Gen Ekspresyonu Profilleme için Modifiye Yöntemi ile Tahıl Tohumlarından Yüksek Kaliteli Transkripsiyon Verilerinin Elde Edilmesi

Transkripsiyon, belirli bir zamanda bir organizmanın genomu tarafından ifade edilen ribonükleik asit (RNA) transkriptlerinin tam kümesini ve özellikle çevresel ve büyüme koşullarını temsil eder. Her hücrenin mevcut fizyolojik ve metabolik durumunu yansıtan bireysel transkripsiyonu vardır. Benzer bir doku veya organdan elde edilen hücrelerin bir koleksiyon tipik bir transkripsiyon çalışmada kullanılır, ancak tek hücreli ve mekansal olarak çözülmüş transkripsiyonpopüler 1 alıyorsanız^. Transkripsiyonomik analizler, seçilen dokudan belirli bir zaman noktasında ve tanımlanmış büyüme koşullarında toplam RNA'nın çıkarılmasıyla başlar. Bu amaçla, nişasta veya şeker içeriği yüksek numunelerden toplam RNA çıkarılması için yeni geliştirilen bir yöntemin kullanılmasını öneriyoruz, tahıl tohumu gibi². Transkripsiyonların farklı örnekler arasında karşılaştırılması, RNA moleküllerinin farklı bollukta tanımlanmasıyla sonuçlanır. Bu RNA molekülleri farklı ifade edilmiş genler (DEGs) olarak kabul edilir. Belirli marker genlerinden elde edilen transkriptlerin bolluğu, gelişimsel durumu tahmin etmek veya organizmanın çevresel dalgalanmalara tepkisini belirlemek için kullanılabilir. Çalışma altındaki gelişimsel zaman noktaları arasında transkript bolluğunda saptanabilir bir değişiklik olmayan genler genellikle referans veya temizlik genleri olarak kullanılır.

RNA tipik olarak Kuzey lekeleme ve kantitatif ters transkripsiyonaz polimeraz zincir reaksiyonu (qRT-PCR) gibi çeşitli yöntemlerle tespit edilir ve ölçülür, ancak mevcut yüksek iş lenme li transkripsiyon yöntemleri mikrodizi teknolojisini ve RNA dizilemesi (RNA-Seq) kullanılarak nükleik asit hibridizasyonuna dayanır. RNA-Seq şu anda çok popüler çünkü başka bir yerde gözden olarak yüksek iş artışı transkripsiyontranskinomik uygulamalar için çeşitli avantajlar sağlar^3,4. Eski bir teknoloji olmasına rağmen, mikrodizi yongaları kullanarak gen ekspresyonu profilleme biyoinformatik bir arka plan daha az gerektiren daha köklü bir teknoloji olduğu için hala yaygın olarak kullanılmaktadır. RNA-Seq ile karşılaştırıldığında, mikrodizi deneylerinden oluşturulan veri kümeleri daha küçüktür ve analiz etmesi daha kolaydır. Buna ek olarak, özellikle büyük örnek numaraları ile ilgili daha uygun maliyetlidir. Laboratuvarımızda, tahıl tanelerinin 5^,6,7,8,9'unbüyümesi, gelişmesi ve metabolizmasında yer alan moleküler ağları ve yolları yöneten merkezi düzenleyici merkezlerin rolünü belirlemek için mikrodizi teknolojisini kullanarak düzenli olarak transkriptomik analizler kullanıyoruz.⁵ Biz de rutin abiyotik streslere tahıl ların yanıtı mekanistik bir anlayış elde etmek için genom çapında gen ekspresyonu profilleme çalışmaları yapmak için kullanabilirsiniz¹⁰, yanı sıra transkripsiyon geniş dernek (TWAS) ve bağlantı haritalama çalışmaları tahıl kalitesi ve beslenme sorumlu genleri belirlemek için evretahıl kalitesi ve beslenme^11,12. Diğer gruplar da arpa¹³geliştirme özgü gen ekspresyonu atlası sağlayan mikrodizi teknolojisini kullandık , pirinç^14,15,16, sorgum¹⁷, ve buğday¹⁸.

Bu yayının amacı, agilent mikrodizi platformu kullanarak tahıl tanelerinin transkripsiyonprofili için laboratuarımızda kullandığımız yöntemin kısa bir metinsel özetini ve ayrıntılı bir görsel açıklamasını sağlamaktır. Diğer mikrodizi platformlarının mevcut olduğunu, ancak bu yöntemde yer almadığını lütfen unutmayın. Biz gelişmekte olan veya tahıl tohumları çimlenme RNA ekstraksiyon ayrıntılı bir açıklama sunarak protokol başlar. Deneyimlerimize dayanarak, yüksek kaliteli ve yüksek miktarda transkripsiyon elde etmek transkripsiyon analizleri için uygun olan tahıl tohumu dokuları kullanırken genellikle darboğazdır. Biz birkaç ticari RNA çıkarma kitleri denedim, ama hiçbiri tatmin edici sonuçlar sağlamıştır. Bu nedenle, daha sonra ticari olarak kullanılabilir bir kit kullanılarak sütun saflaştırmatabi tabi bir ham RNA ekstresi elde etmek için bir kimyasal ekstraksiyon protokolü geliştirdi. Bu yöntemi kullanarak, transkripsiyon profili oluşturmak için farklı downstream uygulamaları için kullanılabilen yüksek kaliteli RNA² (Şekil 1)rutin ve tekrarlayıcı bir şekilde elde ediyoruz.

