Meme bezi, dış miyoepitelyal ve iç luminal epitel hücrelerinden oluşan çift katmanlı bir yapıdır. Sunulan diferansiyel trippsinizasyon kullanarak organoidler hazırlamak için bir protokoldür. Bu verimli yöntem araştırmacılar ayrı ayrı meme bezi formu ve fonksiyonu rollerini ile ilgili soruları keşfetmek için bu iki hücre türleri işlemek için izin verir.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Diferansiyel Tripsinizasyon a göre Mozaik Meme Organoidlerinin Üretimi
Bu makalede
Özet
Özet
Organoidler, fizyolojik süreçleri bir yemeğin rahatlığıyla özetleyen kendi kendini organize eden, üç boyutlu doku yapıları sunar. Murine meme bezi farklı işlevlere hizmet veren iki farklı epitel hücre bölmesi oluşur: dış, kontraktil miyoepitelyal bölmesi ve iç, salgı luminal bölmesi. Burada, bu bölmelerden oluşan hücrelerin izole edildiği ve daha sonra meme bezi morfogenezine ve farklılaşmaya olan bireysel soy katkılarını araştırmak için biraraya geldiği bir yöntemi açıklıyoruz. Yöntem basit ve verimlidir ve floresan aktif hücre sıralama gibi gelişmiş ayırma teknolojileri gerektirmez. Bunun yerine, biz hasat ve enzimatik doku sindirmek, yapışık doku kültürü yemekleri üzerinde epitel tohum, ve sonra ~ 90% saflık ile luminal hücrelerden miyoepitel ayırmak için diferansiyel trippsinizasyon kullanın. Hücreler daha sonra kültürde 10 gün sonra süt üretmek için ayırt edilebilir çift katmanlı, üç boyutlu (3D) organoidler halinde organize bir hücre dışı matris plakalı. Genetik mutasyonların etkilerini test etmek için, hücreler vahşi tip veya genetiği değiştirilmiş fare modellerinden hasat edilebilir, ya da genetik olarak 3D kültürden önce manipüle edilebilir. Bu teknik, özellikle luminal veya miyoepitel bölmesi gen fonksiyonunun araştırılmasına olanak sağlayan mozaik organoidler oluşturmak için kullanılabilir.
Giriş
Meme bezi (MG) bir adiposit zengin stroma içinde gömülü bir ağaç gibi, tübüler epitel yapısıdır. İki katmanlı duktal epitel, kontraktilin dış, bazal tabakası, miyoepitel hücreleri (Myoecs) ve luminal, salgı epitel hücrelerinin (LECs) bir iç tabakası, merkezi bir lümen çevreleyen oluşur1. Emzirme sırasında dış MiyoECs iç alveoler LECs süt sıkmak için sözleşme, MG büyüme faktörleri (örneğin, EGF ve FGF) ve hormonlar (örneğin progesteron, insülin ve prolaktin kontrolü altında olan çok sayıda değişiklik uğrar, ve prolaktin). Bu değişiklikler, emzirme döneminde sütü sentezleyen ve salgılayan özel yapılar alveollerin farklılaşmasına neden olur
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Burada açıklanan tüm yöntemler California Üniversitesi, Santa Cruz Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır.
1. Gün 1: Meme bezi sindirim
- 10-14 haftalık olgun dişi farelerden MG'leri hasat etmeye hazırlanın.
- Aseptik koşullar altında açık bir bankta hasat gerçekleştirin.
- Ameliyattan önce 20 dakika boyunca %70 alkol le otoklavlama ve ıslatma ile tüm cerrahi malzemeleri, mantar panoları ve pimleri sterilize edin.
