Yöntem makalesi

Arınma ve Caenorhabditis elegans Ekstrasellüler Veziküllerin Analizi

DOI:

10.3791/60596

⸱

31 Mart 2020

 ,  ,  ,  , 
1Department of Pathology, University of Washington

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu makalede, caenorhabditis elegans hücre dışı veziküller üretmek, arındırmak ve ölçmek için yöntemler sunar.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Küçük zara bağlı veziküllerin dış ortama salgıları tüm hücrelerin temel fizyolojik sürecidir. Bu hücre dışı veziküller (EVs) dokular arasında proteinler, nükleik asitler, metabolitler ve lipidler aktararak küresel fizyolojik süreçleri düzenlemek için hücre dışında işlev. EvV'ler menşe hücrelerinin fizyolojik durumunu yansıtır. EVs insan sağlığının hemen hemen her alanında temel rolleri var ima edilmektedir. Böylece, EV protein ve genetik kargolar giderek sağlık ve hastalık biyobelirteçleri için analiz edilmektedir. Ancak, EV alanında hala EV kargo kompozisyonu çalışma izin veren bir çekilebilir omurgasız model sistemi yoksundur. C. elegans EV araştırmaları için çok uygundur, çünkü aktif olarak vücudunun dışında, dış ortama eVs salgılar, kolay izolasyon izin. Bu makalede, bu çevreye duyarlı C. elegans EVs oluşturmak, arındırmak ve ölçmek için gerekli tüm bilgileri sağlar nasıl yaş senkronize solucanların çok büyük popülasyonları ile nicel çalışma dahil olmak üzere, EVs arındırıcı, ve doğrudan saflaştırılmış örnek bozulmamış EVs sayısını ölçen bir akış sitometri protokolü. Böylece, C. elegans araştırma için mevcut genetik reaktifler büyük kütüphane EV kargo bileşimi üzerinde genetik yollar ve fizyolojik süreçlerin etkilerini araştırmak için içine dokundu olabilir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Membrana bağlı ekstrasellüler (EVs) salgılanması aktif hücreler arasında belirli protein, nükleik asit, metabolit ve lipid kargoları taşıyarak küresel fizyolojik süreçleri kolaylaştırır1. Hücreler 2 μm veya daha büyük boyutlarda bir süreklilik kapsayan EVs salgılar 20 nm2kadar küçük. Küçük EVs (<200 nm) giderek metabolik bozukluklar, kanser, kardiyovasküler hastalık ve nörodejeneratif hastalıklar3dahil patolojik süreçlerde kendi sonucu nedeniyle çalışılır 3,4,5. Bu patolojilerin küçük EVs kargolarının protein ve genetik bileşimini etkilediği gösterilmiştir. Bu nedenle, patolojinin biyomarker imzaları giderek LC-MS-MS ve RNAseq6,7,,8,9gibi EV kargo keşif yöntemleri ile ortaya çıkarılmaktadır.

C. elegans evrimsel olarak korunmuş EV sinyal yollarını tanımlamak için yararlı bir omurgasız model olmuştur. Örneğin, bir C. elegans flippase ilk C. elegans embriyolarda EV biyogenezini indüklemek için gösterilmiştir, ve insan homolog insan hücrelerinde EV salınımını etkilemek için gösterilmiştir10,11. C. elegans EVs miğfonel gelişimi için gerekli Kirpi sinyalleri taşımak bildirilmiştir. Kirpi ve diğer morfojenlerin teslimat EVs önemli bir gelişimsel rol oynadığı gösterilmiştir, ve zebra balığı korunur, fareler, ve insanlar12,13,14,15. C. elegans ev biyomarker keşfi için uygundur çünkü hayvan-hayvaniletişimindeişlev gören eV'leri vücudunun dışında salgılar 16,17 (Şekil 1A). Ancak, nematodların E. coli besin kaynağı da EVs18salgıladığı için, bir önceki çalışma ile kurulan metodoloji kullanılamaz. Bu yöntemde, numunenin çoğu E. coli kontaminasyonundan oluşur ve C. elegans EV kargolarının keşfi için proteomik veya RNAseq yaklaşımlarının gücünü sınırlar. Burada açıklanan yöntemler, tipik hücre kültürü deneylerinin karakteristik bolluk düzeylerinde son derece saf C. elegans EVs sağlamak ve böylece EV biyomarker keşfi için omik yaklaşımları kolaylaştırmak için geliştirilmiştir.

Kargo analizi için yeterli sayıda EV üretmek için büyük solucan popülasyonlarına ihtiyaç vardır. Bu nedenle, gelişimsel senkronize C. elegans büyük popülasyonların nicel ekimi yapmak için yöntemler de dahildir. Tipik olarak, deneyler için çok sayıda solucangerektiğinde, sıvı ortamda kültürlenirler. Bu solucanların büyük popülasyonları üretmek için etkili olmakla birlikte, hayvanların fizyolojisi nematod büyüme orta (NGM) agar plakaları standart koşullar altında yetiştirilen solucanlar önemli ölçüde farklıdır. Sıvı içinde kültürlenen hayvanlar daha yavaş büyür, daha incedir, gelişimsel heterojenlik gösterir ve yüksek derecede toplu iş değişkenliğine maruz kalmaktadırlar. Bu nedenle, 10 cm yüksek büyüme plakaları kullanarak gelişimsel senkronize C. elegans büyük popülasyonların kantitatif ekimi için basit ama etkili bir araç salıyoruz. Yüksek büyüme plakalarının medya kompozisyonu normal NGM plakalarından daha fazla pepton içerir ve OP50'den daha sağlam büyüyen E. coli suşu NA22 ile tohumlanır.

