Yöntem makalesi

Mikrobiyal Davranışı İncelemek Için Kontrollü, Dinamik Kimyasal Manzaralar Üretmek

DOI:

10.3791/60589

⸱

31 Ocak 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Environmental Engineering, Department of Civil, Environmental and Geomatic Engineering, 2School of Mathematics and Statistics, University of Melbourne, 3Institute of Marine Sciences, University of California, Santa Cruz, 4Faculty of Life and Environmental Sciences, University of Tsukuba, 5Microbiology Research Center for Sustainability, University of Tsukuba, 6Department of Ecology and Evolutionary Biology, Princeton University

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikroakışkan ve miliakışkan kurulumlar içinde fotolik tarafından dinamik kimyasal manzara üretimi için bir protokol sunulmaktadır. Bu metodoloji, hem tek hücre hem de popülasyon düzeyinde, hareketli davranış, besin alımı veya mikroorganizmaların kimyasallarına adaptasyon dahil olmak üzere çeşitli biyolojik süreçleri incelemek için uygundur.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kontrollü, dinamik kimyasal darbelerin üretimi için bir yöntem gösteriyoruz―lokalize kemoattractant mikro ölçekte aniden kullanılabilir hale gelir―mikrobiyal kemotaksis deneyleri için mikro ortamlar oluşturmak için. Kimyasal darbeler oluşturmak için, bakteriyel süspansiyon içeren bir polidimethylsiloxane (PDMS) mikroakışkan odası içinde kafesli amino asitlerin fotolizi ile anında amino asit kaynaklarını yakın-anında tanıtmak için bir sistem geliştirdi. Bu yöntemi, video mikroskopi ile takip edilirken bu dinamik kimyasal degradelere aktif olarak tırmanabilen kemotaktik bakteri Vibrio ordalii'yeuyguladık. Fotoçıkarılabilir koruma grubu ile kimyasal modifikasyon ile biyolojik olarak inert ('kafesli') haline getirilen amino asitler, neredeyse UV-A odaklı LED ışını ile zaman ve mekanda kullanıcı tarafından tanımlanan noktalarda meydana gelen ani salınımına kadar süspansiyonda düzgün bir şekilde mevcut değildir, ancak tüketilemez. Darbede salınan molekül sayısı, fotoliz sonrası emilim spektrumunun UV-Vis spektroskopisi ile karakterize olduğu maruz kalma süresi ile uncaging fraksiyonu arasındaki kalibrasyon ilişkisi ile belirlenebilir. Bir nanogözenekli polikarbonat (PCTE) membran kafeslenmemiş bileşikler ve harcanan ortam akışı ile sürekli kaldırma sağlamak için mikroakışkan cihaza entegre edilebilir. PCTE membranı ile PDMS mikroakışkan yapısı arasında güçlü, geri dönüşü olmayan bir bağ, membranın 3-aminopropyltriethoxysilane (APTES) çözeltisi ile kaplanması ve ardından bağlanacak yüzeylerin plazma aktivasyonu ile elde edilir. Bilgisayar kontrollü bir sistem, farklı konumlarda ve farklı yoğunluklarda kullanıcı tanımlı bakliyat dizileri oluşturabilir, böylece öngörülen uzamsal ve zamansal değişkenlik ile kaynak manzaraları oluşturabilir. Her kimyasal ortamda, bireysel ölçekte bakteri hareketinin dinamiği ve popülasyon düzeyinde birikmesi elde edilebilir, böylece kemotaktik performans ve ekolojik olarak ilgili ortamlarda bakteriyel toplamalar üzerindeki etkilerinin ölçülmesi izin.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikroplar chemotaxis güveniyor, kimyasal degradeler tespit ve yanıt motilite değiştirme süreci1, kimyasal manzara gezinmek için, besin kaynakları ve konakları yaklaşım, ve zararlı maddeler kaçmak. Bu mikroölçekli süreçler mikroplar ve çevreleri arasındaki etkileşimlerin makroölçekli kinetik belirlemek2,3. Mikroakışkanlar ve mikrofabrikasyon teknolojilerinde son zamanlarda ki gelişmeler, yumuşak litografi4de dahil olmak üzere, mikropların etkileşimlerini incelemek için kontrollü mikroortamlar yaratma yeteneğimizi kökten leştirmektedir. Örneğin, geçmiş deneyler yüksek besin konsantrasyonları için yüksek kontrollü, kararlı degradeler üreterek bakteriyel kemotaksis inceledik5,6. Ancak, doğal ortamlarda, mikro ölçekli kimyasal degradeler moleküler difüzyon tarafından kısa ömürlü―dağılmış―ve arka plan koşulları genellikle yüksek seyreltik7. Mikrobiyal popülasyonların kemotaktik tepkisini doğrudan ölçmek için, mikroakışkan teknolojiyi fotolizle birleştirmek için yöntemler tasarladık ve burada tanımladık, böylelikle vahşi bakterilerin doğada karşılaştıkları degradeleri taklit ettik.