- 0.5 mL insülin şırınga ile intraperitoneal enjeksiyon yoluyla verilen sodyum pentobarbital (0.06 mg/g vücut ağırlığı 2X anestezik doz) ile hayvanları anestezik....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Burada sunulan protokol, mozaik organoidlerden yararlanılarak meme epitel hücrelerinin belirli soy katkılarını araştırmak için kullanılan bir yöntemi açıklamaktadır. Organoidler için primer minros hücreleri elde etmek için, meme bezi epiteli öncelikle çevredeki adiposit bakımından zengin stromadan izole edilmelidir (Şekil 1). Bu süreç burada kısaca açıklanmıştır ve daha önce yayınlanmış bir çalışmada18açıklanmıştır. Yeterli hücre elde .......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Burada, araştırmacıların birincil MG hücrelerini kullanarak 3D organoid kültürleri nasıl üretebildiğini anlatan bir yöntem sunulmuştur. Bu ve diğer protokoller arasındaki fark, iki ayrı MG hücre bölmesi ayırmak için bir yöntem detay olmasıdır: dış bazal MiyoECs ve iç LECs. Yöntemimiz iki aşamalı tripsin-EDTA (%0.05) kullanır diferansiyel tripsinizasyon dediğimiz tedavi19. Bu prosedür, araştırmacıların gelişmiş akış sitometrisi kullanmadan MiyoeC'leri ve LEC'leri izole etmesine olanak sağlar ve böy.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Teşekkürler
Ben Abrams'a Kaliforniya Üniversitesi, Santa Cruz (UCSC) Kök Hücrelerin Biyolojisi Enstitüsü'nden (IBSC) teknik yardım ve çekirdek destek için teşekkür ederiz. Susan Strome ve Bill Saxton'a Solamere İplik Disk Konfokal Mikroskobu'nu kullandıkları için teşekkür ederiz. Bu çalışma kısmen Howard Hughes Tıp Enstitüsü'nden UCSC'ye James H. Gilliam Fellowships for Advanced Study programı (S.R.), NIH'den (NIH GM058903) öğrenci gelişimini en üst düzeye çıkarma (H.M.) ve Ulusal Bilim Vakfı lisansüstü araştırma bursu (O.C. DGE 1339067) ve bir hibe (A18-0370) UC-Kanser Araştırma Koordinasyon Komitesi (LH) tarafından.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 15 ml Yüksek Berraklıkta Polipropilen Konik Boru (BD Falcon) | Fisher Scientific | 352096 | |
| 24 kuyulu ultra düşük bağlantı plakası (Corning) | Fisher Scientific | CLS3473-24EA | |
| 35 mm TC ile işlenmiş Kolay Kavranan Hücre Kültürü Kabı (BD Falcon) | Fisher Scientific | 353001 | |
| 50 ml Yüksek Berraklıkta polipropilen konik boru (BD Falcon) | Fisher Scientific | ||
| 60 mm TC ile işlenmiş Kolay Kavranan Hücre Kültürü Kabı (BD Falcon) | Fisher Scientific | 353004 | |
| 70 & M naylon hücre süzgeci (Corning) | Fisher Scientific | 08-771-2 | |
| Antibiyotik-Antimikotik (100X) | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | Pen/Strep ayrıca |
| A vitamini içermeyen B27 takviyesi de çalışır (50x) | Thermo Fisher Scientific | 12587010 | |
| B6 ACTb-EGFP fareler | Jackson Laboratuvarı | 003291 | |
| BD İnsülin şırıngası 0.5 mL | Thermo Fisher Scientific | 14-826-79 | |
| Sınıf 2 Dispase (Roche) | Millipore Sigma | 4942078001 | |
| Sınıf 3 Kollajenaz | Worthington Biyokimyasal | LS004206 | |
| Corning Hücre Geri Kazanım çözümü | Fisher Scientific | 354253 | Kullanım yönergelerini izleyin – Corning Matrigel Matrisinden Üç Boyutlu Yapıların |