Akış sitometri teknolojisindeki (FACS) gelişmeler, diğer yöntemlerde doğal sınırlamalar olmaksızın EVs'lerin sayısallaştırılmasına izin veren bireysel EVs20,21'indoğrudan analizini sağlamıştır. Farklı saflaştırma metodolojileri önemli ölçüde farklı EV-protein oranları22neden çünkü önceki çalışma protein EV bolluğu için yararlı bir proxy olmadığını göstermiştir. Son derece saf EV fraksiyonları nispeten az protein içerir, bca veya Coomassie jelleri ile örnekleri ölçmek zor hale. Batı analizi bireysel proteinlerin göreceli farklılıklarını belirleyebilir, ancak örnekte kaç ev olduğunu belirleyemez. EV sayısının nanopartikül izleme analizi ile sağlam bir şekilde ölçülmesi, dar sinyal-gürültü aralığı, EVs ve katı agregalar arasında ayrım yapamama ve farklı özelliklere sahip araçlar arasında yöntemlerin aktarılamaması ile engellenir23. Bu nedenle, bu makalede, evs ayrımcılık ve nicelleştirmek için genelleştirilebilir bir akış sitometrik yordamı da içerir.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Hazırlık

  1. 100 mL dH2O'ya 2 g jelatin ekleyin ve kaynamaya başlayana kadar mikrodalgafırında ısıtın. Sonra karıştırın ve 20 dakika soğumaya bırakın.
  2. Çözeltiyi 0,22 m'lik bir filtreden geçirin ve steril tüplere dağıtın. Pipet uçlarını, jelatin çözeltisini borulama ve dışarı atarak kullanmadan hemen önce jelatinle tedavi edin. İşlenmiş ipuçları hemen kullanılabilir veya saklanabilir.
  3. Steril bir kapak filtresinden membranı kesin.
  4. 5 μm naylon örgü kumaştan 20 cm kare islatve steril bir kapak filtresinin üst etrafına yerleştirin. Birkaç kalın lastik bantları ile güvenli.
    DİkKAT: Kırışıklık olmaması için kumaşı dikkatlice inceleyin. Bunlar emmeyi engelleyen hava boşlukları yapar.

2. Büyük Solucan Popülasyonlarının Hesaplanması (Şekil 1A)

  1. Girdap ve pipet 10 μL solucan süspansiyon bir solucan yetiştirme plakası kapağı veya cam slayt üzerine. Bu işlemi 3x tekrarlayın. Her damla hayvan sayısını kaydedin.
  2. Solucan süspansiyonunu her μL'de iki hayvana ayarlayın.
  3. Bir slayt veya plaka kapağında süspansiyon ve pipet dokuz damla (10 μL) girdap. Hayvanların sayısını elle sayın. Her damla hayvan sayısını kaydedin.
  4. Ortalamanın (S.E.M.) ortalama ve standart hatasını her solucan popülasyonunun yüzdesi olarak hesaplayın.
  5. Ortalama değeri 10 μL'ye bölerek ve daha sonra μL'deki solucan süspansiyonunun toplam hacmiyle çarparak her popülasyondaki toplam hayvan sayısını hesaplayın.

figure-protocol-1
Şekil 1: C. elegans EVs oluşturma, ölçme ve arındırma için prosedür genel bakışları. (A) Büyük hayvan popülasyonlarını sayma şeması. (B) EVs hasat için solucan üretmek için şematik. (C) EVs'i C. elegans supernatent'ten arındırmak için şema. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

3. EV Arıtma için C. elegans yetiştirme

  1. Gelişimsel senkronize C. elegansbüyük bir nüfus oluşturun. Bunu yapmak için aşağıdaki adımları izleyin.
    1. 6 cm normal büyüme medya plaka sıüzerine tek bir hayvan ekleyin. İki nesil boyunca kuluçka ve sonra iki yüksek büyüme orta plakalar üzerine hayvanları yıkayın.
    2. Solucanlar yiyeceği tüketene kadar kuluçkaya yat.
    3. Adım 1.4'te hazırlanan 5 μm naylon örgüile L1 solucanlarını filtreleyin. Vida kapağını steril şişeye yerleştirin, vakumu başlatın ve solucanları filtrenin üzerine dökün. Filtredeki solucan agregalarının üzerinde ortamın aynı hacmini geçirin.
    4. Solucanları ölçün ve toplam sayıyı hesaplayın (bkz. adım 2). Son zamanlarda açlıktan (<24 saat) yüksek büyüme plakası üzerinde yetişen solucanlar yaklaşık 80.000 L1 larvaile sonuçlanır.
    5. Centrifuge L1 larvaları 3 dk. Resuspend için 2.000 x g. ML başına ~ 100.000 hayvan a.
    6. Yüksek büyüme plakası başına ~50.000 hayvan yerleştirin. Hayvanları 20 °C'de gravid yetişkin olana kadar (yaklaşık 72 saat) yetiştirin.
    7. Gravid yetişkinleri standart yollarla ağartın ve embriyoların 2,5 g/mL kolesterol ile 10 mL S Bazal çözeltisinde yumurtadan çıkmasını bekleyin.
    8. L1 larvalarını ölçün (bkz. adım 2) ve sonra her yüksek büyüme plakasına 50.000 solucan ekleyin.
    9. Hayvanlar genç erişkin olana kadar 20 °C'de tabak yetiştirin.
  2. C. elegans'ı secretome üretimine hazırla.
    1. Her yüksek büyüme plakasına 50 μg/mL karbenicillin ile 15 mL steril M9 ekleyerek plakalardan solucanları yıkayın. Doymuş plakalar 5 dakika boyunca otursun. Sloshing kaçının. Her plakadan tamponu ayrı bir 50 mL konik tüpe dökün. Plaka başına toplam 45 mL tampon için yıkama adımını 2 kat daha fazla tekrarlayın.
    2. Solucanlar 15 dk. Decant supernatant razı olsun ve tüp için taze M9 tampon 50 mL ekleyin. Toplam 4x için tekrarlayın.
    3. % 30 sakaroz adım gradyan üstüne solucanlar float ve S Bazal çözeltisi24hayvanları kurtarmak .
      1. Solucanları 15 mL buz gibi 100 mM NaCl'de kısaca yeniden askıya alın, 15 mL buz gibi ` sakaroz ekleyin ve karıştırmak için ters çevirin. Cam pipet ile sakaroz karışımının üzerine 5 mL buz gibi 100 mM NaCl tabaka.
      2. 5 dk. Solucanlar için 1.500 x g santrifüj NaCl ve sakaroz arasındaki arabirimde yoğunlaşacaktır.
      3. Hayvanları arayüzden 50 mL'lik yeni bir konik tüpe yavaşça çıkar. 50 mL'ye S Bazal çözeltisi ekleyin. Solucanlar 5 dk yerleşmek için izin verin.
      4. Supernatant decant ve S Bazal çözeltitaze 50 mL ekleyin. Bunu en az 3x tekrarlayın.
    4. Adım 2'de açıklandığı gibi solucan sayısını ölçün.
    5. 2,5 g/mL kolesterol ve 50 μM karbenicillin içeren steril S Bazal çözeltisi ile solucanları μL başına bir hayvan yoğunluğuna geri alın.
    6. Numuneyi sekresyon üretimine hazırlamak için steril 2 L alt şaşkın bir şişeye 400 mL'ye kadar süspansiyon ekleyin.
    7. Şişeleri dairesel rotatöre 20 °C'lik bir kuluçka makinesine 100 rpm'de 24 saat boyunca yerleştirin.

