Burada, Leishmania amazonensisile farelerin kutanöz enfeksiyon değerlendirmek için derlenmiş bir protokol sıyoruz. Bu parazit virülans çalışma için güvenilir bir yöntemdir, enfeksiyona omurgalı konak yanıtı sistemik bir görünüm sağlayan.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Farelerde Parazit Virülans değerlendirmek için Leishmania amazonensis ile Vivo Enfeksiyon
Bu makalede
Özet
Özet
Leishmania spp. leishmaniases neden protozoan parazitler, kutanöz visseral lezyonlar için klinik bulgular geniş bir yelpazede mevcut hastalıklardır. Şu anda, 12 milyon kişi Leishmania dünya çapında enfekte olduğu tahmin edilmektedir ve 1 milyardan fazla insan enfeksiyon riski altında yaşıyor. Leishmania amazonensis Orta ve Güney Amerika'da endemik ve genellikle doğrudan bir hayvan modelinde görselleştirilmiş olabilir hastalığın kutanöz formuna yol açar. Bu nedenle, L. amazonensis suşları kutanöz leishmaniasis çalışmaları için iyi modeller de kolayca in vitro yetiştirilen çünkü. C57BL/6 fareler insanlarda gözlenen L. amazonensisgüdümlü hastalık ilerlemesini taklit eder ve kutanöz leishmaniasis için en iyi fare suşları modeli olarak kabul edilir. Omurgalı konak, bu parazitler bu hücrelerin savunma mekanizmaları rağmen makrofajlar yaşıyor. Çeşitli çalışmalarda farklı koşullar altında parazit enfekte değerlendirmek için in vitro makrofaj enfeksiyonu testleri kullanın. Ancak, in vitro yaklaşım organizmanın tepkisini göz ardı izole bir hücre sistemi ile sınırlıdır. Burada, konak-parazit etkileşimine sistemik fizyolojik bir bakış sağlayan in vivo murine enfeksiyonu yöntemini derlemekteyiz. L. amazonensis ile C57BL/6 farelerin in vivo enfeksiyonu için ayrıntılı protokol enfektif amastigotlar, fareler ayak takımı kutanöz inokülasyon, lezyon gelişimi ve parazit yük tayini içine parazit farklılaşması nı kapsar. Bu köklü yöntemi, konakçının immün ve metabolik yanıtlarının kutanöz leishmaniasis'e karşı fizyolojik çalışmalar için en uygun yöntem olarak öneriyoruz.
Giriş
Leishmaniases gelişmekte olan ülkelerde önemli sorunları temsil eden dünya çapında yaygın paraziter bulaşıcı hastalıklar ve Dünya Sağlık Örgütü1,2tarafından en önemli ihmal tropikal hastalıklardan biri olarak kabul edilmektedir. Leishmaniases kutanöz ile karakterizedir, mukozal, ve / veya visseral belirtileri. Kutanöz leishmaniasis genellikle L. amazonensisneden olur , L. mexicana, L. braziliensis, L. guyanensis, L. major, L. tropica ve L. aethiopica3. Hastalığın Bu formu genellikle koruyucu hücresel immün yanıt indüksiyon n....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Tüm deneysel prosedürler São Paulo Üniversitesi Biyobilim Enstitüsü Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanmıştır (CEUA 342/2019) ve São Paulo Eyaleti Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı ile ilgili öneriler ve politikalara uygun olarak yürütülmüştür (Lei Estadual 11.977, de 25/08/2005) ve Brezilya hükümeti (Lei Federal 11.794, de 08/10/2008). Bölüm 1-5'te açıklanan tüm adımlar laminar akış dolaplarıiçinde aseptik olarak yapılmalıdır. Canlı Leishmania parazitleri kullanılırken kişisel koruyucu ekipmanlar kullanılmalıdır.
1. In Vitro Farklılaşma L. amazonensis Promastigotes içine Axenic Amastigotes
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Leishmania protozoan parazitler omurgasız ve omurgalı konaklarında yaşam döngüsü boyunca iki gelişimsel formlarda bulunurlar: promastigotes, dişi kum sineğinin lümeninde bulunan proliferatif formlar; ve amastigotes, memeli konak hücrelerin parasitophorous vakuollerde bulunan proliferatif formları. Promastigotes yaklaşık 1.5 μm genişliğinde ve 20 μm uzunluğunda uzun bir gövdeye sahiptir ve genellikle ön ekstremiteden çıkan bir kamçı vardır. Amastigotes boyutu 2-6 μm uzunluğunda ve.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Bu protokolde açıklanan in vivo enfeksiyon test sistemik bir senaryoda konak-parazit etkileşimi dikkate alınarak herhangi bir araştırmacı in vivo kutanöz leishmaniasis değerlendirmek için izin verir. Bu tahliller birçok grup tarafından kullanılmıştır22,24,27,29,31,32,34,
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarları olduğunu beyan.
