Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Fonksiyonel Çalışma için Ex Vivo Basınçlı Hipokampal Kapiller-Parenkimal Arteriyol Hazırlığı

6.7K görüntülenme

DOI:

10.3791/60676

18 Aralık 2019

Bu makalede

Özet

Mevcut el yazması, hipokampal arteriyol ve kılcal damarları fare beyninden nasıl izole edilebildiğini ve basınç miyografisi, immünoresans, biyokimya ve moleküler çalışmalar için nasıl basınçlandırılabildiğini ayrıntılarıyla anlatmaktadır.

Özet

İnce davranışsal değişikliklerden geç evre demansa kadar, vasküler kognitif bozukluk genellikle serebral iskemi sonrasında gelişir. İnme ve kardiyak arrest son derece cinsel dimorfik hastalıklardır, ve her ikisi de serebral iskemi neden. Ancak, vasküler bilişsel bozukluğu anlamada ilerleme, ve daha sonra cinsiyete özgü tedaviler geliştirme, kısmen fonksiyonel çalışmalarda fare modellerinden beyin mikrosirkülasyon soruşturma zorlukları ile sınırlı olmuştur. Burada, fare beyninden ex vivo hipokampal kapiller-parenkimal arteriyol (HiCaPA) preparatında kapiller-arteriyol sinyalini incelemek için bir yaklaşım salıyoruz. Kapiller stimülasyona yanıt olarak arterioler çapı ölçmek için mikrosirkülasyonu nasıl izole edebileceğimizi, kanülasyonu nasıl bastırabileceğimizi ve basınçlendirebileceğimizi anlatıyoruz. Biz uygun fonksiyonel kontroller HiCaPA hazırlık bütünlüğünü doğrulamak ve tipik sonuçlar görüntülemek için kullanılabilir göstermek, bir nörovasküler kaplin ajan olarak potasyum test ve Kir2 içe doğrulayan potasyum kanal ailesinin son karakterize inhibitörü etkisi de dahil olmak üzere, ML133. Ayrıca, erkek ve dişi farelerden elde edilen preparatlarda yanıtları karşılaştırıyoruz. Bu veriler fonksiyonel araştırmaları yansıtırken, yaklaşımımız moleküler biyoloji, immünkimya ve elektrofizyoloji çalışmalarında da kullanılabilir.

Giriş

Beyin yüzeyinde pial dolaşım çok çalışmanın nesnesi olmuştur, kısmen deneysel erişilebilirlik nedeniyle. Ancak serebral vaskülatürün topolojisi farklı bölgeler oluşturur. Kan akışını yönlendirmek için önemli kapasite ile anastomozlar açısından zengin sağlam pial ağ aksine, intraserebral parenkimal arterioller (PAs) mevcut sınırlı teminat kaynağı, her biri sinirdokusununayrı bir hacim perfüzyon 1,2. Bu, benzersiz fizyolojik özellikleri ile birlikte3,4,5,6,....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Tüm deneyler Colorado Üniversitesi, Anschutz Tıp Kampüsü Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylandı ve Ulusal Sağlık Enstitüleri yönergelerine göre yapıldı.

1. Çözümler

  1. Diseksiyon için MOPS-tamponlu tuzlu kullanın ve numuneleri kullanılmadan önce 4 °C'de tutun. Çözeltiye gaz yapmayın. Aşağıdaki bileşimi ile MOPS tamponlu tuzlu hazırlayın: 135 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM KH2PO4, 1 mM MgSO4, 2.5 mM CaCl2, 5 mM glikoz, 3 mM MOPS, 0.02 mM EDTA, 2 mM piruvat, 10 mg/mL büyükbaş serum albumin, pH 7.3 4 °C.
  2. Banyo çözeltisi ve pipet çözeltisi olarak yapay beyin ....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Endotel küçük iletkenliği (SK) ve ara iletkenlik (IK) Ca2+duyarlı K+ kanalları PA'ların çapı üzerinde dilatrasyon etkisi uygular. Sentetik IK ve SK kanal agonisti olan 1 μM NS309'un banyo uygulaması maksimal genişlemeye neden olur(Şekil 2A,B). Ancak, kapiller endotel hücreleri IK ve SK kanalları eksikliği ve NS30920yanıt olarak hiperpolarize vermedi. Sonuç olarak, fokal basınç ejeksiyonu (20 s, 5 .......