4. EV Arınma

  1. Hasat ve fraksiyon
    1. 2L solucan şişesini kuvözden çıkarın ve 50 mL konik şişedeki hayvanları peletleyin (2 dk için 500 x g).
    2. Herhangi bir partikül enkaz kaldırmak için 0,22 μm vakum filtresi ile supernatant dökün.
      NOT: Bu noktada, salgı ve zikülleri içeren filtrelenmiş supernatant -80 °C'de saklanabilir.
    3. 2. adımda açıklandığı gibi hayvan sayısını sayın.
    4. Bir bakteri çim üzerine askıya solucanlar bir damla yerleştirerek solucanların canlılığını belirleyin. 15 dakika bekleyin ve sonra hareketli, felçli veya ölü olarak puan hayvanlar.
    5. Rejenere nitroselüloz 10 kDa filtre üniteleri kullanarak 0,22 μm filtrelenmiş süpernatant'ı 700 μL'ye kadar yoğunlaştırın. Filtre ve girdap üzerinde 150 μL S Bazal çözeltisi ve ardından pipet ekleyin. Tekrar 2x.
    6. Konsantre süpernatantı 4 °C'de 20 dk için 18.000 x g'de santrifüj edin ve süpernatantı yeni bir tüpe aktarın. Bu adım, taşıma sırasında birikmiş olabilecek olası enkaz veya daha büyük parçacıkları kaldırır.
    7. Proteaz inhibitörü kokteyl + ÜRETICInin talimatlarına göre EDTA ekleyin.
      NOT: Bu noktada sekretom ve vezikülleri içeren konsantre supernatant -80 °C'de saklanabilir.
  2. Boyut dışlama kromatografisi
    1. Boş bir yerçekimi akış sütunu kartuşuna 80-200 m agarose reçine (küresel proteinler için 70.000 ila 40.000.000 kDa gözenek boyutu fraksiyonu aralığı) dökün. Reşat yatağı 10 mL'lik son bir hacimde paketlenene kadar Akış S Bazal çözeltisi.
      NOT: Kolon kartuşuna çok fazla reçine dökülürse, sütunun üst kısmını dağıtın ve fazlalığı pipetle çıkarın.
    2. 40 mL steril filtrelenmiş S Bazal çözeltisini kolondan geçirin ve yerçekimi altında akmasını bırakın.
      DİkKAT: Resenin rahatsız olup olmadığını kontrol edin.
    3. Arabellek reçine üst batırılmış değil kadar akışı ve sonra sütun kartuşun alt kapağı sağlar. Sütunun altına bir toplama tüpü yerleştirin.
    4. Kartuşun üzerine yerleştirilen kapağı çıkarın. Adım 2.1 damla akıllıca elde edilen konsantre sekretomu sütun yatağının üstüne ekleyin. Pipet 1 mL S Bazal çözeltisi damla akıllıca. Sütunun altına yeni bir toplama tüpü yerleştirin.
    5. Reçinerahatsız etmemek için üst kolon haznesini 5 mL S Bazal çözelti ile yavaşça doldurun. Eluate ilk 2 mL toplamak sonra hızlı bir şekilde tüpleri değiştirmek ve sonraki 4 mL toplamak. Bu, EVs için zenginleştirilmiş kesir.
    6. Eluate'yi 300 μL'ye rejenere nitroselüloz 10 kDa moleküler ağırlık kesme (MWCO) filtre ve düşük bağlayıcı mikrosentrifuge tüpüne retentate ile yoğunlaştırın.
    7. Filtre membranını 20 s'lik girdap ve tamponu filtre boyunca borulayarak 100 μL S Bazal çözeltisi ile yıkayın. Son hacmi 500 μL için ilk örneğe ekleyin.
    8. Üreticinin talimatlarına göre proteaz inhibitörü kokteyli ekleyin.
    9. Downstream deneylerini hemen gerçekleştirin (RNAseq, LC-MS-MS, GC-MS-MS, Western, FACS, vb.) veya -80 °C'de saklayın.