Teşekkürler
São Paulo Üniversitesi Biyomedikal Bilimler Enstitüsü Hayvan Merkezi'nden Prof. Dr. Niels Olsen Saraiva Câmara'ya destek için ve Prof. Dr. Silvia Reni Uliana'ya cam doku öğütücüsünü temin ettiği için teşekkür ederiz. Bu çalışma Sao Paulo Araştırma Vakfı (FAPESP - MFLS hibe 2017/23933-3) tarafından desteklenmiştir.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 96 oyuklu plaka | Greiner bio-ne | 655180 | Seyreltme testini sınırlamak için düz tabanlı bir plaka |
| adenin | Sigma | A8626 | M199 hücre kültürü ortam |
| kaliperine | Mitutoyo | 700-118-20 | Ayak pedi hücre kültürü şişesinin kalınlığını ölçmek için bir kumpas |
| Corning | 353014 | Leishmania parazit santrifüjünü yetiştirmek için 25 cm2 hacimli hücre kültürü şişesi | |
| Eppendorf | 5804R | Numuneleri yoğunluğuna göre ayırmak için kullanılan bir ekipman | |
| CO2 inkübatör 34 &derece; C | Thermo Scientific | 3110 | Amastigot farklılaşması için bir inkübatör |
| etanol | Merck | K50237083820 | Genel ürünler için bir dezenfektan |
| fetal sığır serumu | Gibco | 12657-029 | M199 hücre kültürü ortamına eklenen |
| takviye cam doku öğütücü tüp | Thomas Scientific | 3431 E04 | Enfekte ayak pedi dokusunu |
| toplamak ve bozmak için bir tüpglikoz | Synth | G1008.01.AH | Takviyesi M199 hücre kültürü ortamına eklendi |
| GraphPad Prism Yazılımı | GraphPad | Verileri çizmek ve istatistiksel anlamlılığı hesaplamak için kullanılan bir yazılım | |
| hemin | Sigma | H-2250 | Takviyesi M199 hücre kültürü ortamına eklendi |
| HEPES | Promega | H5303 | Takviyesi M199 hücre kültürü ortamı |
| inkübatörüne eklendi 25 ° C | Fanem | 347CD | Promastigot yetiştiriciliği için bir inkübatör |
| mikroskop | Nikon | TMS | Promastigot ve amastigot kültürlerini görsel olarak analiz etmek için kullanılan bir ekipman |
| izofluran | Fareler için bir inhalan anestezik (%3-5) | ||
| laminer akış kabini | Veco | VLFS-09 | Aseptik çalışma alanı için kullanılan bir biyogüvenlik kabini |
| M199 hücresi kültür ortamı | Gibco | 31100-035 | Leishmania yetiştirme mikrosantrifüj tüpü için bir hücre kültürü ortamı |
| Axygen | MCT150C | Numune toplama, işleme ve saklama için kullanılan bir mikrotüp | |
| multichanel pipet | Labsystems | F61978 | Seyreltme testini sınırlamak için kullanılan çok kanallı bir pipet |
| NaHCO3 | Merck | 6329 | M199 hücre kültürü ortamına ek eklendi |
| NaOH | Sigma | S8045 | M199 hücre kültürü ortamına ek eklendi |
| Neubauer odası | HBG | 2266 | Paraziti saymak için bir hemositometre süspansiyon |
| optik mikroskobu | Nikon | E200 | Parazit parafilmini saymak için kullanılan bir optik ekipman |
| Bemis | 349 | kapatmak için esnek ve dayanıklı bir plastik plaka | |
| penisilin/streptomisin | Gibco | 15140122 | M199 hücre kültürü ortamına eklenen |
| takviye Petri kapları | TPP | 93100 | Ayak pedi dokusunu incelemek için steril bir kap |
| pipetman kiti | Gilson | F167360 | Dört pipetleyici içeren bir mikropipet kiti (P2, P20, P200, P1000) |
| terazisi | , Quimis | BG2000 | Toplanan ayak tabanını tartmak için kullanılan bir ekipman lezyonlar |
| neşter | Solidor | 10237580026 | Ayak tabanı dokusunu kesmek ve toplamak için bir neşter |
| serolojik pipet 10 mL | Yuva | 327001 | Mililitre hacim uçlarını aktarmak için kullanılan steril bir pipet |
| Axygen | Mikrolitre hacimleri aktarmak için kullanılan bir pipet ucu | ||
| mavisi | Gibco | 15250-061 | Canlı parazitleri saymak için kullanılan bir boya |
| triptikaz pepton | Merck | Takviyesi, M199 hücre kültürü ortamı | |
| tüberkülin şırıngasına | BD 305945 | Parazit süspansiyonunu aşılamak için 27G iğneli bir şırınga |
Kaynaklar
- Alvar, J., et al. Leishmaniasis worldwide and global estimates of its incidence. PloS One. 7 (5), e35671(2012).
- Ashford, R. W. The leishmaniases as emerging and reemerging zoonoses. International Journal for Parasitololy. 30 (12-13), 1269-128....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
