Burada fare tümörü ksenogreft modellerinde antikorların in vivo lokalizasyonunu incelemek için bir protokol sayılmaktadır.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Hedef Antijen Spesifik Terapötik Antikor tümör ve doku dağılımının analizi
* These authors contributed equally
Bu makalede
Özet
Özet
Monoklonal antikorlar kanser hücrelerini ortadan kaldırmak için değişken bağımsız mekanizmalar tarafından çalışan yüksek afiniteli çok fonksiyonlu ilaçlardır. Son birkaç on yıl içinde, antikor-ilaç konjugeler alanı, bispesifik antikorlar, şimerik antijen reseptörleri (CAR) ve kanser immünoterapi temel ve terapötik araştırmaların en umut verici alan olarak ortaya çıkmıştır. Bir atılım hızında lösemi ve melanom bağışıklık kontrol noktası reseptörleri ve CAR-T hücreleri hedefleyen çok sayıda başarılı insan çalışmaları ile, antikor mühendisliği varyasyonları türetilen onkolojik terapötikler için son derece heyecan verici bir kez. Ne yazık ki, antikor ve CAR bazlı terapötik önemli ölçüde çok sayıda da tümör yatağında bağışıklık efektörü hücrelerin sınırlı durumu nedeniyle katı kanserlerin insan çalışmalarda hayal kırıklığı kanıtlamıştır. Daha da önemlisi, tümörler dışındaki dokularda terapötik antikorların nonspesifik dağılımı da klinik etkinlik eksikliğine katkıda, ilişkili toksisite ve klinik yetmezlik. Preklinik çalışmaların insan klinik izlerine sadık çevirisi farelertümörü ksenogreft etkinliği ve güvenlik çalışmalarına dayandığı için, burada tümörün ve terapötik antikorların genel doku dağılımının test edilmesi için bir yöntem vurgulanmaktadır. Bu protein-A saflaştırılmış antikor yakın Kızılötesi floresan boya ile etiketlenmesi ile elde edilir tümör taşıyan farelerin canlı görüntüleme takip.
Giriş
FDA ilk monoklonal antikor hedefleyen CD3 onayladı (OKT3, Muromonab) içinde 1 ,2. O zamandan beri önümüzdeki yirmi yıl için, bağışıklık kontrol noktası inhibitörleri karşı antikorların ezici başarısı nedeniyle antikor mühendisliği alanında hızlı bir patlama olmuştur3. Bağışıklık sisteminin dolaylı aktivasyonu yanında, antikorlar doğrudan bağışıklık efektörü hücreleri meşgul etmek için kanser hücrelerinin bayrak hedeflenmektedir, ölüm reseptör agonist yoluyla sitotoksisite tetiklemek, blok tümör hücre sağkalım sinyali, obstrüktif anjiyogenez (kan damarlarının büyümesi), kısıtlama bağışıklık kontrol noktası düzenleyicileri, konjuge ajanlar olarak radyoizopes, kemoterapi ilaçları ve siRNA teslim2. Buna ek olarak, hasta türetilmiş T-hücreleri ve NK hücreleri (CAR-T ve CAR-NK) yüzeyinde çeşitli antikorların tek zincir değişken parçaları (scFv) incelenmesi hücre tabanlı tedaviler için klinik araştırmaların hızlı büyüyen bir alandır4.
Tümör hücrelerini ifade eden antijene seçicilik sağlayan antikor bazlı ilaçların aşırı yüksek yakınlığı onu çekici bir ajan haline getirir. Aynı şekilde, terapötik bir antikor hedefli doğum ve tümör tutma (veya kimyasal bir ilaç) toksisite üzerinde etkinliğini dengelemek için anahtardır. Bu nedenle, içeren ancak bispesifik5 ve üç spesifik antikorlar6 ile sınırlı değildir protein mühendisliği tabanlı stratejiler çok sayıda önemli ölçüde intravenöz (IV) enjekte terapötik tümör retansiyonu optimize tümör retansiyonu geliştirmek için yararlanılmaktadır5,7. Burada, potansiyel olarak etkili anti-kanser antikorlarının tümör ve doku dağılımını ele almak için basit bir floresan tabanlı yöntemi tanımlıyoruz.