1. Toplam RNA çıkarma ve arıtma

NOT: Bu yöntem zararlı uçucu organik çözücülerin kullanımını içerdiğinden her zaman duman kaputunun altında çalışın. Deneye başlamadan önce 50 °C ısı bloğunda çekirdeksiz su mikrofuge tüpünü önceden ısıtın. Bu çekirdeksiz su, Adım 1.8'deki spin sütunundaki toplam RNA'yı yok etmek için kullanılacaktır.

1. Ayrı ayrı, her biri en az üç biyolojik kopyaya sahip numuneleri, sıvı nitrojende önceden soğutulmuş sterilbir harç ve havaneli kullanarak ince bir topowdera yerleştirin.
   1. Sıvı nitrojene batırılmış küçük bir metal spatula kullanarak toz numuneleri kepçeleyin ve toz numuneleri sıvı nitrojene önceden batırılmış 2,0 mL nükleaz içermeyen mikrofuge tüplere yerleştirin. Numuneleri hemen ultradüşük sıcaklıktaki dondurucuda (-80 °C) toplu RNA ekstraksiyonu (STOP POINT) için ayrılan güne kadar saklayın.
      NOT: Tohum numuneleri dehusking ile veya susuz ince toz içine öğütülmüş olabilir. Pirinç için, biz rutin kabuk ları taşlama işlemi sırasında yardımcı olabilir silika içerdiğinden dehusking olmadan örnekleri öğütmek.
      DİkKAT: Bu adım hızlı ve kesinlikle kriyojenik koşullar altında yapılmalıdır. Otomasyon için bir seçenek RNA bozulması ve kalite bozulmasını en aza indirmek için kriyojenik bir bilyalı değirmen kullanarak örnekleri öğütmektir.
2. Orijinal toz numunenin yaklaşık 200 mg'ını kullanarak kaba bir RNA ekstresi elde edin. Her numuneyi 750 μL RNA Ekstraksiyon Tamponu (100 mM Tris, pH 8.0, 150 mM LiCl, 50 mM EDTA, %1.5 SDS, %1.5 2-mercaptoetanol) ve 500 μL fenol:kloromyl içeren nükleaz içermeyen mikrofuge tüpüne (25:24) ekleyin.
   1. Tüm numuneleri aynı anda oda sıcaklığında yüksek hızda ayarlanmış çok tüplü girdap mikseri kullanarak 5 dakika karıştırın. Hemen iki dakika boyunca buz tüm tüpleri tutun.
      DİkKAT: Özellikle fenol, kloroform ve diğer organik çözücüleri içeren tüm adımlar için, duman kaputu içinde her zaman çalışın. İdeal olarak, bir tezgah üstü santrifüj, girdap karıştırıcı, çok tüplü girdap karıştırıcı ve çok tüplü döner karıştırıcı barındırabilir geniş bir duman kaputu kullanın.
3. 10 dakika için 14.000 x g santrifüj ile enkaz dan ham RNA ekstresi ayırın. Bu bölüm için aynı ayarlarda tüm santrifüj adımları yapın.
   1. Yaklaşık 800 μL supernatant'ı 400 μL 1,2 M NaCl ve 700 μL izopropanol içeren yeni 2,0 mL mikrofuge tüpe aktarın. Çözeltiyi 5x'te hafifçe karıştırın.
   2. RNA'yı en az 1 saat (veya gece) düzenli (-20 °C) veya ultradüşük sıcaklıktaki dondurucuda (-80 °C) kuluçkaya yatırarak çökeltin.
      STOP veya PAUSE noktası: örnekleri birkaç saat duraklatmak için normal -20 °C'lik dondurucuda saklayın. Bir gecede veya daha uzun bir durak noktası için numuneleri ultradüşük sıcaklıktaki dondurucuda (-80 °C) saklayın.
4. 15 dk için 18.800 x g santrifüj ile ham bir RNA pelet elde edin. Supernatant attıktan sonra, bir Mini Kit(Tablo Malzemeler)kullanarak sütun arıtma ile kaba RNA pelet arındırMak.
   1. Peleti taze hazırlanmış 450 μL RLT Tampon'da çözün (kullanmadan önce, 100 mL RLT tamponunda 100 μL β-mercaptoetanol ekleyin, her gün taze olarak hazırlayın). Oda sıcaklığındaki tüm tüpleri en az 5 dakika boyunca çok tüplü girdap mikserinde karıştırarak tüm peletlerin çözünmesini artırın.
5. 2 mL toplama tüpü ile mor mini spin sütunundan geçerek çözünmüş RNA peletini arındırın. 9.000 x g'de 1 dakika oda sıcaklığında santrifüj ve mor mini spin sütunatın.
   1. 2 mL toplama tüpündeki temizlenmiş lysate'ye 0,5 hacimli mutlak etanol (~225°L) ekleyin. Çözeltiyi aynı plastik ucu kullanarak birkaç kez yukarı ve aşağı borular oluşturarak karıştırın.
6. Çözeltiyi hemen 2 mL toplama tüpüne sahip pembe bir mini spin sütununa aktararak saflaştırılmış RNA'yı toplayın. Pembe min spin sütunun silika membran üzerine RNA toplamak için 15 s için 9.000 x g santrifüj. RNA'yı 350 μL'lik Tampon RW1 ile 15 s için 9.000 x g'de santrifüj le yıkayın.
7. 80 μL seyreltilmiş DNase 1 (DNase setini kullanarak 50 μL dondurulmuş DNase stoku + 350 μL RDD) ekleyerek kontamine genomik DNA'yı doğrudan membranüzerine çıkarın ve en az 15 dakika oda sıcaklığında kuluçkaya yatırarak sindirin (PAUSE POINT).
   1. DNase 1'i 350 μL RW1 ekleyerek ve 15 s. 15 s. 15 s. Tekrarlayın için 9.000 x g'de aşağı doğru dönerek yıkayın, ancak bu kez 500 μL Arabellek RPE ile yıkayın. Yeni bir 2 mL toplama tüpüne aktarın ve 2 dk kuruması için 9.000 x g'de döndürün.
8. Kurutulmuş spin kolonu yeni bir 1,5 mL nükleaziçermeyen toplama tüpüne aktarın. Saflaştırılmış RNA ekstresi için elüsasyon işlemine 50°L nükleaz içermeyen su (50 °C önceden ısıtılmış) ekleyerek ve 50 °C ısı bloğunda 3 dakika kuluçkaya yatırArak başlayın.
   1. Kuluçkadan sonra, toplam RNA ekstresini 1 dk. için 9.000 x g olarak santrifüj ederek azlayın.
9. Nanodrop ve BioAnalyzer'da kendi üretici protokollerini kullanarak uygun seyreltmeler (genellikle 1:10) çalıştırarak toplam RNA ekstresinin miktarını ve kalitesini belirleyin. RNA ekstrelerinin en az 8.0 RIN değeri ve 50 ng/μL konsantrasyonu olmalıdır. Şekil 1, arpa yaprağı ve tohumlarından elde edilen RNA ekstreleri için tipik bir sonuç gösterir.
   DURDURMA NOKTASI: Numuneleri kullanıma kadar -80 °C'de saklayın.

