (2015).
  37. Xia, H., et al. EGFR-PI3K-PDK1 pathway regulates YAP signaling in hepatocellular carcinoma: the mechanism and its implications in targeted therapy. Cell Death & Disease. 9 (3), 269(2018).
  38. Yan, F., et al. ErbB4 protects against neuronal apoptosis via activation of YAP/PIK3CB signaling pathway in a rat model of subarachnoid hemorrhage. Experimental Neurology. 297, 92-100 (2017).
  39. Aragona, M., et al. A mechanical checkpoint controls multicellular growth through YAP/TAZ regulation by actin-processing factors. Cell. 154 (5), 1047-1059 (2013).
  40. Bonilla, X., et al. Genomic analysis identifies new drivers and progression pathways in skin basal cell carcinoma. Nature Genetics. 48 (4), 398-406 (2016).
  41. Enger, T. B., et al. The Hippo signaling pathway is required for salivary gland development and its dysregulation is associated with Sjogren's syndrome. Laboratory Investigation. 93 (11), 1203-1218 (2013).
  42. Fausti, F., et al. ATM kinase enables the functional axis of YAP, PML and p53 to ameliorate loss of Werner protein-mediated oncogenic senescence. Cell Death and Differentiation. 20 (11), 1498-1509 (2013).
  43. He, J., et al. Positive regulation of TAZ expression by EBV-LMP1 contributes to cell proliferation and epithelial-mesenchymal transition in nasopharyngeal carcinoma. Oncotarget. 8 (32), 52333-52344 (2017).
  44. Huang, W., et al. The N-terminal phosphodegron targets TAZ/WWTR1 protein for SCFbeta-TrCP-dependent degradation in response to phosphatidylinositol 3-kinase inhibition. Journal of Biological Chemistry. 287 (31), 26245-26253 (2012).
  45. Imada, S., et al. Role of Src Family Kinases in Regulation of Intestinal Epithelial Homeostasis. Molecular and Cellular Biology. 36 (22), 2811-2823 (2016).
  46. Kim, N. G., Koh, E., Chen, X., Gumbiner, B. M. E-cadherin mediates contact inhibition of proliferation through Hippo signaling-pathway components. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (29), 11930-11935 (2011).
  47. Lai, J. K. H., et al. The Hippo pathway effector Wwtr1 regulates cardiac wall maturation in zebrafish. Development. 145 (10), (2018).
  48. Li, H., Gumbiner, B. M. Deregulation of the Hippo pathway in mouse mammary stem cells promotes mammary tumorigenesis. Mammalian Genome. 27 (11-12), 556-564 (2016).
  49. Pefani, D. E., O'Neill, E. Hippo pathway and protection of genome stability in response to DNA damage. The FEBS Journal. 283 (8), 1392-1403 (2016).
  50. Serrano, I., McDonald, P. C., Lock, F., Muller, W. J., Dedhar, S. Inactivation of the Hippo tumour suppressor pathway by integrin-linked kinase. Nature Communications. 4, 2976(2013).
  51. Vlug, E. J., et al. Nuclear localization of the transcriptional coactivator YAP is associated with invasive lobular breast cancer. Cellular Oncology (Dordrecht). 36 (5), 375-384 (2013).
  52. Xie, Q., et al. YAP/TEAD-mediated transcription controls cellular senescence. Cancer Research. 73 (12), 3615-3624 (2013).
  53. Yee, K. S., et al. A RASSF1A polymorphism restricts p53/p73 activation and associates with poor survival and accelerated age of onset of soft tissue sarcoma. Cancer Research. 72 (9), 2206-2217 (2012).
  54. Zhou, Z., et al. Oncogenic Kinase-Induced PKM2 Tyrosine 105 Phosphorylation Converts Nononcogenic PKM2 to a Tumor Promoter and Induces Cancer Stem-like Cells. Cancer Research. 78 (9), 2248-2261 (2018).
  55. Baker, J. M., Boyce, F. M. High-throughput functional screening using a homemade dual-glow luciferase assay. Journal of Visualized Experiments. (88), (2014).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Transcription Factor RegulatorsMedium Throughput ScreeningArrayed Lentiviral LibrariesDual Luciferase ReporterYAP TAZ RegulationHippo Pathway ScreeningRNAi Library ScreeningViral Vector ProductionLuciferase Activity AssayPuromycin Selection

Related Articles