5. EV Bolluğunun Akış Sitometri Niceliği

  1. Boya hazırlama
    1. Taze DMSO kullanarak 10 mM'lik DI-8-ANEPPS stoku hazırlayın. 10 μL aliquots içine dağıtın ve -20 °C'de saklayın.
    2. 10 μL boya stokuna sahip bir tüpe 90 μL steril filtreli PBS ekleyerek 1 mM çalışma çözümü hazırlayın.
  2. Deneysel numune hazırlama
    1. Mikrosantrifüj tüpüne 840 μL S Bazal çözeltisi ekleyin. Daha sonra bölüm 4.2 ve girdap oluşturulan saflaştırılmış EVs 60 μL ekleyin.
    2. Aliquot 300 μL numune iki yeni mikrosantrifüj tüpler içine. Artık her biri 300 μL seyreltilmiş EVs içeren üç tüplü deneysel bir set bulunmaktadır. Tüpleri #1-3 etiketle. numuneler #2 ve #3 5.1.2'de hazırlanan DI-8-ANEPPS stokunun 7 μL'sini ekleyin. Daha sonra tüp #3 %1 Triton-X 100'ün 7 000'ini ekleyin. Girdap tarafından her tüp karıştırın.
    3. Sonicate örnek #3 numunenin ortasına sonicator ucu yerleştirerek ve % 20 güç% 30 görev döngüsü nde 10 kez zonklama.
      DİkKAT: Sonik probun ucunun numunenin ortasında olduğundan emin olun, böylece köpük üretimi minimumda tutulur. Köpük, EV'lerin biraraya getirmesine neden olarak numuneyi tehlikeye atabilir.
    4. İki mikrosantrifüj tüpüne 300 μL S Bazal çözelti ekleyin. 5.1 adımda hazırlanan DI-8-ANNEPS çalışma reaktifinin 7 μL'sini ikinci tüpe ekleyin ve "Yalnızca Boya" etiketini etiketlendirin. Diğer tüpü "Yalnızca Arabellek" olarak etiketlendi.
      NOT: Yalnızca Boya ve Tampon'u hazırlayın Sadece kontrol örneklerini ve deney örneklerini aynı S Bazal kaynağı ile hazırlayın.
    5. Numuneleri doğrudan ışıktan uzakta ve oda sıcaklığında 1 saat kuluçkaya yatırın.
  3. FACS denemeleri gerçekleştirin.
    1. FACS uyarma filtresini 488 nm (mavi) ve emisyon filtresini 605 nm (turuncu) olarak ayarlayın. Akış hızını dakikada 1,5 μL olarak ayarlayın.
    2. Run nanobead FACS kalibrasyon karışımı (isteğe bağlı ama önerilir).
    3. Her numuneyi bir FACS makinesinde 3 dakika (180 sn) çalıştırın. Saniyeler içinde tam çalışma sürelerini not edin.
  4. FACS verilerini analiz edin.
    1. DOSYALARı FACS çözümleme yazılımı ile açın.
    2. Açılan menüden seçerek Eksen'etıklayarak Y eksenini 488-Org (Alan) olarak değiştirin.
    3. Arsanın üst kısmından başlayarak, SALS seviyesi 102 ila 104 (<300 nm ölçekli parçacıklar) arasında değişen dikdörtgen bir kapı ayarlayın. Toplam olayların %2,5'ini içerene kadar geçidi aşağı doğru genişletin. "DI-8-ANEPPS+" olaylarını adlandırın.
  5. Örnek EV bolluğunun ölçülmesi
    1. Bu kapıyı kopyalayın ve yalnızca Arabellek ve Boya denetimleri gibi deneysel setinizdeki diğer iki örneğe yapıştırın. Çözümlemesi bir elektronik tabloya dışa aktarın.
    2. FACS örnekleri önerilen 3 dakika (180 s) için çalıştırılmazsa, örnekteki tüm olay sayılarını 180'lik olaylara normalleştirin. Örneğin, bir örnek 250 s için çalıştırıldıysa, DI-8-ANEPPS+ olay numarası 250 s/180 s ölçeklendirilir.
    3. Boya'daki DI-8-ANEPPS+ olaylarının sayısını örnek #2 yalnızca denetimden çıkararak boya arka plan olaylarını kaldırın.
    4. Örnek #1 DI-8-ANEPPS+ olayı sayısını çıkararak arka plan olaylarını kaldırın.
    5. Örnek #3 DI-8-ANEPPS+ olaylarının sayısını çıkararak deterjana duyarsız olayları kaldırın. Bu değer iyi niyetli EVs sayısıdır.
    6. 5.5.5 adımda hesaplanan değeri, 5,5,5'te hesaplanan değeri, 5.3'te açıklandığı gibi analiz edilen hacimle bölerek ve seyreltme faktörüyle çarparak (2.5 adımda açıklandığı gibi 10x) eV sayısını hesaplayın. Bu değeri EV hazırlığında kalan μL sayısıyla çarpın. Bu, akış aşağı analizi için kullanılabilir EVs sayısıdır.

figure-protocol-2
Şekil 2: EV bolluğunu ölçmek için akış sitometri örnek leme şeması. (A) EV hazırlığı üç özdeş örne ayrılır. Örnek # 1 No Boya negatif kontrol. DI-8-ANEPPS daha sonra numunelere #2 ve #3 eklenir. Triton-X 100 daha sonra örnek #3 eklenir. Yeşil ok, yalnızca örnek #3 sonradan sonicated olduğunu gösterir. Akıştan elde edilen veriler, FACS numunelerinde deterjana duyarlı EV'lerin mutlak sayısını belirlemeye ve toplam hazırlıktaki EV bolluğunu hesaplamaya yardımcı olur. Boya-pozitif olayları belirlemek için kapı, boya içermeyen örnek #1 ile ayarlanır. Elektronik tablo verilerindeki kırmızı yazı, deterjanla işlenmiş örnekteki boya pozitif olayların boya ile örnekten çıkarıldığını göstermek içindir. (B) FACS analiz edilen örnekteki EVs'lerin ölçülmesi ve örnekteki toplam EVs sayısının hesaplanması için denklemler. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

EVs oluşturmak ve arındırmak için gerekli süreçler için bir şema Şekil 1'degösterilmiştir. Her adımı tamamlamak için gereken tipik süreler aşağıda gösterilmiştir. Şekil 2, DI-8-ANEPPS(Şekil 2A)kullanarak FACS analizi için numune hazırlama şemasının yanı sıra bir numunedeki toplam EVs sayısını tahmin etmek için gerekli hesaplamaları göstermektedir(Şekil 2B).