Uncaging teknolojisi, biyomolekülleri aktif olmayan bir biçimde işlevsel olarak kapsülleyen ışığa duyarlı problar kullanır. Işınlama kafesli molekülü serbest bırakır, biyolojik bir sürecin hedeflenen tedirginliği sağlar8. Hücresel kimyanın hızlı ve hassas kontrolü sayesinde 9,kafesli bileşiklerin fotolsisi geleneksel olarak biyologlar, fizyologlar ve nörologlar tarafından genlerin aktivasyonunu incelemek için kullanılmıştır10, iyon kanalları11, ve nöronlar12. Daha yakın zamanda, bilim adamları kemotaksis13çalışma fotoliz önemli avantajları kaldıraçlı var , bir adım adım kemoattractant uyarıcı maruz bireysel bakteri hücrelerinin flagella anahtarlama dinamiklerini belirlemek için14,15, ve üç boyutlu tek sperm hücrelerinin hareketlilik desenleri araştırmak için (3D) gradyanlar16.

Yaklaşımımızda, kafesli amino asitlerin fotolizisini mikroakışkan cihazlar içinde uygulayıp, bir bakteri popülasyonunun kontrollü kimyasal darbelere karşı davranışsal tepkisini incelemek için, fotosalınım yoluyla neredeyse anında kullanılabilir hale gelir. Düşük büyütme (4x) hedefinin (NA = 0,13, odak derinliği yaklaşık 40 μm) kullanımı, hem binlerce bakterinin geniş bir görüş alanı (3,2 mm x 3,2 mm) üzerinde popülasyon düzeyindeki toplama tepkisini gözlemlemenizi hem de tek hücre düzeyinde hareket ölçümü sağlar. Bu yöntemin iki uygulamasını salıyoruz: 1) tek tip koşullardan başlayarak bakteri birikimi−dağılım dinamiklerini incelemek için tek bir kimyasal darbenin serbest bırakılması ve 2i) zaman değişen, mekansal heterojen kemoattractant koşullar altında bakteri birikimi dinamiklerini karakterize etmek için birden fazla darbenin serbest bırakılması. Bu yöntem deniz bakterileri Vibrio ordalii amino asit glutamat doğru kemotaksis yapan test edilmiştir17, ama yöntem geniş tür ve kemoattractants farklı kombinasyonları için geçerlidir, yanı sıra kemotaksis ötesinde biyolojik süreçler için (örneğin, besin alımı, antibiyotik maruzkalma, çoğunluk algılama). Bu yaklaşım, mikroorganizmaların gerçekçi ortamlardaki ekoloji ve davranışlarını niçin açıklığa kavuşturmayı ve geçici dinamik degradelerde gezinirken tek tek bakterilerin karşılaştıkları gizli dengeleri ortaya çıkarmayı vaat eder.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Tek Kimyasal-darbe Deneyi için Mikroakışkan Cihazın İmalatı