2. cDNA sentezi ardından cRNA transkripsiyon ve etiketleme

NOT: Bu adım 24 numunenin aynı anda işlenmesi için uygundur. Tüm adımın bir günde sürekli olarak yürütüldüğü, ancak isteğe bağlı durdurma ve duraklatma noktalarının belirlendi. Aşağıdaki adımları almadan önce 80 °C, 65 °C ve 37 °C'de üç mikrofuge tüp ısı bloğunu önceden ısıttıklarından emin olun. Bu sıcaklık ayarları aşağıdaki adımlarda belirtildiği gibi değiştirilecektir. Örneğin, 37 °C'lik ısı bloğu Spike Mix hazırlandıktan sonra (veya daha önce hazırlanmışsa) 40 °C'ye ayarlanır. Üreticinin talimatlarına göre Düşük Girişli Hızlı Amp Gen İfade Etiketleme Kitini (Bkz. Malzeme Tablosu)kullanarak tek renkli Spike Mix, T7 Promoter Mix ve cDNA ana karışımını hazırlayın. Bu hazırlık, genellikle toplam RNA için 10 ila 200 ng veya PolyA RNA için 5 ng arasında değişen başlangıç RNA ekstrelerinin miktarına bağlıdır. Biz rutin mikrodizi hibridizasyon² için başlangıç malzemesi olarak 50 ng toplam RNA kullanın ve aşağıda açıklanacaktır yöntemi için. 24 örnek için bir ana karışım hazırlarken, pipetleme varyasyonları için hesaba 2 ekstra reaksiyon ekleyin. Bu adımda her zaman nükleaz içermeyen mikrofuge tüpleri ve nükleaziçermeyen su kullanın.