Hayvan dokuları görünür spektrumda heyecanlandığında otomatik floresana sahip olduğundan, antikorlar başlangıçta kızılötesi boyanın yakınında (örneğin, IRDye 800CW) etiketlenmiştir. Kavram araştırmaları için folat reseptör alfa-1 (FOLR1) farletuzumab denilen antikor ve onun türevi olarak adlandırılan Bispesifik çapa Sitotoksisite aktivatör (BaCa)7 antikor bu co-targets FOLR1 ve ölüm reseptör-5 (DR5)8 bir rekombinant antikor kullandık. FOLR1 yumurtalık ve TNBC kanser hücrelerinde, tümör ksenogreftlerinde ve hasta tümörlerinde iyi tanımlanmış aşırı ekspres hedef reseptördür9. Özellikle, klinik yumurtalık ve meme kanserleri için bağışıklık efektörü hücreleri ve antikor ilaç konjugeler (ADC) meşgul antikor tabanlı yaklaşımlar kullanarak FOLR1 yararlanmak için birden fazla çaba vardır10,11.
Bu yöntem de, biz klonlanmış, ifade ve klinik anti-FOLR1 (farletuzumab) cho ifade sistemi kullanarak diğer kontrol antikorları ile birlikte saflaştırılmış. IgG1 isotipi ve abagovomab12 adı verilen klinik anti-idiyotip-16 antikor negatif kontrol olarak kullanıldı. Protein-A arınmasını takiben, endike antikorlar IRDye 800CW ile etiketlendi ve yumurtalık tümörü ksenogreftleri taşıyan veya stably transfected insan FOLR1 gösteren çıplak farelerin kuyruk damarına uygulandı. Antikor lokalizasyonu canlı görüntüleme ile birden fazla farklı zaman noktalarında in vivo görüntüleme spektrumu kullanılarak izlendi7. Bu yöntem ışık emisyonsağlamak için herhangi bir genetik modifikasyon veya substrat enjeksiyon gerektirmez ve önemli ölçüde daha hızlı, maliyet etkin ve verimlidir. Aşağıda açıklanan genel klonlama, ifade, saflaştırma ve etiketleme protokolü, ağır ve hafif zincir dizileri mevcutsa herhangi bir klinik ve klinik olmayan antikora uygulanabilir.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Virginia Üniversitesi'ndeki Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından hayvanların işlenmesi ve tümör ksenogreftleri ile ilgili tüm prosedürler gözden geçirilerek onaylanmıştır ve ilgili mevzuat standartlarına uygun
1. Antikorların ekspresyonu ve saflaştırılması
- CHO hücrelerinin bakımı
- FreeStyle CHO Media'da CHO hücrelerini büyüyün, 37 °C'de 37 °C'de 130 rpm'de %5 CO2'de cam veya tek kullanımlık delong Erlenmeyer şişeleri kullanılarak sallanarak 1x glutamin takviyesi ile desteklenir.
NOT: Bu son derece artan ajitasyon için havalandırmalı kapaklı bir şaşkın şişe kullanılması ve titreme durumu sırasında gaz transferini artırmak için tavsiye edilir. Süspansiyon kültürünün sınırlı ajitasyonu nedeniyle düzenli şişelerle (şaşkın olmayan) önemli ölçüde azaltılmış antikor verimi elde edilmiştir. - Hücre sayısını 1-5 x 106
- FreeStyle CHO Media'da CHO hücrelerini büyüyün, 37 °C'de 37 °C'de 130 rpm'de %5 CO2'de cam veya tek kullanımlık delong Erlenmeyer şişeleri kullanılarak sallanarak 1x glutamin takviyesi ile desteklenir.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Açıklanan metodolojide, ilk olarak folat reseptöralfası alfa-1 'i (FOLR1) hedefleyen antikorları ve farletuzumab ve lexatumumab'dan oluşan BaCa adı verilen bispesifik bir antikor ile abagovomab gibi kontrol antikorları (Ek Dosya 1'deverilen diziler) klonladık. DNA klonları (pVH, pVL) temsili değişken ağır (VH) ve değişken ışık (VL) etki alanlarının ayrıntıları Şekil 1A'dagösterilmiştir. Pozitif klonları doğrulamak için, sinyal peptid ileri (SP For) ve CK Rev/CH3 Rev astarlar...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Anti-kanser terapötik ajan selektif ve tümör dokusu özel teslimat belirli bir hedefli tedavinin etkinliğini ve güvenliğini ölçmek içinanahtardır 13. Burada klinik, farletuzumab ve klinik olmayan BaCa antikorlarının ayrıntılı doku ve tümör dağılımını araştırmak için hızlı ve etkili bir yaklaşım tanımladık. Açıklanan yaklaşım yeni üretilen herhangi bir antikor için geçerlidir ve tümör / organ dağılımı özellikleri için klinik olarak etkili bir antikor (istenilen niteliklere sahip) yanında kullanılabi...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların rakip finansal çıkarları yoktur.