  1. Bilgisayarı destekli tasarım (CAD) yazılımını kullanarak kanalı tasarlayın ve fotoğraf maskesi oluşturmak için şeffaflık filmine yazdırın(Şekil 1A).
  2. Ustayı yumuşak litografi ile (temiz oda koşullarında) üretin.
    1. Temiz bir silikon gofret (4 inç) aseton ile hızlı bir şekilde art arda, metanol ve izopropanol, sonra azot kullanarak kuru. 5 dk için 130 °C fırında gofret pişirin.
    2. Gofret bir spin-coater merkezine yerleştirin ve gofret üzerine SU-8 photoresist dökün. 5 s üzerinden 500 rpm'ye kadar spin-coater hızını rampa ve 10 s. Rampa 10 s üzerinde son hıza kadar 500 rpm tutmak ve 30 s için bu hızda korumak.
      NOT: Son hızın tam değeri hedeflenen kaplama kalınlığına ve kullanılan SU-8'e bağlıdır.
    3. Spin kaplama işleminden sonra gofret 65 °C'de ve 95 °C'de pişirin. En az 5 dakika oda sıcaklığında (RT) gofret soğumasını bekleyin.
      NOT: Pişirme süresi hedeflenen kalınlığa ve kullanılan fotodirenç türüne bağlıdır. Genel bir kural olarak, her 100 μm tabaka için gofret 65 °C'de 5 dakika, 95 °C'de 45 dakika pişirilmelidir.
    4. Sadece ilgi alanının açığa çıkarve polimerize olmasını sağlamak için fotoğraf maskesini gofrete yerleştirin. SU-8 kılavuzunda önerilen süre boyunca UV ışığına maruz kanın.
      NOT: Burada, 350 nm dalga boyunda 200 mJ cm-2 pozlama enerjisi ile gofret 150 s.'ye maruz kalmıştır.
    5. SU-8 kılavuzunda önerilen süre için 65 °C ve 95 °C'de gofret pişirin.
      NOT: Genel bir kural olarak, her 100 μm tabaka için gofret 65 °C'de 5 dakika, 95 °C'de 45 dakika pişirilmelidir.
    6. Ana elde etmek için polimetil metakrilat (PMMA) geliştirici ile dolu bir beher içinde gofret batırın. Polimerize edilmemiş fotodirenç yıkandığından emin olmak için kabı hafifçe sallayın. SU-8 tabakasını daha fazla bağlamak için 200 °C'de ustayı pişirin.
  3. Elastomerile kürleme maddesi(Malzeme Tablosu)ile bir kabın 10:1 oranında (burada, 40 mL) birleştirerek bir polidimethylsiloxane (PDMS) karışımı hazırlayın. Sıvı homojen olana kadar şiddetle karıştırın.
    NOT: Karıştırma işlemi sırasında kabarcıklar oluşturulduğundan PDMS karışımı opak görünür.
    DİkKAT: Cildin potansiyel olarak tehlikeli kimyasallar veya biyolojik maddeile temas etmesini önlemek için, protokol boyunca her zaman bir laboratuvar önlüğü ve tek kullanımlık plastik eldiven giyin ve Malzeme'ye uygun özel güvenlik protokollerini uygulayın Güvenlik Veri Sayfası (MSDS).
  4. PDMS karışımını 45 dk.'lık bir vakum odasında RT'de gazlayın. İşlemi hızlandırmak için, arabirimde meydana gelen kabarcıkları patlatmak için vakumu periyodik olarak bırakın.
    NOT: PDMS karışımının tedaviye başlamasından korunmak için gaz giderme işlemi 1 saat içinde yapılmalıdır.
  5. Basınçlı bir temizleyici ile ana yüzeyinin tozunu çıkarın, sonra gazdan arındırılmış PDMS karışımını ananın üzerine dökün ve 80 °C'de 2 saat fırında pişirin.
    NOT: Alternatif olarak, 60 °C'de geceleme (veya en az 12 saat) pişirme aynı sertleştirilmiş PDMS elde edebilirsiniz.
  6. PDMS'yi mikroyapıların etrafında bir bıçakla kesin (yaklaşık 5 mm mesafede) ve ardından PDMS'yi anadan dikkatlice soyun.
  7. Mikrokanalın giriş ve çıkışı olarak hizmet vermek üzere delik açma (burada, bir giriş ve bir çıkış, Bkz. Şekil 1A). Özelliklerin bulunduğu PDMS'nin alt yüzüne hiçbir şeyin dokunmadığından emin olun.
    NOT: Protokol burada duraklatılabilir. Mikrokanal depolama sırasında toz ve diğer parçacıkların birikmesini önlemek için yapışkan bant ile kapatılmalıdır.
  8. PDMS mikrokanalını cam bir slayta bağlayın.
    1. Cam bir kaydırağı sabun, isopropanol ve deiyonize suyla iyice temizleyin. Cam ın kurumasını bekleyin veya süreci hızlandırmak için basınçlı hava kullanın.
    2. Yapışkan bantla dabbing ederek toz parçacıklarını çıkarın. 2 dakika boyunca her iki yüzeyi plazma ile (korona sistemi veya plazma oksijen odası kullanarak) tedavi ettikten hemen sonra, temiz cam kaydırak üzerindeki PDMS mikrokanalını bağlayın.
    3. Mikroakışkan cihazı 80 °C'de sıcak bir plaka üzerinde en az 1 saat ısıtarak camla olan kimyasal bağı güçlendirin.