| Çıkarılması Corning Costar Ultra Düşük Ataşman 6 kuyulu | Fisher Scientific | CLS3471 | |
| Deksametazon | Millipore Sigma | D4902-25MG | |
| DMEM/F12, fenol kırmızısı yok | Thermo Fisher Scientific | 11039-021 | |
| DNaz (Deoksiribonükleaz I) | Worthington Biyokimyasal | LS002007 | |
| Eşek anti-Keçi 647 | Thermo Fisher Scientific | A21447 | 1:500'de kullanın, Lot: 1608641, stok 2 mg / mL, RRID:AB_2535864 |
| Eşek anti-Fare 647 | Jackson ImmunoResearch | 715-606-150 | 1:1000'de kullanın, Lot: 140554, stok 1.4 mg / mL |
| Dulbecco'nun Modifiye Eagle Medium: Besin Karışımı F-12 (DMEM/F12) | Thermo Fisher Scientific | 11330-057 | |
| Dulbecco'nun fosfat tamponlu salin (DPBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190-250 | Mg2 + / Ca2 + |
| EGF | Fisher Scientific | AF-100-15-100ug | |
| Fetal Sığır Serumu | VWR | 97068 ve ndash; 085 | %100 ABD Menşeli, birinci sınıf, Lot: 059B18 |
| Fluoromount-G (Southern Biotech) | Fisher Scientific | 0100-01 | Metinde montaj ortamı olarak anılır |
| Gentamisin | Thermo Fisher Scientific | 15710064 | |
| Glycine | Fisher Scientific | BP381-5 | |
| Keçi anti-WAP | Santa Cruz Biotech | SC-14832 | 1:250'de kullanın, Lot: J1011, stok 200 ve mikro; g / mL, RRID: AB_677601 |
| Hoechst 33342 | AnaSpec | AS-83218 | Kullanım 1: 2000, stok 20mM |
| İnsülin | Millipore Sigma | I6634-100mg | |
| KCl | Fisher Scientific | P217-500 | |
| KH2PO4 | Fisher Scientific | P285-500 | |
| KRT14– CreERtam | Jackson Laboratuvarı | 5107 | |
| Matrigel Büyüme Faktörü Azaltılmış (GFR); fenol kırmızısı içermez; 10 mL | Fisher Scientific | CB-40230C | Lot: 8204010, stok konsantrasyonu 8.9 mg / mL |
| MillexGV Filtre Ünitesi 0.22 & mikro; m | Millipore Sigma | SLGV033RS | |
| Millicell EZ SLIDE 8 oyuklu cam, steril | Millipore Sigma | PEZGS0816 | Bu hazne kızakları contanın çıkarılması için mükemmeldir ancak diğer markalar iyi çalışabilir (örn. Lab Tek II). |
| Fare anti-SMA | Millipore Sigma | A2547 | 1:500'de kullanın, Lot: 128M4881V, stok 5.2 mg / mL, RRID: AB_476701 |
| N-2 Takviyesi (100x) | Thermo Fisher Scientific | 17502048 | |
| NaCl | Fisher Scientific | S671-3 | |
| NaH2PO4 | Fisher Scientific | S468-500 | |
| Nrg1 R | & D | 5898-NR-050 | |
| Küçükbaş Hipofiz Prolaktin | Ulusal Hormon ve Peptit Programı | Harbor-UCLA Araştırma ve Eğitim Enstitüsü'nde Dr. Parlow'dan Satın Alındı | |
| Paraformaldahyde | Millipore Sigma | PX0055-3 | |
| Pentobarbital | Millipore Sigma | P3761 | |
| R26R-EYFP | Jackson Laboratuvarı | 6148 | |
| Rho inhibitörü Y-27632 | Tocris | 1254 | |
| R-spondin | Peprotech | 120-38 | |
| Sodyum Hidroksit | Fisher Scientific | S318-500 | |
| Steril Filtreli Eşek | Serumu Equitech-Bio Inc. | SD30-0500 | |
| Steril Filtreli Eşek Serumu | Equitech-Bio Inc. | SD30-0500 | |
| Triton X-100 | Millipore Sigma | x100-500ML | Laboratuvar sınıfı |
| Tripsin EDTA% 0.05 | Thermo Fisher Scientific | 25300-062 |
Kaynaklar
- Macias, H., Hinck, L. Mammary gland development. Wiley Interdisciplinary Reviews in Developmental Biology. 1 (4), 533-557 (2012).
- Daniel, C. W., De Ome, K. B., Young, J. T., Blair, P. B., Faulkin, L. J. Jr
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
