Yöntem makalesi

Lipophilic Floresan Boyalar Kullanarak Drosophila Embriyonik Motor Nöronların Retrograd İzleme

6K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/60716

⸱

12 Ocak 2020

 ,  , 
1Department of Cellular Biology, University of Georgia

Bu makalede

Özet

Biz lipophilic floresan boyalar kullanarak Drosophila embriyonik motor nöronların retrograd izleme için bir yöntem açıklar.

Özet

Biz Drosophilamotor nöronların retrograd etiketleme için bir teknik açıklar. Yağda çözünmüş lipophilic boya kullanıyoruz ve mikroenjektör tarafından embriyonik fileto hazırlığına küçük bir damlacık sıyoruz. Membranı damlacıkla temas eden her motor nöron daha sonra hızla etiketlenebilir. Bireysel motor nöronlar sürekli olarak etiketlenir ve ince yapısal detayların net bir şekilde görüntülenmesini sağlar. Lipophilic boyalar çeşitli renklerde gelir göz önüne alındığında, teknik de çok renkli etiketli komşu nöronlar almak için bir araç sağlar. Bu izleme tekniği bu nedenle Drosophilamotor nöron sisteminde nöronal morfogenez ve sinaptik bağlantı incelenmesi için yararlıdır.

Giriş

Drosophila embriyonik motor nöron sistemi merkezi sinir sisteminin gelişiminin altında yatan mekanizmaları analiz etmek için güçlü bir deneysel model sunuyor (CNS)1,2,3. Motor nöron sistemi biyokimyasal, genetik, görüntüleme ve elektrofizyolojik tekniklere uygundur. Teknikler kullanılarak, genetik manipülasyonlar ve fonksiyonel analizler tek motor nöronlar düzeyinde yapılabilir2,4,5,6.

Sinir sisteminin erken gelişimi sırasında, nöroblastlar bölmek ve glia ve nöronların çok sayıda üretmek. Delaminasyon ve nöroblastların gen ekspresyonu profili arasındaki spatiotemporal ilişki daha önce ayrıntılı olarak araştırılmıştır7,8,9. Motor nöron sistemi durumunda, embriyonik nöromüsküler kavşak oluşumu (NMJ) kapsamlı aCC kullanılarak çalışılmıştır (ön köşe hücresi), RP2 (ham karides 2), ve RP5 motor nöronlar2,10. Örneğin, RP5 motor nöron bir doğmakta olan sinaptik kavşak formları, pre-sinaptik ve post-sinaptik filopodia11,12,13. Bu tür doğrudan hücresel iletişim NMJ oluşumunu başlatmak için hayati önem taşımaktadır. Periferik sinir dalları hakkında bildiklerimizin aksine, motor dendritlerin CNS içinde sinaptik bağlantıyı nasıl başlattığına dair bilgimiz hala ilkeldir.

Bu raporda, lipophilic boyaların mikropipet aracılı teslimatı ile embriyolarda motor nöronların retrograd etiketlemesağlayan bir teknik sokuldu. Bu teknik bize 38 motor nöronlar her 30 vücut duvarı kasları bir hemi segmentinde innerve izlemenizi sağlar 15 saat sonra yumurta yumurtlama (AEL)14. Bu tekniği kullanarak, grubumuz iyice çok sayıda kazanç-of-fonksiyon / fonksiyon kaybı alel15,16,17araştırdı. Biz son zamanlarda motor dendrite bağlantısı nın başlatılması sürücü moleküler mekanizmaları çözdük ve bir Dscam1-Dock-Pak etkileşimi aCC motor nöron dendrite outgrowth site tanımlar gösterdi17. Genel olarak, bu teknik vahşi tip veya mutant suşları herhangi bir embriyonik motor nöronların fenotipik analizi için uyarlanabilir, Drosophila sinir sisteminin fonksiyonel tasarımı içine yeni anlayışlar sağlamak için yeteneğimizi artırarak.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