2. Çoklu Bakliyat deneyi için 3D baskılı Milliakışkan Aygıtın Imalatı

  1. 3D tasarım yazılımı kullanarak 3B şekli tasarla ve yüksek çözünürlüklü 3D yazıcı(Şekil 1B)ile PDMS kalıp için ana yazdırın.
    NOT: Ana yı oluşturmak için kullanılan 3B yazıcı ve kalıp malzemesi için Malzeme Tablosu'na bakın.
  2. Adımları 1,3−1.4'ü tekrarlayın, ardından yapışkan bantla dabbing yaparak ana yüzeyini temizleyin. Bir ölçekte ana koyun, daha sonra, membran tarafından işgal edilecek ana merkezi bölge kaçınarak, ana yüksekliği eşleştirerek PDMS istenilen yüksekliği elde etmek için unred PDMS karışımı (burada, 23,4 g) tam miktarı dökün (burada, 0,5 mm). Basınçlı hava yardımı ile kalan kabarcıkları çıkarın.
  3. PDMS dökümen az 12 saat pişirin 45 °C'de bir fırında ana yerleştirin.
  4. 3D PDMS kalıbını Petri kabına bağlayın.
    1. Yavaşça sertleştirilmiş PDMS tabakası soyma ve bakteriyel süspansiyon enjeksiyonu için yumruk girişi ve çıkış delikleri(Şekil 1C).
    2. Petri kabının (90 mm x 15 mm) yüzeyini ve PDMS kalıbını 2 dk. oksijen plazmasıyla 2 dk. Petri kabına bağlayın. Kalıbı Petri kabına hafifçe bastırın, ancak bu durum sorgulama odasını çökertebileceğinden özelliklerin bulunduğu yere basın.
    3. PdMS 3D kalıbına bağlanmış Petri kabını 45 °C'de en az 12 saat fırında dondurun ve kimyasal bağı güçlendirin.
      NOT: Protokol burada duraklatılabilir.
  5. Membran yüzey işlevselleştirme18
    1. RT'de 1 dakika boyunca bir oksijen plazma odasında nanogözenekli polikarbonat (PCTE) membranı etkinleştirin.
      DİkKAT: Plazma aktivasyonu için korona sistemi kullanmaktan kaçının, çünkü membrana zarar verir.
    2. Kimyasal bir başlık altında, bir polipropilen tüp kullanarak, hacim (burada, 40 mL) ile% 1 deiyonize su 3-aminopropyltriethoxysilane (APTES) ticari bir çözelti seyreltmek.
      DİkKAT: APTES çözeltisi akut toksiktir (MSDS sağlık tehlike skoru 3) ve sadece eldivenli kimyasal başlık altında aşırı özenle ele alınmalıdır. APTES çözümünü işledikten hemen sonra eldivenleri değiştirin. APTES dumanları mukoza ve üst solunum yolları için yıkıcıdır. APTES'in hedef organları sinirler, karaciğer ve böbrektir. Bir duman kapağı yoksa, bir yüz kalkanı ve tam yüz solunum uygulanmalıdır.
    3. Seyreltilmiş APTES çözeltisini petri kabına aktarın ve aktif membranı 20 dakika boyunca APTES çözeltisindeki batırın.
    4. Membranı cımbızla APTES çözeltisinden çıkarın ve kuruması için temiz bir sile yerleştirin.
  6. Membran üzerinde yer alan ve bakteri alanının yıkanmasına izin verecek PDMS mikroakışkan kanalların imalatı için 1.1−1.7 adımlarını tekrarlayın.
  7. PDMS yıkama kanallarını işlevsel membrana bağlayın.
    1. 2 dakika boyunca hem PDMS yıkama kanalını hem de PCTE membranını oksijen plazma haznesi ile etkinleştirin.
      NOT: İki PDMS katmanı arasında sıkıştırılacak olan membran, PDMS yıkama kanalından daha küçük olmalıdır.
    2. Plazma tedavisinden hemen sonra, PDMS yıkama kanalına membranüzerine hafifçe basarak işlevsel membranı ve PDMS yıkama kanalını temasa getirin.
      NOT: Bu aşamada aşırı basınç uygulamayın, çünkü membranın kanalın çatısına bağlanmasına (geri dönülemez) bağlı olmasına ve kanalın tıkanmasına neden olabilir.
  8. İki PDMS katmanı arasında membran sandviç(Şekil 1E).
    1. Hem bağlı laminat PDMS yıkama kanalı−PCTE membranını hem de petri kabına daha önce 2 dakika oksijen plazma odası ile bağlanmış 3D PDMS kalıbını etkinleştirin.
    2. Petri kabını sandviç yapısına bağlı olarak 45 °C'de en az 12 saat fırında yerleştirin ve kimyasal bağı güçlendirin.
      NOT: Protokol burada duraklatılabilir.

3. Hücre Kültürü

  1. V. ordalii (12B09 veya 12B09pGFP) popülasyonu 2216 orta19'da 20 saat boyunca 30 °C'de bir orbital shaker (600 rpm) ve geç üstel fazda hasat hücreleri üzerinde bir gecede büyütün. pGFP barındıran izole için, plazmid korumak için spectinomycin (50 μg mL-1)ekleyin.
  2. 3 dk için 2500 x g'de 1 mL'lik bir hücre aliquot'u santrifüj edin, süpernatantı çıkarın ve filtrelenmiş yapay deniz suyunun 1 mL'inde hücreleri yeniden askıya alın. Bu adımı tekrarlayın.
  3. V. ordalii popülasyonuna 30 °C'de bir orbital shaker (600 rpm) üzerinde 3 saat aç.
  4. 4-methoxy-7-nitroindolinyl-kafesli-L-glutamat (MNI-kafesli-L-glutamat) 10 mM (burada, 1 mL) bir stok yapay deniz suyu çözeltisi hazırlayın ve -20 °C'de saklayın.
    NOT: Fotoluzun oluşmasını önlemek için MNIkafesli-L-glutamat çözeltisini ortam ışığından koruyun.
  5. 1 mM MNI kafesli-L-glutamat yapay bir deniz suyu çözeltisi aç hücreleri yeniden askıya alarak hücreleri 50x seyreltin.
    NOT: Bu, 5 x 107 mL-1'den daha düşük bir bakteri konsantrasyonu sağlayacaktır (tam değer genellikle ~109 mL-1olan geç üstel hücrelerin ilk konsantrasyonuna bağlıdır). Bakteri konsantrasyonu optik yoğunlukta (OD) 600 nm'lik bir spektrofotometre kullanılarak tahmin edilebildi.