Teşekkürler
Biz Virginia Üniversitesi Kanser Merkezi Çekirdek Görüntüleme Tesisi, Biyomoleküler Analiz Tesisi, Gelişmiş Mikroskopi Tesisi ve Yardım için Core Vivarium Tesisi müteşekkiriz. J. T-S Yumurtalık Kanseri Akademisi (OCA-DoD) erken kariyer araştırmacısı. Bu çalışma NCI/NIH hibe (R01CA233752) j. T-S, ABD DoD Meme Kanseri Araştırma Programı (BCRP) atılım seviye-1 ödülü J. T-S (BC17097) ve U.S. DoD Yumurtalık Kanseri Araştırma Programı (OCRP) finansman ödülü (OC180412) J. T-S destek
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| FreeStyle CHO ortamı | Gibco Yaşam Teknolojileri | Kedi # 12651-014 | |
| Anti-Anti (100X) | Gibco Yaşam Teknolojileri | Kedi # 15240-062 | |
| Topaklanma Önleyici Ajan | Gibco Yaşam Teknolojileri | Kedi # 01-0057DG | |
| BD İnsülin Şırıngası | BD BioSciences | Cat # 329420 | |
| Kaliper IVIS Spektrumu | PerkinElmer | Kedi #124262 | |
| CHO CD EfficientFeed B | Gibco Yaşam Teknolojileri | Kedisi #A10240-01 | |
| Corning 500 mL DMEM (Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı) | Corning | Kedi # 10-13-CV | |
| Corning 500 mL RPMI 1640 | Corning Kedi | # 10-040-CV | |
| Cy5 konjuge Anti-İnsan IgG (H + L) | Jackson ImmunoResearch | Cat # 709-175-149 | |
| GlutaMax-I (100X) | Gibco Yaşam Teknolojileri | Kedi # 35050-061 | |
| HiPure Plazmid Maxiprep kiti | Invitrogen | Cat # K21007 | |
| HiTrap MabSelect SuRe Sütunu | GE Sağlık Kedisi | # 11-0034-93 | |
| İnfüzyon | Takara BioScience | STO344 | |
| IRDye 800CW NHS Ester | LI-COR | Kedi # 929-70020 | |
| İzofluran, USP | Covetrus | Kedi # 11695-6777-2 | |
| Kayganlaştırıcı Göz Merhem | Yenileme Lacri-Lube | Cat # 4089 | |
| Matrigel | Corning | Cat # 354234 | |
| PEI transfeksiyon reaktifi | Thermo Fisher | Cat # BMS1003A | |
| Slide-A-Lyzer Diyaliz Kasetleri | Thermo Scientific | Cat # 66333 | |
| Steritop Vakum Filtreler | Millipore Express | Cat #S2GPT02RE | |
| Trypsin-EDTA | Gibco Yaşam Teknolojileri | Kedi # 15400-054 | |
| Deneysel Modeller: Hücre hatları< / güçlü > | |||
| İnsan: OVCAR-3 | Amerikan Tipi Kültür Koleksiyonu | ATCC HTB-161 | |
| İnsan: CHO-K hücreleri | Kararlı Laboratuvarımızda dönüştürülen | ATCC CCL-61 | |
| Fare: 4T1 | Dr. Chip Landen, UVA'dan | ||
| Fare: MC38 | Dr. Suzanne Ostrand-Rosenberg, UMBC'den nazik hediye | STR profil oluşturma | |
| Fare: MC38 hFOLR1 | Laboratuvarımızda üretilmiştir (Bu makale) | ||
| Deneysel Modeller: Hayvan | |||
| Fareler: atimik Çıplak Foxn1nu/Foxn1+ | Envigo | Çoklu Siparişler | |
| Fareler: NOD.Cg Prkdcscid il2rgtm1Wjl/SzJ | Jackson Laboratuvarı | Çoklu Siparişler |
Kaynaklar
- Takahashi, K. Muromonab CD3 (Orthoclone OKT3). Journal of Toxicological Sciences. 20, 483-484 (1995).