1. Ekipman ve Sarf Malzemeleri

  1. Embriyo toplamak ve yetişkinleri yumurtlamak için eğitmek için malzemeler
    1. 50 mL'lik bir tüpü keserek ve kapakta bir delik açarak filtreleme aparatıhazırlayın ve tüp ile kapak arasında 100 μm 'lik(Malzeme Tablosu)gözenekli bir örgü filtre ayarlayın.
      NOT: Alternatif olarak, embriyo toplamanın filtrasyon basamaşlarında 100 μm(Malzeme Tablosu)gözenekli hücre süzgeci kullanılabilir.
    2. Listelenen talimatlara göre üzüm agar premix(Malzeme Tablosu)ile agar plakaları olun. Kısaca, 1 paket toz karışımını oda sıcaklığında 500 mL (RT, 23 °C) dH2O ve mikrodalga da çözünmüş karışımı iyice kaynatın. 70−75 °C'ye kadar soğuttuktan sonra karışımı Petri kaplarına (60 mm) dökün. Agar katılaştırıladıktan sonra plakaları 4 °C'de saklayın.
    3. Aktif kuru mayayı(Malzeme Tablosu)karıştırarak maya hamurunu hazırlayın ve bir macun kıvamında su layın ve 4 °C'de tutun.
    4. Yeterli hava akışı sağlayan yumurta toplama kafesleri (60 mm Petri kabı, Malzeme Tablosuiçin) kullanın.
  2. Diseksiyon iğnelerinin ve boya enjeksiyon mikropipetlerinin hazırlanması
    1. 0,6 mm iç çapı ve 1,2 mm dış çapı ile aynı kılcal borudan boya enjeksiyonmikropipet ve diseksiyon iğnesi hazırlayın(Malzeme Tablosu). 170 V maksimum çıkıştan(Malzeme Tablosu)%7 oranında bir mikropipet çekmecesi ile kılcal boruyu çekin ve uzunluğu ~0,4 cm'lik bir konikle keskin bir iğne oluşturun.
    2. Boya enjeksiyonu için, mikropipeti, aletin el kitabında tanımlanan bir kabarcık beveling tekniği ile bir mikropipet beveler(Malzeme Tablosu)ile ayarlayın.
      1. Kısacası, iğne ucunu 'sürükleyerek' su önlemek için bir ıslatma maddesi(Malzeme Tablosu)ile öğütücü ıslatın. İğneyi 25−30° de mikropipet kelepçesine yerleştirin ve ucu yarıçapın üçte ikisine indirin. Mikropipetin cam talaşlardan arındığından emin olmak için, borulu bir şırınga havayı iğneye doğru iterken iğneyi öğütün.
      2. Bir açıda oluşan mikropipetin dar açıklığı bulmak zor olduğu için, beveling sonra ucundaki açılış konumunu belirtmek için ince uçlu kalıcı marker ile mikropipet işaretleyin.

2. Embriyo Toplama Hazırlığı

  1. Yetişkin sineklerin (20−40 vahşi tip Kton-S veya beyaz sinekler), erkek ve dişilerin, genç (<7 gün) ve ideal yumurta toplama için sağlıklı koşullarda muhafaza edilmesini sağlayın.
    NOT: Yumurta yumurtlamayı teşvik etmek için sinekler, her gün en az bir kez maya macunu ile süslenmiş agar tabaklarında yumurta toplamadan birkaç gün önce yumurta toplama kafesinde eğitilirler.