10 biyolojik kopyanın temsilsonuçları Şekil 3A'dagösterilmiştir. Çoğaltmalar arasındaki değişkenlik önemli değildir ve popülasyon büyüklüğünün tipik S.E.M. 'un biraz üzerindedir(Şekil 3B). Solucanların filtrelenmesi ve taze yüksek büyüme plakaları üzerinde ekim bleach senkronizasyon için uygun gravid yetişkin büyük bir nüfus yaratacaktır. Her gravid yetişkin yaklaşık 10 yumurta içerecektir, çünkü bu şekilde işlenmiş tek bir açlıktan plaka 1 x 106 veya daha fazla senkronize döl deneysel bir popülasyon üretebilir. Yaşlı hayvanlardan EV elde etmek için yumurta ve larvaları 40 μm'lik bir filtreden filtreleyerek büyük gelişimsel senkronize popülasyonpopülasyonları korumak mümkündür. Korunan yetişkinler, tabak başına 20.000 hayvan yoğunluğuyla taze yüksek büyüme plakalarına aktarılır. Bu işlem her 2 günde bir tekrarlanır. Şekil 3C, solucan popülasyonlarının üç plaka transferi boyunca taşınan üç biyolojik kopyayı göstermektedir. Hayvanların plakalar arasında aktarılması yaklaşık hayvan kaybına neden olurken(Şekil 3C)hayvanların yaklaşık 'si sakaroz yüzdürme adımında kaybolur(Şekil 3D).

figure-results-1
Şekil 3: EV analizi için C. elegans büyük popülasyonların sayısallaştırılması. (A) Yakın zamanda aç olan tek bir (<24 saat) yüksek büyüme plakasından izole edilen L1 larva evre solucanlarının sayısının karşılaştırılması. 10 biyolojik kopyanın her birinin değerleri çizilmiştir. 10 çoğaltmadaki tüm veri noktalarının toplamı da S.E.M. ile bir keman çizimi ve bar olarak sunulur. Bu son zamanlarda açlıktan solucanların tek bir tabak ~ 80.000 L1 larva sahne solucanları verecektir gösterir. (B) A panelindeki 15 farklı plaka popülasyon ölçümünün S.E.M. bireysel nokta olarak çizilmiştir. Genellikle S.E.M. 'dan biraz daha büyüktür. (C) Her 4 saatte bir plakalar arasında iki transferden sonra solucan popülasyonlarının üç biyolojik kopyaları tahmin edilebildi. Hayvanların plakalar arasındaki bu transferi nüfus büyüklüğünde önemli bir azalmaya yol açmadı. Bu, solucanların taşınması için burada sunulan metodolojinin önemli bir hayvan kaybına yol açmadığını göstermektedir. (D) Üç EV deneysel kopyaları boyunca alınan popülasyon ölçümleri: Deneyi başlatan orijinal L1 larvaları için tahmin edilen hayvan sayısı, sakaroz şamandırasından kurtarılan ve 24 saat kuluçka dönemine hazır olan genç yetişkin hayvan sayısı, salgının geri kazanımı üzerine EV hazırlığından sayılan hayvan sayısı. L1 larva evresinde ilk popülasyon tahmini ile daha sonra hayvanlar genç erişkinler olduğunda popülasyon büyüklüğünde küçük ama önemli bir azalma vardır. Ortalama L1 popülasyon ölçümü 0 olarak belirlenmiş ve diğer tüm ölçümler bu değere göre ölçeklendirildi. Hata çubukları S.E.M. * = p değeri < 0.05, N.S. = parametrik eşleştirilmiş bir t testinde önemli değildir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Protein-hayvan oranı, EV preparatLarını karakterize etmek için yararlı bir metriktir. Bu metrik, EV preparatları arasındaki tutarlılığı belirlemek için hızlı bir araç sağlayabilir. Ortalama olarak, 1.000 yabani tip genç yetişkin hayvan çevrelerine 10 kDa'dan daha büyük proteinlerin 1 μg salgılar(Şekil 4A). Bu fraksiyon boyut dışlama kromatografisi ile daha da ayrıldığında, toplam protein elüsülasyon profili 2-6 mL arasında küçük bir protein tepe ve 8 mL sonra büyük bir tepe gösterir. EV'ler sütunun ilk 5 mL'sinde bulunur (Şekil 4B). Nanopartikül izleme analizi sütun eluate ilk 5 mL küçük, ~ 150 nm EVs(Şekil 4C)bir monodisperse nüfus içerir. Boyut dışlama fraksiyonlarının iletim elektron mikroskobu, eluate'nin 2-6 mL fraksiyonunda bol miktarda ev'leri ortaya çıkarır, ancak daha sonraki eluat hacimlerinde ortaya konulmaz. EvV'ler fincan benzeri şekilleri ile bilinir ler ve bu nedenle negatif boyama koşulları altında hazırlandığında parlak noktaları delinmiş gibi görünen katı parçacıklardan ayırt etmek kolaydır(Şekil 4D).