1. Yüksek verim nedeniyle, genellikle 50-100 ng aralığına sığacak şekilde RNA ekstresini 100 kat seyreltin. Adım 1.9'daki RNA niceleme sonuçlarına dayanarak, 1,5 mL mikrofuge tüpe 99°L çekirdeksiz suya 1 000 000 rNA ekstresi ekleyerek 1:100 seyreltme yapın. Bir Nanodrop kullanarak bu seyreltme gerçek konsantrasyonu belirleyin.
   1. 1,5 mL mikrofuge tüpteki her toplam RNA örneğini ikinci bir seyreltme ile 1,5 μL'lik son hacimde toplam RNA'nın 50 ng'sini yapın.
2. Spike Mix'i üreticinin talimatlarına göre hazırlayın. Bu adım püffeld ve ark. 2019^2'dede özetlenmiştir. Bunun için 37 °C'lik bir ısı bloğu kullanın. Tek renkli başak karışımı pozitif kontrolleri ultradüşük sıcaklıktaki bir dondurucuda (-80 °C) birinci ve ikinci seyreltme depolar ve yalnızca sekiz tekrarlanan donma/çözülme döngüsünden geçer.
   1. Üçüncü ve dördüncü seyreltme taze günlük hazırlayın. Kullanmadan önce buz üzerinde başak karışımının üçüncü ve dördüncü seyreltme sini eritin ve saklayın.
      NOT: Spike Mix hazırlandığında (veya daha önce hazırlanmışsa) 37 °C'lik ısı bloğunun sıcaklığını 40 °C'ye dönüştürün.
3. T7 Promoter Mix'i hazırlayın ve kullanmadan önce buz üzerinde saklayın. Aşağıdaki 24 örnek için yeterlidir:
   20.8 μL T7 organizatör astar
   + 26.0 μL nükleaz içermeyen su
   = 46.8 μL toplam hacim T7 Promoter Mix
4. Adım 2.1'den 1.5 μL 50 ng RNA numunesi içeren her mikrofuge tüpüne 1,8 μL T7 Promoter Primer Mix (Step 2.3) ekleyin. Birkaç kez pipetleme yaparak bileşenleri düzgün bir şekilde karıştırın. 10 dakika boyunca 65 °C ısı bloğunda kuluçkaya yatırarak RNA şablon-astar karışımını denatüre edin.
5. Şablon-astar karışımını (Step 2.4) denatürken, 80 °C'de 5x First Strand Tamponu en az 4 dakika ısıtın. Table of Materials Aşağıdaki 24 reaksiyon için yeterlidir:
   52.0 μL Önceden ısıtılmış 5x İlk İplik Tampon (Adım 2.5)
   + 0,1M DTT'nin 26.0 μL'si
   + 10 mM dNTP karışımının 13.0 μL'si
   + 31.2 μL RNase Blok Karışımı
   = 122.2 μL toplam hacim cDNA sentezi Master Mix
   1. Her bileşeni buzüzerinde eritin. Her bileşeni nazik pipetleme ile karıştırın. Master Mix'i kullanmadan önce oda sıcaklığında tutun.
      DİkKAT: RNase Block Mix kullanımdan sonra hemen -20 °C'lik dondurucuya konulmalıdır.
6. Mikrofuge tüpünün altına tüm içeriği aşağı spin için buz (Adım 2.4) ve kısa bir süre oda sıcaklığında santrifüj üzerinde RNA şablon-astar karışımı çıkarın. CDNA Master Mix'in (Step 2.5) 4.7 l'sini her tüpe dağıtın ve yukarı ve aşağı borular oluşturarak dikkatlice karıştırın. Tüm bileşenler eklendiğinde toplam hacim 8.0 μL olmalıdır.
   1. CDNA'yı 40 °C ısı bloğunda 2 saat sentezle. 2 saat kuluçka sırasında, ısı inaktivasyonuna hazırlık olarak 65 °C ısı bloğunun sıcaklığını 70 °C'ye kaydırın (Adım 2.7).
      İstEĞE BAĞLI DURAKLAMA NOKTASI: Numuneleri bir gecede -80 °C'de saklayın. Deney, ısı inaktivasyonundan sonraki gün devam edebilir (Adım 2.7).
7. RNase Block Mix'i ısıtmak için her tüpü 70 °C ısı bloğunda 15 dakika kuluçkaya yatırın. Tüpleri hemen buzüzerinde aktarın ve en az 5 dakika kuluçkaya yatırın.
8. Örnekler 5 dakika (Step 2.7) için buz üzerinde iken, hızlı bir şekilde Transkripsiyon Master Mix hazırlamak. Tüm bileşenler oda sıcaklığında kombine edilebilir ancak buz üzerindeki çözülme bileşenleri. Aşağıdaki 24 örnek için yeterlidir:
   19,5 μL nükleaz içermeyen su
   + 83.2 μL 5x Transkripsiyon Tampon
   + 15.6 μL 0.1M DTT
   + 26.0 μL NTP karışımı
   + 5.5 μL T7 RNA Polimeraz Karışımı
   + 6.2 μL siyanin 3-CTP (Cy3)
   = 156.0 μL toplam hacim Transkripsiyon Master Mix
   DİkKAT: T7 RNA Polimeraz Karışımı -20 °C'lik dondurucuda tutulmalı ve kullanımdan hemen sonra geri konulmalıdır. Ayrıca, Cy3 ışığa duyarlıdır. Bu nedenle, karıştırma (Adım 2.9) ve dağıtım (Adım 2.10) düşük ışık koşullarında yapılmalıdır. Bunun için, genellikle doğrudan laboratuvar tezgah üzerinde herhangi bir ışık kapatın.
9. Tüpler ani ısıtma ve soğutma (Adım 2.7) tabi olduğu gibi, kısaca her mikrofuge tüp altında tüm sıvı toplamak için bir mikrocentrifuge kullanarak her numunenin içeriğini aşağı spin. Transkripsiyon Master Mix (Step 2.8) 6 μL'yi yavaşça yukarı ve aşağı boruile tutarak ekleyin. Bu reaksiyonun toplam hacmi bu aşamada 16 μL olmalıdır. Tüpleri 40 °C'de 2 saat boyunca kuluçkaya yatırın ve Cy3 etiketli cRNA üretin.
   İstEĞE BAĞLI STOP POINT: Tüpler transkripsiyondan sonra -80 °C'de saklanabilir.
10. CRNA (Step 2.9) üretirken, ısı bloğunun sıcaklığını 55 °C'ye ayarlayın. Isı bloğuna en az bir mikrofuge tüpnü çekirdeksiz su ekleyin. Bu nükleaz içermeyen su saflaştırılmış cRNA elution için kullanılacaktır.
11. cRNA transkripsiyon ve etiketleme den sonra, adım 3'te ayrıntılı olarak belirtildiği gibi rneasy mini kiti kullanarak etiketlenmiş cRNA'yı arındırın.