3. Embriyo Evreleme

  1. Sinekler bir gecede yumurtlamak için izin (ya da en az 15 saat) RT de embriyoları toplamak için 15 h AEL, yani, evre 1618, aCC ve RP3 motor nöronların dendritogenezi görüntülemek için. Sabah, yumurta ile plaka toplamak.
    NOT: 15 saat AEL'deki embriyolar 4 odacıklı ayrı bir bağırsak18olacaktır. Farklı aşamaları görüntüleme için kendi özel morfolojik kriterleri ve yaşlanma koşulları izleyin.
  2. Embriyoları toplamak için, 5 dakika boyunca% 50 çamaşır suyu ile plaka üzerine yatırılan yumurta dekorionate.
  3. Korolar temizlendikten sonra, embriyoları izole etmek için plakanın içeriğini filtrasyon aparatı veya hücre süzgecinden geçirin. Bir sıkma şişesi su kullanarak, plaka üzerinde kalan çamaşır suyunu seyreltin ve karışımı filtreye ayırarak mümkün olduğunca çok embriyo toplayın.
  4. Embriyoları filtrede 3−4x daha fazla suyla veya çamaşır suyu kokusu dağılına kadar yıkayın. Filtreyi cihazdan çıkarın ve embriyoları suyla başka bir temiz tabağa yıkayın. Embriyoların üzerinde olduğu yeni plakadan suyu çıkar.
  5. Bir dikdörtgen oluşturan, merkezinde vinil bant iki kat ile kaplayarak bir cam slayt hazırlayın. Jilet kullanarak banttan dikdörtgen bir havuz kesin. Havuzun üst ucuna doğru ince bir çift taraflı bant şeridi yerleştirin, burada embriyolar Şekil 1'degösterildiği gibi yerleştirilecektir.
  6. İnce şıklar kullanarak, 15 saat AEL'de 5−10 embriyoyu tek tek seçin ve sırt tarafı yukarı bakacak şekilde çift taraflı bandA yerleştirin. Embriyoları kurutmalardan korumak için böcek Ringer'ın salin19'unu diseksiyon havuzuna ekleyin (Şekil 1).

4. Diseksiyon ve Boyama

  1. Bir diseksiyon mikroskobu(Malzeme Tablosu)altında cam bir iğne kullanarak, onun arka dan ön ucuna yüzeyinde tek bir embriyonun orta hattı ile kesti. Daha sonra embriyoyu vitellin membranından banttan cama sürükleyin (Şekil 1'dekutulanır). Embriyonun iç dokularına zarar vermemeye dikkat edin.
  2. Epitel dokuları merkezden çevirin ve epidermal kenarı cam kaydıraktan yüzeye takın(Şekil 1,inset).
  3. ~300 μm 'lik bir uç açıklığı olan tüpe bağlı bir iğne kullanmak (diseksiyonu iğnenin ince ucunu kırarak hazırlanır), dorsal uzunlamasına trakeal gövdeleri ve kalan bağırsakları ayırmak ve çıkarmak için havayı aspire etmek veya üflemek.
  4. Embriyoları 5 dakika lığına rt. Wash embriyoları PBS ile 3x yıkamak için fosfat tamponlu salin (PBS) % 4 paraformaldehit (PFA) kullanın.
  5. 1 saat boyunca 200 μL PBS'de siyanin 3 boya (anti-HRP Cy3)(Malzeme Tablosu)ile konjuge 1 μL anti-horseradish peroksidaz antikor ile embriyoları lekelayın.
    NOT: Anti-HRP boya enjeksiyon için tercih lipophilic boyalar dayalı değiştirilebilir.

5. Enjeksiyon Mikro-pipet dolum

  1. Isı lipophilic boyalar (5 mg / mL DiO veya DiD, Malzeme Tablosu) için 60 °C etanol bir 1:10 karışımı: bitkisel yağ kullanmadan önce.
  2. Enjeksiyon mikropipeti için yağda çözünmüş bir boya kaydırağı hazırlayın. Mikropipeti kılcal tutucuya yerleştirin(Şekil 2, #1). Mikromanipülörü(Malzeme Tablosu)kullanarak, mikropipeti boya kaydırağının üzerinde olacak şekilde ayarlayın. Daha sonra, mikropipeti boyanın üzerine yerleştirmek için sahneyi ayarlayın(Şekil 2, #2).
  3. Mikropipeti doldurmak için bir mikroenjektör(Malzeme Tablosu)kullanın (Şekil 2, #3). Pi (enjeksiyon basıncı) 200−500 hPa (hektopascal), Ti (enjeksiyon süresi) 0,1−0,5 s ve Pc (kompanzasyon basıncı) ile 0 hPa arasında 5 dakika(Şekil 2, #4) arasında ayarlayarak boyayı mikropipette toplayın.
  4. Boya toplandıktan sonra boya kaydırağını çıkarın ve örneği mikroskop aşamasına yerleştirin. Daha sonra, pbs'nin kapiller etki ile kontaminasyonunu önlemek için mikropipeti numuneye indirmeden önce Pc'yi 20−60 hPa aralığına yükseltin.