figure-results-2
Şekil 4: C. elegans EVs'in toplam salgılanan biyokütleden arındırılaması. (A) 10 kDa'dan büyük toplam proteinlerin 10 biyolojik kopyaya hazırlık ta kuluçkaya yatan solucan sayısına oranı çizilmiştir. Preparatların çoğunda 1000 hayvan başına 1 0g protein bulunuyordu. (B) Konsantre sekretom1 mL ile yüklenen 10 mL reçine kolondan protein elüsyonu profili. Daha ileri analizlerde birleştirilmiş kesirler gruplara ayrılır. (C

figure-results-3

figure-results-4

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

EV alanının temel bir sorun EV alttürleri2 geniş bir yelpazede ayıran. Burada açıklanan yöntemler, ~100 nm EVs daha önce fizyolojik olarak ilgili iletişim yolları16dış ortama ve fonksiyon içine salgılanan gösterilmiştir, çünkü küçük EVs saf bir nüfus oluşturmak için filtrasyon, diferansiyel santrifüj ve boyut dışlama kromatografi kullanın. Boyut dışlama kromatografisi ile saflaştırılan EVs hala ekzozomlar ve küçük mikroveziküllerin bir karışımı olabilir, çünkü bu EV alt sınıfları benzer büyüklüktedir. Omurgalı EV alt sınıfları genellikle immünoprepitasyon ile ayrılır, çünkü bu yöntem evs selektif membran protein belirteçleri bağlama yoluyla izole. Açıklanan yöntemler C. elegans EV membran marker proteinlerinin belirlenmesini kolaylaştırmaktadır. Bu nedenle, gelecekte benzer immünopredipredasyon yöntemleri ile küçük EV alt sınıfları daha fazla ayırmak mümkün olabilir. Teorik olarak, immünoyağış iyi beslenen solucanlardan EVs izole edebilir çünkü E. coli EVs antikor ile etkileşime girmemelidir. Daha büyük EV alt sınıflarının (>200 nm) protein ve genetik yüklerini belirlemek isteyen araştırmacılar, bunu 0,22 μm filtrasyon adımını atlayarak ve daha sonra süpernatant yerine peleti analiz ederek yapabilir. Büyük EV'lerin protein ve genetik yük bolluğunun ortaya çıkarılması, C. elegans secretome ile işleyen fizyolojik süreçlerin daha kapsamlı bir şekilde anlaşılmasını sağlayacaktır. C. elegans EVs çevreye salgılanmanın yanı sıra dokular arasında dahili olarak aktarılır. Bu nedenle, bu yöntemler sadece toplam C. elegans EVs bir alt kümesi izole. Ancak, EV'leri lysed solucanlardan ayırmanın bir yöntemi olmadığı için dahili EV'lerin kargo keşfi mümkün değildir. Bu harici salgılanan EV alt kümesinin kargo analizi, dahili EV'leri de etiketleme yeteneğine sahip potansiyel genel EV protein belirteçlerini belirlemek için bir araç sağlar.

EV hazırlığının ölçeği deneyin taleplerine bağlıdır. Toplam 500.000 genç yetişkin, akış sitometrisi, LC-MS-MS ve RNAseq analizini paralel olarak yürütmek için yeterli SAYıDA EV sağlamaktadır. Bu sayı, deneysel ihtiyaçlar bağlı olarak yukarı veya aşağı ölçeklendirilebilir. Ölçekleme için en büyük pratik faktör 10 cm yüksek büyüme plakaları gerekli sayısıdır. 500 μL 20x konsantre gecede NA22 kültürü ile hazırlanan yüksek büyüme plakaları, L1 larva aşamasından yetişkinliğin ilk gününe kadar ~50.000 yetişkinin nüfusunu destekleyecektir. Bu nedenle, 500.000 yetişkin ile bir deney yapmak için, 13 yüksek büyüme plakası gereklidir: L1s nüfusu oluşturmak için bir plaka, ağartma için yetişkinler oluşturmak için iki plaka, ve deneysel hayvanların büyümesi için 10 plaka. Bu ölçümler, yüksek büyüme plakalarının tohumlama ve bakteriyel büyüme koşullarına bağlıdır. Bu nedenle, standart bir şekilde tüm plakalar yapmak ve daha sonra hayvanların bilinen miktarlarda kalibre önerilir.

Solucanlar yetiştirme işlemi sırasında iki aşamada sayılır: 1) plakalar üzerinde solucanlar tohumlama önce ve 2) şartlı ortam oluşturmadan önce. Hayvanyetiştiriciliği yoğunluğu davranış, geliştirme ve stres yanıtları15,16,,17,18 ve bu nedenle, aynı zamanda EV kargoları etkileyebilir etkisi gösterilmiştir. Bu nedenle, tutarlı yetiştirme yoğunluğu için solucan popülasyonlarını doğru bir şekilde tahmin etmek gerekir. Solucan sayısının dokuz damlada ölçülmesi, nüfus tahminlerinin istatistiksel güvenini verir. Her damlayı ayrı ayrı tedavi etmek, her damla arasında girdap ve solucan süspansiyon içine aynı mesafe pipet ekleyerek esastır. Bu önlemlerin alınması, toplam nüfusun ~%5-10'unun S.E.M. değerlerini sağlayacaktır. Eğer bir solucan popülasyonu için S.E.M. %20'den fazlaysa, o zaman bir şeyler ters gitti demektir.

24 saat bakterisiz kuluçka döneminden sonra, genç, yabani tip C. elegans hemen bir bakteri çim ek olarak sürün. Bu, kuluçka nın sağlıklarını ciddi şekilde etkilemediğini gösterir. Ancak, bu adım hayvanların fizyolojisini etkiler ve bu nedenle EV kargolarının bileşimi etkileyebilir. Bu nedenle, çok hasta genotipler veya yaşlı hayvanlarla çalışırken, kuluçka adımından sonra canlılığı kontrol etmek esastır. Eğer tüm hayvanlar kuluçkadan sağ çıkamazsa, o zaman deneysel popülasyon boyutunu artırın ve kuluçka süresini kısaltın. Büyük hacimlerde klimalı ortamla çalışırken, yeniden üretilen nitroselülozdan yapılmış bir filtreile karıştırılmış hücreli konsantratörü kullanmak daha pratiktir. EVs diğer filtre türleri14gibi güçlü olarak bu filtre kimyası bağlamak yok.