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Bu el yazmasında açıklanan basınçlı HiCaPA (hipokampal kapiller-parenkimal arteriyol) hazırlığı, parenkimal arteriyol29'u izole etmek, basınçlandırmak ve çalışma prosedürümüzün bir uzantısıdır29. Yakın zamanda beyin kapiller endotel hücrelerinde Kir2.1 kanallarının sinirsel aktivasyonile ilişkili [K+]o hissartışları olduğunu ve yukarı yayılan arteriyoles20'yigenişleten bir hiperpolarize sinyal ürettiğini bildirdik. Kılcal damarlar için bu daha önce bek.......

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Teşekkürler

Yazarlar, Jules Morin'e el yazması hakkındaki anlayışlı yorumları için teşekkür etmek isterler. Bu araştırma, KAR Amacı Gütmeyen Umut Organizasyonumuz, Kadın Sağlığı ve Araştırma Merkezi ve NHLBI R01HL136636 (FD) tarafından finanse edilmiştir.

....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
0.22 ve mikro; m Şırınga FiltreleriCELLTREAT Bilimsel Ürünler229751
12-0 Naylon (12cm) SiyahMikrocerrahi Aletleri, IncS12-0 NAYLON
Otomatik Sıcaklık Kontrol CihazıWarner InstrumentsTC-324B
Borosilikat Cam OD: 1.2 mm, İç Çap: 0.68 mmSutter InstrumentsB120-69-10
Sığır serum albüminiSigma-AldrichA7030
CaCl2 dihidratSigma-AldrichC3881
D-(+)-GlukozSigma-AldrichG5767
Diseksiyon KapsamıOlympusSZ11
ECOLINE VC-MS/CA 4-12 — Sürücülü ve MS/CA 4-12 pompa kafalı komple pompaIsmatecISM 1090
EGTASigma-AldrichE4378
İnce Makas - Keskinİnce Bilim Araçları14063-09
Sıralı Su IsıtıcıWarner InstrumentsSH-27B
Integra™ Milteks ve ticaret; Doku ForsepsFisher Scientific12-460-117
KClSigma-AldrichP9333
KH2< / sub>PO4< sub>Sigma-AldrichP5379
Magnezyum sülfat heptahidratSigma-AldrichM1880
MgCl SusuzSigma-AldrichM8266
MikromanipülatörNarishigeMN-153
ML 133 hidroklorürTocris4549
MOPSSigma-AldrichM1254
NaClSigma-AldrichS9625
NaH2< / sub>Psub< / sub>Sigma-AldrichS9638
NaHCO3< / sub>Sigma-AldrichS8875
NS309Tocris3895
Picospritzer III - Hücre İçi Mikroenjeksiyon Dağıtım Sistemleri, 2 kanallıParker Hannifin052-0500-900
Peristaltik Pompalı Basınç Servo KontrolYaşam Sistemleri EnstrümantasyonuPS-200
Sodyum piruvatSigma-AldrichP3662
Süper İnce ForsepsGüzel Bilim Aletleri11252-20
Cerrahi Makas - Keskin-KüntGüzel Bilim Aletleri14001-13
Dikey Mikropipet ÇektirmeNarishigePP-83
Cihazı

Kaynaklar

  1. Nishimura, N., Schaffer, C. B., Friedman, B., Lyden, P. D., Kleinfeld, D. Penetrating arterioles are a bottleneck in the perfusion of neocortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (1), 365-370 (2007).
  2. Shih, A. Y., et al.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Hipokampal K lcal ArteriyolEx Vivo Haz rl kBas n MiyografisiArteriyol ap l mK lcal Damar Stim lasyonuKir2 nhibit r ML133Potasyum N rovask ler KenetlenmeCinsiyete zg Yan tlarDamar Kan lasyon Tekni iMikrosirk lasyon zolasyonu