4. Uncaging Protokolünün Kalibrasyonu

  1. MNI kafesli-L-glutamat20'lik yapay deniz suyu çözeltisinin damlacıklarını (20 μL) cam bir kaydırağa C0 = 10 mM konsantrasyonuna yerleştirin. Damlacık dairesel bir PDMS odası (çapı d = 5 mm, yükseklik h = 250 μm) ile kaplayarak kapsüllemek.
  2. Cam kaydırağı mikroskop aşamasına yerleştirin ve 20 ms'lik tüm hazneyi 4x nesnel (sayısal diyafram [NA] = 0,13) kullanarak 395 nm (güç 295 mW) dalga boyunda bir LED ışınına maruz bırakın.
  3. PDMS odasını açın ve UV-Vis spektrofotometre ile analiz için bir damlacık (1 μL) ayıklayın.
  4. 0,1 s, 0,5 s, 2,5 s, 25 s, 250 s (veya kimyasal reaksiyon doygunluğu kadar) ve 0 s (arka plan elde etmek için) LED aydınlatma farklı süreler için 4.1−4.3 adımları tekrarlayın. 4.1−4.4 yordam adımlarını en az 3x (burada, 4x) çoğaltın.
  5. Emme spektrumundan, kafes molekülü21'inemilim spektrumunda zirveyi temsil eden 405 nm değerindeki değeri ayıklayın. LED pozlama14ile kimyasal uncaging reaksiyonunun k oranını belirlemek için, deneysel verilerin sayısal uyumu için aşağıdaki birinci dereceden kinetik denklemi kullanın17
    figure-protocol-1
    c(t) çözeltisinin emilim spektrumunun değeri 405 nm (arka plan alındıktan sonra) t saniyesi açKınlama süresi ile. Kt 1 gibi küçük uncaging zaman t için, Eq. 1 doğrusal formülasyon basitleştirilmiş olabilir
    figure-protocol-2

5. Tek Kimyasal-darbe Deneyi

  1. PdMS içindeki gaz konsantrasyonunu azaltmak için mikroakışkan kanalı 20 dakika vakum altında saklar, böylece kabarcıkların dolum işlemi sırasında oluşma olasılığı daha düşüktür.
  2. Vakum pompası kanal ayıklayın ve hemen 1 mM MNI-kafesli-L-glutamat yapay deniz suyunda seyreltik bakteriyel süspansiyon tanıtmak yavaşça mekanik kesme kuvvetleri tarafından kamçı hasarını önlemek için bir mikropipet kullanarak mikrokanal içine (burada, tüm dolum işlemi 5-10 s sürdü). Bakteri süspansiyon ile kanal doldurduktan sonra, kağıt havlu ile aşırı çözüm emmek ve yavaşça deliklere basarak PDMS fişleri ile giriş ve çıkış mühür.
    NOT: Bu şekilde haznedeki sıvı akışı engellenir.
  3. Mikrokanalı bir mikroskop aşamasına yerleştirin ve orta kanalda görüş alanını ayarlamak için sahneyi hareket ettirin. 12 fps kare hızında faz kontrastı (4x hedef) görüntüleme gerçekleştirmek için mikroskop ayarlayın.
    NOT: Bu değer çeşitli olabilir, ancak görüntü analizi yoluyla bakteriyel yörüngelerin yeniden yapılandırılmasına izin vermek için 10 fps'den az olmamalıdır (bkz. protokol bölüm 7).
  4. LED ışınının iğne deliğini minimum diyafram açıklığına ayarlayın. Kameranın pozlama süresini 5 s'e ayarlayarak, LED ışınının mekansal konumunun ve boyutunun hassas ölçümlerini elde etmek için birkaç kare kaydedin.
    NOT: LED ışık kaynağı sıvı ışık kılavuzu bağlantısı ile mikroskobun epi-floresan aydınlatıcısına bağlanır. Led ışını video yakalamayı etkilemez, çünkü video edinimi ve LED stimülasyonu yazılım aracılığıyla bağımsız olarak yönetilir.
  5. Mikroskop yazılımı aracılığıyla (en büyük kimyasal darbe için 20 dakika) toplam 10 dakika boyunca sürekli görüntüleme yapın ve aynı anda istenilen süre boyunca (bu deneyde, t = 20 ms, 100 ms, 500 ms) kullanıcı tanımlı bir zaman noktasında (burada, video edinimi başladıktan 10 dakika sonra) 395 nm'de odaklanmış LED ışını etkinleştirin. Aynı işlemin birden fazla çoğaltma elde etmek için, mikroakışkan kanalın farklı konumları üzerinde bakteriyel yanıtı kaydetmek için sahne hareket ettirin. Yeni bir mikrokanal kullanarak her darbe boyutu için bu yordamı çoğaltın.
    NOT: Caging işlemi görüntüleme düzleminde radyal olarak dışa doğru yayılan bir eksenymmetrik silindirik darbe oluşturur.
  6. Bakterilerin tarafsız yüzme hareketini kaydetmek için daha yüksek bir kare hızında (50 fps) daha yüksek büyütme hızında (20x objective, NA = 0.45) kimyasal uncaging olmadan ayrı deneyler yapın.