3. cRNA Arınma

1. Etiketli cRNA'yı RNeasy Mini Kiti kullanarak arındırın (bkz. Malzemeler Tablosu). Arabellekleri üreticinin talimatlarına göre hazırlayın. Örneğin, Arabellek RPE konsantre formda kiti verilir. Kullanmadan önce, moleküler biyoloji notu mutlak etanol 4 cilt ekleyin (%96-100).
2. Toplam hacmi 100°L'ye ayarlamak için her numuneye 84°L nükleaz içermeyen su ekleyin. Daha sonra her tüpe 350 μL Tampon RLT ve 250 μL mutlak etanol ekleyin. Pipetleme ile iyice karıştırın.
3. Her karışımın 700 μL'sini 2 mL toplama tüpüne sahip bir mini spin sütununa aktarın. Etiketli cRNA'yı 4 °C'de 7.534 x g'de30 s'de santrifüj ile membran üzerine toplayın. Akış sıvısını atın.
4. Her numuneyi 500 μL Arabellek RPE'de yıkayın. Bir önceki adımda olduğu gibi, akış tanzim edin ve atın. Bu adımı bir kez tekrarlayın ve bir sonraki adıma geçin.
5. Mini spin sütunu yeni bir toplama tüpüne aktarın. Numuneleri Adım 3.3'te olduğu gibi santrifüj ile kurulayın.
6. Mini spin kolonu, kit ile birlikte verilen nükleaziçermeyen 1,5 mL mikrofuge tüpüne aktarın. Her biri cRNA numunesini etiketleyerek 30°L nükleaz içermeyen su (55 °C'de önceden ısıtılmış) doğrudan membran filtresine ekleyerek uygulayın. 60 s için 55 °C ısı bloğu kuluçka ile elütion artırın.
7. 7.535 x g30 s oda sıcaklığında santrifüj tarafından etiketli cRNA toplamak. Dönüş sütununa atın ve her mikrofuge tüpünü kapatın. Hemen buz üzerinde her tüp yerleştirin.
   İstEĞE BAĞLI DUR NOKTASI: Numuneler elüsyondan sonra -80 °C'de saklanabilir.
8. Mikrodizi özelliğini kullanarak cRNA'yı Nanodrop ile ölçün. Örneği RNA-40 olarak ayarlayın. Bir elektronik tabloda aşağıdaki değerleri elde edin: siyanün 3 boya konsantrasyonu (pmol/μL), RNA absorbans oranı (260 nm/280 nm) ve cRNA konsantrasyonu (ng/μL).
   STOP POINT: CRNA örneklerini okuduktan sonra hemen -80 °C'de saklayın.
9. CRNA verimini ve Püffeld ve ark. 2019^2'deayrıntılı olarak belirtilen özel etkinliği hesapla .

4. Mikrodizi hibridizasyonu ve tarama

NOT: Bu adım sadece 3-4 saat sürer ve dolayısıyla 24 numunenin hibridizasyonu öğle yemeğinden sonra başlatılabilir. Bir operatör en fazla 4 slayt (32 örnek) rahatlıkla çalıştırabilir. Ertesi günün sabahı mikrodizi slaytların yıkanması ve taranması için ayrılmıştır. Ek çalıştırmalar daha sonra ikinci günün öğleden sonra yapılabilir. Bu adım, tüm örnekler melezleştirilene ve taranana kadar yinelenir. Numunelerin mikrodizi analizlerini engelleyebilecek renkli pigmentlerle kirlenmediğinden emin olmak için slaytların işlenmesi ve işlenmesi için renksiz, pudrasız lateks eldivenlerin kullanılması önerilir. Ticari olarak mevcut microarrays dışında, aşağıdaki özel diziler grubumuz tarafından tasarlanmış ve Agilent sipariş için kullanılabilir: Sipariş Kodu 028827 Arpa için (Hordeumvulgare), Pirinç için 054269 (Oryzasativa subs. Japonica), 054270 Rice için (Oryzasatitivva subs. Indica) ve 048923 Wheattium için (Trities).