Şartlı ortamdan elde edilen toplam proteinin, hazırlık yapmak için kuluçkaya yatan hayvan sayısına oranı yararlı bir ölçümdür. Bu oran beklenenden çok daha yüksekse, popülasyon tahminlerinin kapalı olması veya hayvanların şartlı ortamda ölmüş ve bozulmuş olması mümkündür. Bu oran beklenenden çok daha düşükse, konsantrasyon işlemi sırasında filtrelerde bazı proteinler kaybolmuş olabilir. FACS yöntemleri hazırlık aşamasında Ev'leri doğrudan ölçse de, bu ölçüm işlemin başlarında örnek anomalileri vurgulayabildiği için yararlıdır. EV hazırlığının kalitesini doğrulamak için kullanılan bir diğer yararlı yöntem de Şekil 4D'degösterildiği gibi iletim elektron mikroskobudur. İletim elektron mikroskobu protokolü uzunluk nedeniyle bu yöntem makalesinde resmi olarak yer almasa da standart yöntemlerle yapılabilir. Ev preparatlarının kalitesini değerlendirmek için FACS'ye ücretsiz bir yöntem olarak, en azından başlangıçta bu tür analizlerin yapılması önerilir. En iyi sonuçlar için taze deşarj formvar-karbon ızgaraları kullanın ve uranyl asetat yerine% 2 fosfotungstik asit ile örnekleri leke.

DI-8-ANEPPS, insan biyopsisi örnekleri ve lipozomlar25ile diğer genel EV boyaları daha iyi performans, kantitatif etiket EV membranlar gösterilmiştir çünkü seçildi . Ölçümler, her örnek için toplama süresi sadece 3 dakika alarak, hızlıdır. Deterjana duyarlı EVs'lerin nicelliği doğrudan işlevsel öneme sahiptir, çünkü EVs ve katı lipoprotein agregaları arasındaki temel fiziksel ayrımdan yararlanır. Daha da önemlisi, bu yöntem toplam protein miktarından veya EV dışı agrega sayısından etkilenmez ve bu nedenle farklı arıtma yöntemleri yle elde edilen EVs'leri tarafsız bir şekilde ölçebilir. Burada tanımladığımız FACS onaylı EV ölçümü, arıtılmış EVs'lerin fizyolojik etkilerini gösteren çalışmalar için özellikle yararlı olacaktır. Ayrıca mutlak EV bollukları doğrudan çalışmalar arasında karşılaştırılabilir böylece evrensel bir metrik olarak bir FACS metodolojisi kurmak için genel olarak EV alanında yararlanabilir. Vital boyalar da C. elegans EVs etiketleyebilir, ancak Di-8-ANEPPS ile etiketlenmiş EVs kadar parlak değildir.

Bu arınma yaklaşımı, bozulmamış, yaşayan solucanların vücutları dışında EV'lerin aktif salgılanmasından yararlanılır. Bu, C. elegans EVs hücre kültüründen olarak karşılaştırılabilir saflık ve bolluk izole edilmesine izin verir, LC-MS-MS ve RNAseq analizi26ile protein ve RNA kargoları yüzlerce tanımlamak için yeterli özellikleri. Böylece, C. elegans araştırma için mevcut reaktifler büyük kütüphane EV kargo bileşimi üzerinde genetik ve fizyolojik tedirginlik etkisini araştırmak için kaldıraçlı olabilir.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar hiçbir rakip çıkarları beyan.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nick Terzopoulos'u solucan plakaları ve reaktifler için minnetle kabul ediyoruz; N2 nematod hattı için NIH Araştırma Altyapı Programları Ofisi'ndeki (P40 OD010440) Caenorhabditis Genetik Merkezi (CGC); Lucia Vojtech, Doktora, nanopartikül izleme analizi ile yardım için; Jessica Young, Doktora, ve Marie Claire, MD, Doktora, hiPSC türetilmiş nöronal şartlı hücre ortamı için; Wai Pang TEM görüntüleme ile ilgili yardım için. Bu çalışma NIH hibe P30AG013280 tarafından MK ve NIH hibe AG054098 JCR tarafından desteklenmiştir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
0.22 μ m filtre üniteleriGenesee25-233Şartlandırılmış ortamı döküntülerden arıtmak için
% 1 Triton X-100ThermoFisherHFH10EV'leri parçalamak için bunu% 0,05'e ekleyin
10 cm yüksekliğinde büyüme plakalarıN/AN/ABüyük solucan popülasyonları yetiştirmek için
2 L alt şaşkın şişelerThermoFisher4110-2000PKEV'lerin boyut dışlama ayrımını yapmak için
40 μ m meshAmazonCMY-0040-C/5PK-05Yetişkin solucanları larva aşamaları 5 & mu'dan ayırmak için bunu kullanın
; m meshAmazonCMN-0005-CL1'leri diğer solucan aşamalarından ayırmak için bunu kullanın
6 cm normal büyüme ortamı solucan yetiştirme plakasıN/AN/AKüçük solucan popülasyonlarını yetiştirmek için
Amicon Ultra-15 Santrifüj Filtre 10 kD mwcoMilliporeSigmaC7715Boyut dışlama elute'u yoğunlaştırmak için
Amicon Ultra-4 Santrifüj Filtre 10 kD mwcoMilliporeSigmaC78144Şartlandırılmış ortamı konsantre etmek için
Apogee A50 akış sitometresiApogeeBu akış sitometresi, nanometre boyutundaki parçacıkları çözmek için uzmanlaşmıştır
ApogeeMixApogee1493FACS'ın ışık saçılımını ve floresan performansını değerlendirin
DI-8-ANEPPSThermoFisherD3167EV'leri etiketlemek için bunu 20 uM'de ekleyin
Tek kullanımlık kromatografi SütunuBioRad7321010EV'lerin boyut dışlama ayrımını yapmak için
GeletinMilliporeSigmaG9391-100GSolucanların yapışmaması için pipet uçlarını tedavi etmek için
HALT proteaz inhibitörüThermoFisher87785Protein bozulmasını önlemek için EV örneğine ekleyin
Düşük protein bağlayıcı toplama tüpleriThermoFisher90410EV numuneleri NaCl için bunları kullanın
SigmaS7653-1KGSolucanların sakaroz yüzdürülmesi için
S Bazal tamponN/AN/A WormBook
Sepharose CL-2B reçinesindeMilliporeSigmaCL2B300-100MLEV'lerin boyut dışlama ayrımını yapmak için
Küçük orbital çalkalayıcıABC Scientific83211301Bunu solucan S Bazal inkübasyon için kullanın
SükrozSigmaS8501-5KGSolucanların sakaroz yüzdürülmesi için
çözeltisi Reçete