6. Çoklu Kimyasal-darbe Deneyi

  1. 20 dakika vakum altında miliakışkan oda koruyun.
  2. Miliakışkan hazneyi içeren Petri kabını mikroskop aşamasına yerleştirin. Membranın altındaki odayı seyreltik bakteriyel süspansiyonla doldurun (burada, tüm dolum işlemi 10−15 s) GFP-floresan V. ordalii 1 mM MM MNI-kafesli-L-glutamat çözeltisi suni deniz suyunda. Bakteri süspansiyon ile kanal doldurduktan sonra, kağıt havlu ile aşırı çözüm emmek ve yavaşça deliklere basarak PDMS fişleri ile giriş ve çıkış mühür.
    NOT: Bu şekilde haznedeki sıvı akışı engellenir. Görüntülemenanogözenekli membran üzerinden meydana gelen bu kurulumda bakterilerin daha iyi görselleştirilmesi ne izin vermek için, kuvvetle yabani tip (tek kimyasal-darbe deneyde kullanıldığı gibi) floresan suşları kullanılması tavsiye edilir.
  3. Bir şırıngayı 1 mM MNI kafesli-L-glutamat lı yapay bir deniz suyu çözeltisi ile doldurun ve membranın üzerindeki yıkama kanalının giriş ve çıkışına boru takın.
  4. Boruyu bir atık haznesine bağlayın ve basınç salınımlarını önlemek için borunun sıvı atık haznesine tamamen batırDığından emin olun.
  5. Şırınga pompasına uygun akış hızını (burada, 50 μL dk-1)ayarlayın ve kanal geometrisine bağlı olan yıkama kanalında istenilen ortalama akış hızını elde edin.
  6. Membran üzerinde yıkama kanalında akış kurmak için şırınga pompası başlatın.
  7. Farklı konumlarda ve farklı yoğunluklarda kullanıcı tanımlı darbe dizileri oluşturmak için LED ışını ve mikroskop aşamasını kontrol eden yazılımı çalıştırın.
    NOT: Membranın üzerindeki yıkama kanalında 1 mM MNI kafesli-L-glutamat ın yapay deniz suyu çözeltisinin sürekli akışı kafesli bileşik çözeltiyi yeniler ve harcanan ortamı bakteriyel arenadan yıkar.
  8. Büyük bir yüzeyi kapsayacak şekilde birkaç saatlik bir süre içinde ve birden fazla bitişik konumda düzenli zaman aralıklarında 4x nesnel kullanarak video kaydedin (burada, 1 cm x 1 cm, Şekil 1F).

7. Görüntü Analizi ve Veri Analizi

  1. Bakteriyel yörüngelerin yeniden yapılandırılması
    1. 4x hedefi ile kaydedilen filmlerden, izleme yazılımı17kullanarak bakteriyel yörüngeleri yeniden.
      NOT: Bu yörüngeler mikrokanaldaki 3B bakteriyel hareketin 2B projeksiyonlarını temsil eder.
    2. Yeniden inşa edilen bakteriyel yörüngelerden, yüzme hızını kimyasal darbenin merkezine doğru yöne yansıtarak her yüzme bireyinin radyal sürüklenme hızını belirleyin(Şekil 2D). Radyal sürüklenme hızının spatio-temporal dinamiklerinin görselleştirilmesi için, uzamsal boyutu 75 μm x 75 μm ve 5−10 s aralığındaki zamansal pencere(Şekil 2D,E)olan bir binning ızgarası kullanın.
      NOT: Sürecin silindirik simetrisi nedeniyle, veriler kutupsal koordinatlarda analiz edilebilir ve açısal boyut üzerinden ortalama olarak(Şekil 3).
    3. Yeniden inşa edilen bakteriyel yörüngelerden, kimyasal darbelere tepki olarak bakterilerin dağılımının spatio-zamansal dinamiklerini belirleyin(Şekil 2E).
    4. Tek darbe deneyleri sırasında 20x hedefi ile kaydedilen yüksek çözünürlüklü filmlerden, kimyasal darbeye yanıt olarak yüzme hızının dağılımını ve bakteri popülasyonunun çalışma süresini ayıklayın(Şekil 4).
  2. Kemotaksis tamamlandıktan sonra bakteri popülasyonunun dağılım dinamikleri göz önünde bulundurularak bakteri difüzyon katsayısını tahmin etmek17 (burada, t > 300 s; Şekil 3).
  3. Stokes-Einstein denklemini uygulayarak glutamat difüzyon katsayısını tahmin edin
    figure-protocol-3
    amino asit moleküllerinin hidrodinamik yarıçapı22rGolan küresel parçacıklar olduğu varsayıldığı yerde, kB Boltzmann sabitidir (1,38 x 10-23 m 2 kg s-2 K-1), T sıcaklıktır (296 K) ve 23 °C'de yapay deniz suyunun dinamik viskozitesi (tuzluluk 36 g kg-1)23