1. Gen Ekspresyonu Hibridizasyon Kiti'ni kullanarak mikrodizi hibridizasyonunu gerçekleştirin (bkz. Malzeme Tablosu). Üreticinin özelliklerine göre 10x Engelleme Maddesi hazırlayın². Aliquot 10x Engelleme Ajanı 200 μL porsiyonlar halinde ve kullanıma kadar -20 °C'de saklayın. Her aliquot en fazla 40 hibridizasyon için yeterlidir ve 2 aya kadar kararlıdır.
2. Mikrodizi hibridizasyonu için ayrılan günde, buz üzerinde 10x Engelleme Maddesi'nin 200 μL'lik bir aliquot'unu eritin. Ayrıca, melezleme fırınını 65 °C'ye önceden ısıtın ve cRNA parçalanması sırasında kullanılmak üzere 60 °C'ye kadar ısıtın.
3. Üretici²tarafından açıklandığı gibi her örnek için Parçalanma Karışımı hazırlayın. Laboratuvarımızda, 8'li mikrodizide hibridizasyon için 600 ng doğrusal olarak güçlendirilmiş Cy3 etiketli cRNA kullanıyoruz. Bu durumda, aşağıdaki liste örnek başına Parçalanma Karışımı bileşenlerini özetler:
   600 ng doğrusal amplifikatör cRNA, siyanin 3 etiketli
   + 5 μL 10x Engelleme Maddesi
   Nükleaz içermeyen su ile hacmi 24°L'ye ayarlayın
   + 1 μL 25x Parçalanma Tampon
   = 25 μL toplam hacim Parçalanma Karışımı
   1. Girdap mikseri kullanarak numuneleri hafifçe karıştırın. Mikrosantrifüj kullanarak tüm numuneleri kısaca döndürün.
4. 60 °C'deki tüm numuneleri tam olarak 30 dakika kuluçkaya yatırın.
5. Parçalanma reaksiyonunu tamamen durdurmak için, her tüpe 2x GEx Hibridizasyon TamponHI HI-RPM ekleyin. Karıştırma sırasında herhangi bir kabarcıklar tanıtmak için büyük özen, yukarı ve aşağı pipetleme tarafından yavaşça karıştırın. 8'li mikrodizi formatı için parçalanma reaksiyonunu durdurmak için rutin olarak 25 μL Hibritizasyon Tamponu kullanıyoruz.
6. Ortam oda sıcaklığında 15.750 x g 1 dakika için tüm tüplersanrifuge. Tüm tüpleri hızlı bir şekilde buza yerleştirin ve her numuneyi mümkün olduğunca hızlı yükleyin.
7. 17 saat gece kuluçka için laboratuvar ayrılmadan önce, video ayrıntılı olarak hibridizasyon montaj² hazırlayın.
   1. ÖNEMLİ ADIM: Her hibridizasyon karışımını aktarın ve her contanın ortasına yavaşça dağıtın ve dağıtım sırasında kabarcıkları tanıtmamaya büyük özen yitirin. Biz rutin 8-pack microarray biçimi için hibridizasyon karışımı 44 μL kullanın. Ayrıca kullanılmayan kuyularda 44 μL 1x Hibridizasyon Tamponu yerleştirin.
   2. Hemen conta slayt üstüne doğru yönlendirme ile mikrodizi slayt koyun. Bu herhangi bir sıvı dökmek için çok dikkatli yapılmalıdır. Hibridizasyon tertibatını sıkıca kapatın ve kalıcı hava kabarcıkları getirilip getirilmemesin diye döndürün. Tüm kabarcıklar conta slayt içinde hareket edilmelidir.
8. Hibridizasyon odası montajını hibridizasyon fırın rotatoruna koyun. 2x GEx Hibridizasyon Tamponu kullanıyorsanız, dönüş hızını 10 rpm'ye ayarlayın ve tam 17 saat boyunca 65 °C'de hibridize edin.
9. Gen Ekspresyonu Yıkama Tampon Kiti'ni kullanarak melezleştirilmiş mikrodizileri yıkayın (bkz. Malzeme Tablosu). Üreticinin talimatlarına göre Gen Ekspresyonu Yıkama Tamponları 1 ve 2'yi hazırlayın^2. Her iki tampona da %10 Triton X-102'nin 2 mL'sini ekleyin (tamamen isteğe bağlı ama mikrodizi yıkama yapıtlarının görülme sıklığını azaltmak için şiddetle tavsiye edilir)^2.
10. Önceki yayında ayrıntılı olarak üç yıkama odası meclisleri hazırlayın². Her yıkama odasının ayrıntıları aşağıda özetlenmiştir (Tablo 1).
11. Aliquot 500 mL Yıkama Tampon 1 1 L reaktif şişe ve ortam oda sıcaklığında bırakın. Yıkama tamponunu ilk odadan kaydetmek için ekstra 1 L reaktif şişesi ve "Yıkama Arabelleği 1 Yeniden Kullanın" etiketi hazırlayın. Ayrıca, aliquot 500 mL Yıkama Tampon 2 bir reaktif şişe ve bir gecede 37 ° C su banyosu nda kuluçka.
    NOT: 4.9-4.11 adımlarını hazırlamadan laboratuvardan ayrılmayın. Onlar ertesi gün yıkama adımları için gereklidir.
12. Ertesi gün, Tablo 2'deayrıntılı olarak yıkanan tamponları hazırlayın. Her yemeği karşılık gelen arabellekdörtte üçüne doldurun. Her yıkama tamponu en fazla 4-5 slayt için iyidir.
13. Hibridizasyon tam 17 saat sonra, bir hibridizasyon odası olsun ve önceki yayında ayrıntılı olarak tüy bırakmayan kağıt ile kaplı laboratuvar tezgah üzerinde^{sökmek 2}.
    1. ÖNEMLİ ADIM: Mikrodizisandviçi Dish 1'e aktarın. Mikrodizi barkodun eğimli bir konumda karşı karşıya olduğundan emin olun ve arabellekteki tüm slaytın daldırılmasından kaçının. Her mikrodizi slaytını uçlarından alın ve slaydın etkin tarafına dokunmaktan kaçının.
    2. İki cam kaydırağı bir çerte²kullanarak ayırın. Contanın dish 1'in altına yavaşça düşmesine izin verin, aynı zamanda mikrodizi kaydırağının bir sonraki adım için sıkıca tutulmasını da sağlar.
14. ÖNEMLİ ADIM: Mikrodizi slaytlarını yavaşça yana doğru kaldırın ve bir önceki^yayındaayrıntılı olarak 2. Mikrodizi slaytlarının havaya minimal maruz kalması çok önemlidir.
    1. Sekiz slayt rafa gelene kadar 4.13 ve 4.14 adımlarını tekrarlayın. Raf boyunca mikrodizi slaytlarını eşit olarak dağıtın. Bu adım, en fazla 4 slayt için desteksiz bir işleç tarafından yapılabilir. Raf tutucuyu takın ve tüm Dish 2 kurulumlarını ilk manyetik karıştırıcıya aktarın. Tam olarak 1 dakika boyunca hafifçe karıştırın.
15. 1 dakika (Step 4.14) için karıştırırken, mini 37 °C inkübatörden Dish 3'ü aktarın ve ikinci manyetik karıştırıcının üzerine yerleştirin. Yıkama Tamponu 2'yi (37 °C su banyosundan) Çanak 3'e nazikçe yerleştirin. Dökülürken kabarcık oluşumundan kaçının.
    1. 1 dk karıştırma yapıldıktan sonra (Adım 4.14), yavaşça ve yavaşça Çanak 2 slayt raf ı kaldırın ve Çanak 3 aktarın. Raf tutucuyu çıkarın ve tam olarak 1 dakika karıştırın.
16. Kaydırma rafını Çanak 3'ten yavaşça ve yavaşça kaldırın. Tampon damlacıkların oluşumunu önlemek için emin olun². Her slaydın kenarlarını tüy bırakmayan kağıda hafifçe dokunarak kurulayın. Her leke kurutulmuş slaytı bir slayt kutusuna yerleştirin ve tüm mikrodizi slaytları slayt kutusuna gelene kadar adım 4.16'yı tekrarlayın. Yaklaşık 15 dk kuru.
    İsteğE Bağlı DURDURMA Noktası
17. Her mikrodizi slaytını bir slayt tutucuya yerleştirin ve barkodun yukarı yayılmasını sağlar.
    NOT: Mikrodizi odasıiçindeki ozon seviyesi 50 ppb (100 μg/m³⁾veya daha az olmalıdır. Bu tamamen isteğe bağlıdır ancak şiddetle tavsiye edilir: siyanür boyalarının ozon kaynaklı bozulmasını önlemek için ozon bariyeri slayt kapağı kullanın.
18. Birleştirilmiş slayt tutucuları tarama atlıkarıncasına yerleştirin. Örnekleri barkod numarasına göre sırayla yükleyin. Bir önceki yayında açıklandığı gibi bir mikrodizi tarayıcısı (Bkz. Malzeme Tablosu)kullanarak slaytları hemen tarayın².
19. Çalıştırmadan sonra, önceki yayında açıklandığı gibi verileri özellik çıkarma ve QC doğrulamasına tabi^tardı.