6. Nöronlara Boya Enjeksiyonu

  1. 10x objektif lens(Malzeme Tablosu)ile mikroskop kullanarak merkezinde embriyo bulmak ve embriyo ile mikropipet hizalamak.
    NOT: Boya damlacığının boyutu Pi veya mikropipet ucunun açılmasının boyutu değiştirilerek ayarlanabilir. Damlacık yaklaşık 1 kas genişliği 10−20 μm olmalıdır.
  2. Objektif lensi bir su daldırma 40x lens(Malzeme Tablosu)ile değiştirin ve embriyoyu görmek için lensi PBS'ye batırın.
    1. Anti-HRP Cy3 ile işaretlenmiş nöronal morfolojiyi kontrol etmek ve enjeksiyon bölgesini belirlemek için floresan mikroskobu kullanın.
    2. Enjeksiyon sırasında, boya damlacık görmek için brightfield mikroskobu kullanın. Embriyo odakta olduğunda, ilgi akson ucu ile nazik temas yapmak için mikropipet konumunu değiştirmek (örneğin, aCC, RP3).
    3. Boyayı anti-HRP Cy3 ile işaretlenmiş nöronları kullanarak, ACC veya RP3 'ün nöromüsküler kavşağında(Şekil 3)DiD veya DiO ile sağ karına (A2−A6) hemi segmentine bırakın. El kontrolünü kullanma (fare; Şekil 2, 5) boyayı bırakın ve mikromanipülatörile boyayı bıraktıktan sonra mikropipeti çıkarın ve bir sonraki enjeksiyon bölgesine geçin.
      NOT: Boşluk kavşakları aracılığıyla komşu hücrelere yayılan diğer boyaların (örneğin, Lucifer sarısı, kalsin) aksine, lipophilic boyalar hücre zarları ile ilişkilendirmek ve komşulara transfer olmaz. Boya damlacıknispeten büyük boyutu nedeniyle, ancak, bu teknik de ortak kasların etiketleme ile sonuçlanır (Şekil 3A).
  3. Görüntülemeden önce boya damlatmadan sonra numuneyi 1 saat boyunca RT'ye yatırın.
    NOT: Protokol montajdan önce burada duraklatılabilir ve numune bir gecede 4 °C'de tutulabilir. Lipophilic boyalar da iyontoforez kullanılarak teslim edilebilir, bir hücre içi doğrudan birleştiğinde (DC) amplifikatör hazır ise20.

7. Konfokal Mikroskopile Görüntüleme

  1. Çift taraflı bandı ve vinil bandı çifenipler yardımıyla cam kaydıraktan çıkarın.
  2. Dört köşeye az miktarda vakum yağı(Malzeme Tablosu)ile bir kapak fişi (22 x 22 mm22 mm 2 No.1 kapak camı) hazırlayın ve hava kabarcıklarından kaçınarak numunenin üzerine dikkatlice yerleştirin. Görev sileceklerini kullanarak fazla PBS'yi kaldırın.
  3. Objektif lens ile numune arasındaki çalışma mesafesini ayarlamak için kapak fişini aşağı itin. Tamamen oje ile kapak kayma kenarları mühür.
  4. Bir konfokal mikroskop kullanarak 10x ve 100x büyütme görüntü.
  5. Mikroskoptan(Malzeme Tablosu)ham görüntüleri işlemek için ImageJ yazılımını kullanın.
    NOT: Gözlem en iyi görüntüler için montaj dan sonra 10 dakika içinde başlamalıdır. Aksi takdirde, RT, boya görüntüleme için istenmeyen arka plan oluşturarak enjeksiyon sitesine bitişik sitelere yayılır. Boyanın difüzyonu yavaşlatmak için numune 4 °C'de birkaç saat saklanabilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