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dinamik besin koşulları altında bakteri birikimi profillerini incelemek için mikroakışkan ve miliakışkan cihazları(Şekil 1)kullandık. Bakteriyel yörüngeler fotoliz tarafından salınan kimyasal darbesonrasında bakteri popülasyonunun birikim-dağılma dinamiklerinin faz kontrast mikroskobu ile elde edilen kaydedilen videolardan elde edilmiştir(Şekil 2 ve Şekil 3). Ortalama milyonlarca yörünge ile radyal sürüklenme hızı ve bakteri konsant...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu yöntem, araştırmacıların mikro ve miliakışkan cihazlarda kontrollü, dinamik degradeler altında bakteriyel kemotaksileri incelemelerine olanak sağlayarak tekrarlanabilir veri toplamayı mümkün kılmasını sağlar. Fotolisis tarafından mikro ölçekte kimyasal darbelerin yakın anında oluşturulması, örneğin, batan deniz parçacıkları25arkasında tüylerin diffüzive yayılması, ya da lysed fitoplankton hücrelerinden yayılan besin sinyalleri bir dizi doğada karşılaşma besin bakliyat türlerini yeniden üretmeyi...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar ETH Zürih'te Ilk mikrofabrikasyon tesisi teşekkür ederim. Bu çalışma Avustralya Araştırma Konseyi Discovery Early Career Researcher Award DE180100911 (D.R.B.), Gordon ve Betty Moore Marine Microbial Initiative Investigator Award GBMF3783 (R.S.) ve İsviçre Ulusal Bilim Vakfı bursu ile desteklenmiştir. 1-002745-000 (R.S.'ye).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
(3-Aminopropil) trietoksisilan (APTES)Sigma-AldrichA3648>% 98 saflık, oldukça toksik
CELLSTAR tüp GreinerBio-One21026150 ml
SantrifüjEppendorf5424Rbakteri kültüründen harcanan ortamı ortadan kaldırmak için
Dijital İnkübatörler Incu-LineVWR-CH390-03843D master
Duster pişirmek içinGofret ve mikrokanalları temizlemek içinVWR-CH16650-22
Mikrokanalları yapıştırmak içinsıcak plakaVWR-CH444-0601
İzopropanolSigma-AldrichW292907
LightSafe mikro santrifüj tüpleri
Mikrosantrifüj tüpüEppendorf301200861.5 ml
Mikroskop cam slaytVWR-CH631-1552
Mikroskop Nikon Eclipse TiENikon InstrumentsMEA53100motorlu kademeli
MNI-GlutamatTocris Bioscience1490>98 % saflık, ışığa duyarlı
Kalıp baskı ekipmanlarıStratasysObjet30 3D yazıcı
Kalıp baskı hizmeti3D Baskı StüdyolarıÖzelhttps://www.3dprintingstudios.com/
Nanodrop One UV-Vis SpektrofotometreThermo Fisher ScientificND-ONE-Wkafesi açmayı kalibre etmek için
NIS ElemanlarıNikon InstrumentsMikroskop Görüntüleme Yazılım
Fırın Venti-LineVWR-CH466-3516PDMS pişirmek için (zorlanmış konveksiyon ile)
Photoresist SU-8-3050MicroChem Corp.SU8-3050
Plazma odası ZeptoDiener ElektronikZEPTO-1Polikarbonat
membranSterlitechPCT04471000.4 & mikro; m gözenek boyutu, %19 açık alan, 24 & m kalınlık
Polietilen mikroboruBilimsel ÜrünlerBB31695-PE / 2ID x OD: 0.015 "x 0.043" / 0.38mm x 1.09mm
Polistiren Petri kabıVWR-CH25373-100alt yüzey (90 mm x 15 mm) miliakışkan cihazı bağlamak için
ÖlçekVWR-CH611-2605ağırlık PDMS karışımı
sCMOS kamera Andor ZylaOxford Instrumentsfaz kontrastı ve floresan mikroskobu için (maks. 100 fps)
Deniz tuzuInstant OceanÜrün No. SS1-160p
SolidWorks 2015Dassault Systemes SolidWorksKalıbı tasarlamak için kullanılır
Spectra X hafif motor395 nm içinLümen Rengi
Sylgard 184Dow Corning110-41-155PDMS Si Elastomer Kiti; kürleme maddesi
Şırınga (Luer-Lok)B Braun Omnifix4616308F
Şırınga İğnesiAganiA22810 ila 30 ml
Şırınga Pompası 11 Pico Plus EliteHarvard Aparatı70-4506Terumo Agani 23 ölçü 5/8 inç (16mm)
VeroGreyStratasysÇift Şırınga Pompası
Vortex-GenieScientific IndustriesSI-0236Kalıp Malzemesi
, Görüntü analizi ve bakteri takibi için Sigma-Aldrich Z688312 1,5 ml MATLAB Mathworks , , LED