Bu yöntem, önemli miktarda kirletici nişasta veya şeker içeren tahıl tohumu numunelerinin ayıklanması için optimize edilebiyi zedelemedir. Günde 24 tohum örneğinden toplam RNA ayıklamak için tasarlanmıştır. Bir gün içinde sürekli olarak yapılmalıdır, ancak protokol boyunca isteğe bağlı durdurma ve duraklatma noktaları tanımlanır. Alternatif olarak, okuyucu tercih ettikleri RNA ekstraksiyon kitleri veya manuel kimyasal ekstraksiyon yöntemi kullanabilirsiniz. Ancak, önceki deneyimlerimize dayanarak, önemli miktarda nişasta, protein, şeker ve/veya lipid kontaminasyonu nedeniyle, ticari olarak mevcut bitki RNA ekstraksiyon kitleri tohumlar için uygun değildir. Açıklanan yöntemde, ham RNA'nın kimyasal olarak çıkarılmasını, ticari bir RNA ekstraksiyon kiti kullanılarak kolon saflaştırması takip edilir. Bu genellikle RNA'ya daha yüksek kalite ve verim sağlar. Şekil 1 burada açıklanan yöntemi kullanarak RNA çıkarma kalitesini test etmek için bir BioAnalyzer çalışmasının sonucunu gösterir. Sonuçlar arpa yaprağı (Düşük nişasta içeriği örneklerini temsil eden örnekler 1 ve 2) ve arpa tohumu (Yüksek nişasta içeriği örneklerini temsil eden örnek 3 ve 4' tür) için sunulmaktadır. Tüm numuneler için RNA bütünlüğü (RIN) değeri 10'dur.