- Tushir-Singh, J. Antibody-siRNA conjugates: drugging the undruggable for anti-leukemic therapy. Expert Opinion in Biological Therapy. 17, 325-338 (2017).
- Gravitz, L. Cancer immunotherapy. Nature. 504, 1(2013).
- Pagel, J. M., West, H. J. Chimeric Antigen Receptor (CAR) T-Cell Therapy. JAMA Oncology. 3, 1595(2017).
- Brinkmann, U., Kontermann, R. E. The making of bispecific antibodies. MAbs. 9, 182-212 (2017).
- Runcie, K., Budman, D. R., John, V., Seetharamu, N. Bi-specific and tri-specific antibodies- the next big thing in solid tumor therapeutics. Molecular Medicine. 24, 50(2018).
- Shivange, G., et al. A Single-Agent Dual-Specificity Targeting of FOLR1 and DR5 as an Effective Strategy for Ovarian Cancer. Cancer Cell. 34, 331-345 (2018).
- Wajant, H. Molecular Mode of Action of TRAIL Receptor Agonists-Common Principles and Their Translational Exploitation. Cancers (Basel). 11 (7), 954(2019).
- Necela, B. M., et al. Folate receptor-alpha (FOLR1) expression and function in triple negative tumors. PLoS One. 10, 0122209(2015).
- Lin, J., et al. The antitumor activity of the human FOLR1-specific monoclonal antibody, farletuzumab, in an ovarian cancer mouse model is mediated by antibody-dependent cellular cytotoxicity. Cancer Biology Therapy. 14, 1032-1038 (2013).
- Chen, Y., Kim, M. T., Zheng, L., Deperalta, G., Jacobson, F. Structural Characterization of Cross-Linked Species in Trastuzumab Emtansine (Kadcyla). Bioconjugate Chemistry. 27, 2037-2047 (2016).
- Bauerschlag, D. O., et al. Anti-idiotypic antibody abagovomab in advanced ovarian cancer. Future Oncology. 4, 769-773 (2008).
- Narita, Y., Muro, K. Challenges in molecular targeted therapy for gastric cancer: considerations for efficacy and safety. Expert Opinion in Drug Safety. 16, 319-327 (2017).
- Jordan, N. V., et al. HER2 expression identifies dynamic functional states within circulating breast cancer cells. Nature. 537, 102-106 (2016).
- Fakih, M., Vincent, M. Adverse events associated with anti-EGFR therapies for the treatment of metastatic colorectal cancer. Current Oncology. 17, Suppl 1 18-30 (2010).
- Koba, W., Jelicks, L. A., Fine, E. J. MicroPET/SPECT/CT imaging of small animal models of disease. American Journal of Pathology. 182, 319-324 (2013).
- van der Wall, E. E. Cost analysis favours SPECT over PET and CTA for evaluation of coronary artery disease: the SPARC study. Netherland Heart Journal. 22, 257-258 (2014).
- Van Dort, M. E., Rehemtulla, A., Ross, B. D. PET and SPECT Imaging of Tumor Biology: New Approaches towards Oncology Drug Discovery and Development. Current Computer Aided Drug Design. 4, 46-53 (2008).
- Dua, P., Hawkins, E., van der Graaf, P. H. A Tutorial on Target-Mediated Drug Disposition (TMDD) Models. CPT Pharmacometrics and System Pharmacology. 4, 324-337 (2015).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