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Armitage, J. P., Lackie, J. M. The biology of the chemotactic response. , Cambridge University Press. (1991).
  2. Azam, F., Malfatti, F. Microbial structuring of marine ecosystems. Nature Reviews Microbiology. 5 (10), 782-791 (2007).
  3. Buchan, A., LeCleir, G. R., Gulvik, C. A., González, J. M. Master recyclers: features and functions of bacteria associated with phytoplankton blooms. Nature Reviews Microbiology. 12 (10), 686-698 (2014).
  4. Whitesides, G. M., Ostuni, E., Takayama, S., Jiang, X., Ingber, D. E. Soft lithography in biology and biochemistry. Annual Review of Biomedical Engineering. 3, 335-373 (2001).
  5. Segall, J. E., Block, S. M., Berg, H. C. Temporal comparisons in bacterial chemotaxis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 83 (23), 8987-8991 (1986).
  6. Waite, A. J. Non-genetic diversity modulates population performance. Molecular Systems Biology. 12 (12), 895(2016).
  7. Stocker, R. Marine Microbes See a sea of gradients. Science. 338 (6107), 628-633 (2012).
  8. Ellis-Davies, G. C. R. Caged compounds: photorelease technology for control of cellular chemistry and physiology. Nature Methods. 4 (8), 619-628 (2007).
  9. Kaplan, J. H., Somlyo, A. P. Flash photolysis of caged compounds: New tools for cellular physiology. Trends in Neurosciences. 12 (2), 54-59 (1989).
  10. Ando, H., Furuta, T., Tsien, R. Y., Okamoto, H. Photo-mediated gene activation using caged RNA/DNA in zebrafish embryos. Nature Genetics. 28 (4), 317-325 (2001).
  11. England, P. M., Lester, H. A., Davidson, N., Dougherty, D. A. Site-specific, photochemical proteolysis applied to ion channels in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (20), 11025-11030 (1997).
  12. Fino, E. RuBi-Glutamate: Two-photon and visible-light photoactivation of neurons and dendritic spines. Frontiers in Neural Circuits. 3, (2009).
  13. Khan, S., Spudich, J. L., McCray, J. A., Trentham, D. R. Chemotactic signal integration in bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (21), 9757-9761 (1995).
  14. Sagawa, T. Single-Cell E. coli Response to an Instantaneously Applied Chemotactic Signal. Biophysical Journal. 107 (3), 730-739 (2014).
  15. Xie, L., Lu, C., Wu, X. L. Marine Bacterial Chemoresponse to a Stepwise Chemoattractant Stimulus. Biophysical Journal. 108 (3), 766-774 (2015).
  16. Jikeli, J. F., et al. Sperm navigation along helical paths in 3D chemoattractant landscapes. Nature Communications. 6, 7985(2015).
  17. Brumley, D. R., et al. Bacteria push the limits of chemotactic precision to navigate dynamic chemical gradients. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (22), 10792-10797 (2019).
  18. Aran, K., Sasso, L. A., Kamdar, N., Zahn, J. D. Irreversible, direct bonding of nanoporous polymer membranes to PDMS or glass microdevices. Lab on a Chip. 10 (5), 548(2010).
  19. ZoBell, C. E. The cultural requirements of heterotrophic aerobes. Journal of Marine Research. 4, 42-75 (1941).
  20. Canepari, M., Nelson, L., Papageorgiou, G., Corrie, J. E. T., Ogden, D. Photochemical and pharmacological evaluation of 7-nitroindolinyl-and 4-methoxy-7-nitroindolinyl-amino acids as novel, fast caged neurotransmitters. Journal of Neuroscience Methods. 112 (1), 29-42 (2001).
  21. Trigo, F. F., Corrie, J. E. T., Ogden, D. Laser photolysis of caged compounds at 405nm: Photochemical advantages, localisation, phototoxicity and methods for calibration. Journal of Neuroscience Methods. 180 (1), 9-21 (2009).
  22. Ribeiro, A. C. F. Mutual diffusion coefficients of L-glutamic acid and monosodium L-glutamate in aqueous solutions at T=298.15K. The Journal of Chemical Thermodynamics. 74, 133-137 (2014).
  23. Sharqawy, M. H., Lienhard, J. H., Zubair, S. M. Thermophysical properties of seawater: a review of existing correlations and data. Desalination and Water Treatment. 16 (1-3), 354-380 (2010).
  24. Nikon depth of field calculator. , Available from: https://www.microscopyu.com/tutorials/depthoffield (2019).
  25. Kiørboe, T., Thygesen, U. H. Fluid motion and solute distribution around sinking aggregates: II. Implications for remote detection by colonizing zooplankters. Marine Ecology Progress Series. 211, 15-25 (2001).
  26. Blackburn, N., Fenchel, T., Mitchell, J. Microscale nutrient patches in planktonic habitats shown by chemotactic bacteria. Science. 282 (5397), 2254-2256 (1998).
  27. Stocker, R., Seymour, J. R., Samadani, A., Hunt, D. E., Polz, M. F. Rapid chemotactic response enables marine bacteria to exploit ephemeral microscale nutrient patches. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (11), 4209-4214 (2008).
  28. Altindal, T., Chattopadhyay, S., Wu, X. L. Bacterial chemotaxis in an optical trap. PLoS ONE. 6 (4), 18231(2011).
  29. Zhu, X., et al. Frequency-Dependent Escherichia coli Chemotaxis behavior. Physical Review Letters. 108 (12), (2012).
  30. Baraban, L., Harazim, S. M., Sanchez, S., Schmidt, O. G. Chemotactic behavior of catalytic motors in microfluidic channels. Angewandte Chemie International Edition. 52 (21), 5552-5556 (2013).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Kimyasal PulslarMikrobiyal KemotaksiFotoliz Kafesli Amino AsitlerPDMS Mikroak kan OdaVibrio ordaliiUV Vis SpektroskopisiNanog zenekli PCTE MembranAPTES Plazma Ba lamaBilgisayar Kontroll LED PulslarBakteriyel Y r nge Analizi

İlgili makaleler