Şekil 1 saflaştırılmış RNA ekstresinin temsili bir jelini gösterir, burada kalite bir Biyoanalizör kullanılarak test edilmiştir. 1 ve 2'deki örnekler, kloroplastlardan gelen ek rRNA bantlarının belirgin olduğu arpa yaprakları gibi düşük nişasta içeriği örnekleri için tipik sonuçlardır. 3 ve 4'lük örnekler, arpa tohumu gibi yüksek nişasta içeriği örneklerinin 18S ve 28S rRNA'yı göstermesiiçin temsili sonuçlardır. Kloroplast rRNA nedeniyle yaprak numuneleri gibi yeşil bitki dokuları için otomatik RIN değeri hesaplanamaz. Ancak, bütünlük ve yüksek kalite görsel olarak genellikle düşük moleküler yayma olarak görünen herhangi bir bozulma ürünleri, yokluğu ile tespit edilebilir. Arpa tohumu gibi yüksek nişastalı tohum numuneleri için RIN değeri genellikle bu kağıtta açıklanan protokol kullanılarak 10'dur.

Buna ek olarak, biz de burada maltlama kalitesi19analizi için kullanılan iki elit arpa inbred hatları (Sofiara ve Victoriana) bir zaman ders deney temsili bir veri salıyoruz. Maltlama işlemi sırasında nişasta şekere dönüştürülür. Bu nedenle, örnekler nişasta ve şeker içeriği değişen oranlarda dokuları temsil eder. Endüstriyel maltlama işlemi çimlenme işlemine benzebildiği için maltlama kalitesinde farklı olan iki arpa hattının transkripsiyonu analiz edildi. RNA'lar biyolojik trilikitlerde imbibition sonra 2, 24, 48, 72, 120, 144 ve 196 h çimlenme tohumları elde edildi. RNA hazırlık ve özelleştirilmiş arpa mikrodizi çip hibridizasyon yukarıda açıklandığı gibi yapılmıştır. Şekil 2, kalite kontrol (QC) raporunda verilen mikrodizi hibridizasyonundan(Şekil 3)ve tespit edilen sinyaller için histogram çiziminden okunan normalleştirilmiş ızgarayı gösterir. Izgara, arka plan ve kalibrasyon için kullanılan çivili okuma noktalarını da içeren çipin her köşesinden türetilmiş sinyaller örneğini verir. Histogram, ilgili sinyal yoğunluklarına sahip saptanabilir noktasapasyonunu gösterir. Başarılı bir melezleştirme, şekilde gösterildiği gibi yalnızca küçük aykırılıklarla geniş bir Gaussian şeklinde eğri sağlar. Başarısız melezleştirmeler bir tarafa doğru güçlü bir kaymaya neden olabilir ("yeşil canavarlar").

Son olarak, kabul edilebilir değerlerin temsili bir sonucu Şekil 3'ün4. Gerçekleştirilen deneylerin güvenilirliğini belirtmek için sonuçlar GeneSpring yazılımı kullanılarak daha da değerlendirilir. Toplanan veriler temel bileşen analizi (PCA) olarak sunulur. PCA, seçilen noktaların (genlerin) değerlerini vektör olarak bütünleştirir. Kullanılan değerlendirilen nokta sayısı birkaç yüz yonganın tamamına kadar değişebilir ve kullanılan yazılıma bağlıdır. Her yonga (örnek) analiz edilen noktalar için entegre sinyal yoğunluklarından kaynaklanan bir değer (vektör) ile sonuçlanır. Bu nedenle, grafikteki (PCA) göreli konum, örneklerin birbirine benzerliğini gösterir. Örnekler ne kadar yakınsa, o kadar benzerolurlar. Teknik çoğaltmalar biyolojik olanlardan daha yakın olmalı ve bir numunenin biyolojik kopyaları farklı zaman noktalarından, dokulardan veya koşullardan alınan örneklerden daha yakın bir şekilde kümelenmelidir.

Şekil 1: Bioanalyzer ile RNA kalitesini kontrol ettikten sonra elde edilen elektroforez dosya çalışma özeti. Örnekler 1 ve 2 kloroplastlardan ek ribozomal bantlar ile belirtildiği gibi arpa yaprağı dokusu vardır. 3 ve 4 numaralı örnekler 18S ve 28S rRNA bantlı arpa tohumu dokusuolarak gösterilmiştir. Bir RIN faktörü her zaman yaprak gibi yeşil dokular için hesaplanmaz ama jel göre, RNA kalitesi çok iyidir. 3 ve 4 örnekleri için RIN değeri 10'dur. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Başarılı arpa mikrodizi hibridizasyonu NDAN QC Raporu. A + çipin her köşesinden ızgaraüzerinde algılanan sinyalleri gösterir. Histogram, arka plan çıkarmadan sonra logaritma olarak sinyal yoğunluğuna (floresans) göre sınıflandırılan sinyal sayısını gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Hibridizasyon ve tarama dan sonra kalite kontrol (QC) özeti. Melezleştirilmiş slayt için değerler sütun 2 (değer) verilir ve kabul edilebilir değerler aralığı sütun 4 gösterilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 1: Yıkama odası montajlarının hazırlanması.

Tablo 2: Kuluçka odası montajları için kuluçka sıcaklığı ve zamanı.

Yazarların rakip finansal çıkarları yok.