ACC ve RP3 motor nöronların temsili bir görüntüsü Şekil 3C'de motor nöronların 15 saat AEL'de çok renkli etiketlemesini göstermek için gösterilmiştir. Dendritik morfolojileri embriyolar arasında büyük ölçüde değişmezdir. Anti-HRP antikorile elde edilen boyama deseni gri renkte gösterilmiştir. DiO veya DiD küçük bir damlacık kas NMJ yatırıldı 1 veya 6 /7, sırasıyla. Şekil 4, ilginin fenotipini nicel olarak ölçme yeteneğini göstermektedir. Biz vah...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Nöronal morfolojiyi incelemek için boya etiketlemekullanımının genetik hücre etiketleme tekniklerine göre birçok avantajı vardır. Boya etiketleme tekniği, motor nöronların morfolojilerinin etiketlenmesi ve görüntülenmesi için gereken süreyi en aza indirebilir. Boya etiketleme işlemi 2 saatten az sürer ve nöronal projeksiyonların ana hatlarını tanımlamamızı sağladığından oldukça hızlıdır. Alternatif olarak, bir aCC maya GAL4 transkripsiyon faktörü ifade eden bir GAL4 hattı seçerek aCC motor nöron görselleştirmek ve yukarı...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Teşekkürler

Biz el yazması üzerinde yorum için Kamiyama Lab üyelerine teşekkür ederiz. Bu çalışma NIH R01 NS107558 (M.I., K.B., ve D.K.) tarafından desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
10x objektif lensNikonPlan
40x suya daldırmalı lensNikonNIR Apo Kılcal
boruFrederick Haer & Co27-31-1
Konfokal mikroskopAndorN/ADragonfly Eğirme diski konfokal ünite
Kapak camıCorning22x22 mm Kare #1
DiDThermoFisherV22886
DiIThermoFisherV22888
DiOThermoFisherV22887
Diseksiyon mikroskobuNikonN/ASMZ-U
Çift Taraflı BantScotch665
Dow Corning Yüksek Vakumlu GresFisher Sci.14-635-5D
Dumont #5 ForsepsGüzel Bilim Araçları11252-20
Yumurta toplama kafesiFlyStuff59-100
FemtoJet 5247EppendorfFemtoJet 4i'yi durdurdu (Cat No. 5252000021)
ImageJNIHGörüntü işleme yazılımı
MikromanipülatörSutterMP-225
Mikropipet bevelerSutterBV-10-B
İğne çektirmeNarishigePC-100
Nutri-Fly Üzüm Agar Tozu Premiks PaketleriFlyStuff47-102
Naylon NetFiltre Kırlangıç
Paraformaldehit% 16 Çözelti, EM sınıfıElektron Mikroskobu Bilimleri15710Herhangi bir EM sınıfı
PBSRoche11666789001Sigmaaldrich'te satılır, kutulu 10x solüsyon
Photo-Flo 200Kodak146 4510Islatıcı ajan
Dik floresan mikroskobuNikonN/AEclipse Ci, LED ışık kaynağı ile
Vinil ElektrikBandı Scotch6143
VWR Hücre SüzgeçleriVWR10199-659
MayaFlyStuff62-103Aktif kuru maya (RED STAR)
,