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Maas, S. L. N., Breakefield, X. O., Weaver, A. M. Extracellular Vesicles: Unique Intercellular Delivery Vehicles. Trends in Cell Biology. 27, 172-188 (2017).
  2. Raposo, G., Stoorvogel, W. Extracellular vesicles: exosomes, microvesicles, and friends. The Journal of Cell Biology. 200, 373-383 (2013).
  3. Lakhter, A. J., Sims, E. K. Minireview: Emerging Roles for Extracellular Vesicles in Diabetes and Related Metabolic Disorders. Molecular Endocrinology. 29, 1535-1548 (2015).
  4. Anderson, H. C., Mulhall, D., Garimella, R. Role of extracellular membrane vesicles in the pathogenesis of various diseases, including cancer, renal diseases, atherosclerosis, and arthritis. Laboratory Investigation; a Journal of Technical Methods and Pathology. 90, 1549-1557 (2010).
  5. Lai, C. P. -K., Breakefield, X. O. Role of exosomes/microvesicles in the nervous system and use in emerging therapies. Frontiers in Physiology. 3, 228(2012).
  6. Duijvesz, D., et al. Proteomic profiling of exosomes leads to the identification of novel biomarkers for prostate cancer. PLoS One. 8, 82589(2013).
  7. Zhou, H., et al. Exosomal Fetuin-A identified by proteomics: a novel urinary biomarker for detecting acute kidney injury. Kidney International. 70, 1847-1857 (2006).
  8. Cheng, L., Sharples, R. A., Scicluna, B. J., Hill, A. F. Exosomes provide a protective and enriched source of miRNA for biomarker profiling compared to intracellular and cell-free blood. Journal of Extracellular Vesicles. 3, (2014).
  9. Michael, A., et al. Exosomes from human saliva as a source of microRNA biomarkers. Oral Diseases. 16, 34-38 (2010).
  10. Wehman, A. M., Poggioli, C., Schweinsberg, P., Grant, B. D., Nance, J. The P4-ATPase TAT-5 inhibits the budding of extracellular vesicles in C. elegans embryos. Current Biology. 21, 1951-1959 (2011).
  11. Naik, J., et al. The P4-ATPase ATP9A is a novel determinant of exosome release. PLoS One. 14, 0213069(2019).
  12. Liégeois, S., Benedetto, A., Garnier, J. -M., Schwab, Y., Labouesse, M. The V0-ATPase mediates apical secretion of exosomes containing Hedgehog-related proteins in Caenorhabditis elegans. Journal of Cell Biology. 173, 949-961 (2006).
  13. Simon, E., Aguirre-Tamaral, A., Aguilar, G., Guerrero, I. Perspectives on Intra- and Intercellular Trafficking of Hedgehog for Tissue Patterning. Journal of Developmental Biology. 4, (2016).
  14. Qi, J., et al. Exosomes Derived from Human Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells Promote Tumor Growth Through Hedgehog Signaling Pathway. Cellular Physiology and Biochemistry. 42, 2242-2254 (2017).
  15. Sigg, M. A., et al. Evolutionary Proteomics Uncovers Ancient Associations of Cilia with Signaling Pathways. Developmental Cell. 43, 744-762 (2017).
  16. Wang, J., et al. C. elegans ciliated sensory neurons release extracellular vesicles that function in animal communication. Current Biology. 24, 519-525 (2014).
  17. Beer, K. B., Wehman, A. M. Mechanisms and functions of extracellular vesicle release in vivo-What we can learn from flies and worms. Cell Adhesion and Migration. 11, 135-150 (2017).
  18. Deatherage, B. L., Cookson, B. T. Membrane vesicle release in bacteria, eukaryotes, and archaea: a conserved yet underappreciated aspect of microbial life. Infection and Immunity. 80, 1948-1957 (2012).
  19. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. C. elegans. 2, 51-67 (1999).
  20. Kibria, G., et al. A rapid, automated surface protein profiling of single circulating exosomes in human blood. Scientific Reports. 6, 36502(2016).
  21. Rose, J. A., et al. Flow cytometric quantification of peripheral blood cell β-adrenergic receptor density and urinary endothelial cell-derived microparticles in pulmonary arterial hypertension. PLoS One. 11, 0156940(2016).
  22. Lobb, R. J., et al. Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma. Journal of Extracellular Vesicles. 4, 27031(2015).
  23. Gardiner, C., Ferreira, Y. J., Dragovic, R. A., Redman, C. W. G., Sargent, I. L. Extracellular vesicle sizing and enumeration by nanoparticle tracking analysis. Journal of Extracellular Vesicles. 2, (2013).
  24. Fernandez, A. G., et al. High-throughput fluorescence-based isolation of live C. elegans larvae. Nature Protocols. 7, 1502-1510 (2012).
  25. de Rond, L., et al. Comparison of Generic Fluorescent Markers for Detection of Extracellular Vesicles by Flow Cytometry. Clinical Chemistry. 64 (4), 680-689 (2018).
  26. Russell, J. C., et al. Isolation and characterization of extracellular vesicles from Caenorhabditis elegans for multi-omic analysis [Internet]. bioRxiv. , (2018).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

C elegans EVsEV PurificationSize ExclusionFlow CytometryWorm SynchronizationSecretome GenerationProtease InhibitorTriton X 100Potentiometric ProbeRNA SEQ Analysis

İlgili makaleler