Kaynaklar

  1. Arzan Zarin, A., Labrador, J. P. Motor axon guidance in Drosophila. Seminars in Cell and Developmental Biology. 85, 36-47 (2019).
  2. Nose, A. Generation of neuromuscular specificity in Drosophila: novel mechanisms revealed by new technologies. Frontiers in Molecular Neuroscience. 5, 62(2012).
  3. Kim, M. D., Wen, Y., Jan, Y. N. Patterning and organization of motor neuron dendrites in the Drosophila larva. Developmental Biology. 336 (2), 213-221 (2009).
  4. Manning, L., et al. A resource for manipulating gene expression and analyzing cis-regulatory modules in the Drosophila CNS. Cell Reports. 2 (4), 1002-1013 (2012).
  5. Featherstone, D. E., Chen, K., Broadie, K. Harvesting and preparing Drosophila embryos for electrophysiological recording and other procedures. Journal of Visualized Experiments. (27), e1347(2009).
  6. Chen, K., Featherstone, D. E., Broadie, K. Electrophysiological recording in the Drosophila embryo. Journal of Visualized Experiments. (27), e1348(2009).
  7. Doe, C. Q. Temporal Patterning in the Drosophila CNS. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 33, 219-240 (2017).
  8. Homem, C. C., Knoblich, J. A. Drosophila neuroblasts: a model for stem cell biology. Development. 139 (23), 4297-4310 (2012).
  9. Urbach, R., Technau, G. M. Neuroblast formation and patterning during early brain development in Drosophila. Bioessays. 26 (7), 739-751 (2004).
  10. Carrero-Martínez, F. A., Chiba, A. Cell Adhesion Molecules at the Drosophila Neuromuscular Junction. The Sticky Synapse: Cell Adhesion Molecules and Their Role in Synapse Formation and Maintenance. Umemori, H., Hortsch, M. , Springer. New York. 11-37 (2009).
  11. Ritzenthaler, S., Suzuki, E., Chiba, A. Postsynaptic filopodia in muscle cells interact with innervating motoneuron axons. Nature Neuroscience. 3 (10), 1012-1017 (2000).
  12. Kohsaka, H., Takasu, E., Nose, A. In vivo induction of postsynaptic molecular assembly by the cell adhesion molecule Fasciclin2. Journal of Cell Biology. 179 (6), 1289-1300 (2007).
  13. Kohsaka, H., Nose, A. Target recognition at the tips of postsynaptic filopodia: accumulation and function of Capricious. Development. 136 (7), 1127-1135 (2009).
  14. Landgraf, M., Bossing, T., Technau, G. M., Bate, M. The origin, location, and projections of the embryonic abdominal motorneurons of Drosophila. Journal of Neuroscience. 17 (24), 9642-9655 (1997).
  15. Kamiyama, D., Chiba, A. Endogenous activation patterns of Cdc42 GTPase within Drosophila embryos. Science. 324 (5932), 1338-1340 (2009).
  16. Furrer, M. P., Vasenkova, I., Kamiyama, D., Rosado, Y., Chiba, A. Slit and Robo control the development of dendrites in Drosophila CNS. Development. 134 (21), 3795-3804 (2007).
  17. Kamiyama, D., et al. Specification of Dendritogenesis Site in Drosophila aCC Motoneuron by Membrane Enrichment of Pak1 through Dscam1. Developmental Cell. 35 (1), 93-106 (2015).
  18. Campos-Ortega, J. A., Hartenstein, V. The embryonic development of Drosophila melanogaster. , Springer-Verlag. Berlin, Germany. (1985).
  19. Drosophila Ringer's solution. Cold Spring Harbor Protocols. 2007 (4), (2007).
  20. Rickert, C., Kunz, T., Harris, K. -L., Whitington, P., Technau, G. Labeling of single cells in the central nervous system of Drosophila melanogaster. Journal of Visualized Experiments. (73), e50150(2013).
  21. Fujioka, M., et al. Even-skipped, acting as a repressor, regulates axonal projections in Drosophila. Development. 130 (22), 5385-5400 (2003).
  22. Sink, H., Rehm, E. J., Richstone, L., Bulls, Y. M., Goodman, C. S. sidestep encodes a target-derived attractant essential for motor axon guidance in Drosophila. Cell. 105 (1), 57-67 (2001).
  23. Furrer, M. P., Kim, S., Wolf, B., Chiba, A. Robo and Frazzled/DCC mediate dendritic guidance at the CNS midline. Nature Neuroscience. 6 (3), 223-230 (2003).
  24. Landgraf, M., Jeffrey, V., Fujioka, M., Jaynes, J. B., Bate, M. Embryonic origins of a motor system: motor dendrites form a myotopic map in Drosophila. PLoS Biology. 1 (2), 41(2003).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Drosophila Motor N ronlarMikroenjeksiyon Tekni iEmbriyonik Fileto Haz rlFloresan MikroskopiKonfokal MikroskopiN ronal MorfogenezSinaptik Ba lant sall kBoya Enjeksiyon Protokol

İlgili makaleler