Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Diferansiyel Tripsinizasyon a göre Mozaik Meme Organoidlerinin Üretimi

6.2K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/60742

⸱

11 Mart 2020

 ,  ,  , 
1Department of Molecular, Cell and Developmental Biology, University of California, Santa Cruz

Bu makalede

Özet

Meme bezi, dış miyoepitelyal ve iç luminal epitel hücrelerinden oluşan çift katmanlı bir yapıdır. Sunulan diferansiyel trippsinizasyon kullanarak organoidler hazırlamak için bir protokoldür. Bu verimli yöntem araştırmacılar ayrı ayrı meme bezi formu ve fonksiyonu rollerini ile ilgili soruları keşfetmek için bu iki hücre türleri işlemek için izin verir.

Özet

Organoidler, fizyolojik süreçleri bir yemeğin rahatlığıyla özetleyen kendi kendini organize eden, üç boyutlu doku yapıları sunar. Murine meme bezi farklı işlevlere hizmet veren iki farklı epitel hücre bölmesi oluşur: dış, kontraktil miyoepitelyal bölmesi ve iç, salgı luminal bölmesi. Burada, bu bölmelerden oluşan hücrelerin izole edildiği ve daha sonra meme bezi morfogenezine ve farklılaşmaya olan bireysel soy katkılarını araştırmak için biraraya geldiği bir yöntemi açıklıyoruz. Yöntem basit ve verimlidir ve floresan aktif hücre sıralama gibi gelişmiş ayırma teknolojileri gerektirmez. Bunun yerine, biz hasat ve enzimatik doku sindirmek, yapışık doku kültürü yemekleri üzerinde epitel tohum, ve sonra ~ 90% saflık ile luminal hücrelerden miyoepitel ayırmak için diferansiyel trippsinizasyon kullanın. Hücreler daha sonra kültürde 10 gün sonra süt üretmek için ayırt edilebilir çift katmanlı, üç boyutlu (3D) organoidler halinde organize bir hücre dışı matris plakalı. Genetik mutasyonların etkilerini test etmek için, hücreler vahşi tip veya genetiği değiştirilmiş fare modellerinden hasat edilebilir, ya da genetik olarak 3D kültürden önce manipüle edilebilir. Bu teknik, özellikle luminal veya miyoepitel bölmesi gen fonksiyonunun araştırılmasına olanak sağlayan mozaik organoidler oluşturmak için kullanılabilir.

Giriş

Meme bezi (MG) bir adiposit zengin stroma içinde gömülü bir ağaç gibi, tübüler epitel yapısıdır. İki katmanlı duktal epitel, kontraktilin dış, bazal tabakası, miyoepitel hücreleri (Myoecs) ve luminal, salgı epitel hücrelerinin (LECs) bir iç tabakası, merkezi bir lümen çevreleyen oluşur1. Emzirme sırasında dış MiyoECs iç alveoler LECs süt sıkmak için sözleşme, MG büyüme faktörleri (örneğin, EGF ve FGF) ve hormonlar (örneğin progesteron, insülin ve prolaktin kontrolü altında olan çok sayıda değişiklik uğrar, ve prolaktin). Bu değişiklikler, emzirme döneminde sütü sentezleyen ve salgılayan özel yapılar alveollerin farklılaşmasına neden olur1. Meme epitel deneysel ya epitel doku parçaları, hücreler, hatta tek bir bazal hücre konak meme yağ pedleri içine nakledilir teknikleri kullanılarak manipüle edilebilir, endojen meme parenkim precleared, ve bütün bir yeniden büyümeye izin, fonksiyonel epitel ağacı2,3,4,5. Transplantasyon güçlü bir tekniktir, ancak bir mutasyonun erken embriyonik öldürücülükle sonuçlanması (E14'ten önce) nakledilebilir meme nin kurtarılmasını önlerse zaman alıcı dır ve imkansızdır. Ayrıca, araştırmacılar sık sık soy kısıtlı ata hücreleri türetilmiştir iki farklı bölmeleri, rolleri araştırmak istiyorum. Cre-lox teknolojisi MyoEC'lerin ve LED'lerin diferansiyel genetik manipülasyonuna olanak sağlarken, bu aynı zamanda zaman alan ve pahalı bir girişimdir. Böylece, 1950'lerden bu yana, araştırmacılar meme dokusu yapısı ve fonksiyonu ile ilgili soruları ele almak için nispeten kolay ve verimli bir yol olarak in vitro meme organoidler kullandık6,7.

Birincil meme epitel hücrelerinin izolasyon ve kültürünü açıklayan erken protokollerde, araştırmacılar bir plazma pıhtısı ve tavuk embriyoekstresi oluşan bir bazal membran matris (BME), mg parçaları bir çanak yetiştirilen için gerekli olduğunu bulundu6. Takip eden yıllarda, hücre dışı matrisler (EcMs, kollajen, ve engelbreth-Holm-Swarm murine sarkomu hücreleri tarafından salgılanan jöle benzeri protein matris) 3D kültürü kolaylaştırmak ve daha iyi in vivo çevre7taklit geliştirilmiştir,8,9,10. Birden fazla kriter (morfoloji, gen ekspresyonu ve hormon duyarlılığı) tarafından ortaya 3D matrislerde culturing hücreleri böyle bir mikroortamda vivo fizyolojiksüreçlerdedaha iyi modeller 9,10,11,12. Birincil mindik hücreleri kullanılarak yapılan araştırmalarda, organoidlerin uzun süreli bakımı ve farklılaşması için gerekli olan temel büyüme faktörleri ve morfojenler saptandı13. Bu çalışmalar burada sunulan protokol için zemin hazırladık, ve 3D organoidler olarak insan meme hücrelerinin kültürü için, şimdi modern bir klinik araçtır, hasta örnekleri üzerinde ilaç keşif ve ilaç testi için izin14. Genel olarak, organoid culturing birincil hücrelerin kendi kendine organizasyon kapasiteleri ve morfogenez ve farklılaşma katkıları vurgulamaktadır.

Burada sunulan süt üreten acini içine ayırt edilebilir kültür murine epitel için bir protokoldür. İki farklı MG hücre bölmesini oluşturan MiyoEC'leri ve LEC'leri izole etmek için diferansiyel trippsinizasyon tekniği kullanılır. Bu ayrılmış hücre fraksiyonları daha sonra genetik olarak aşırı ifade veya nakavt gen fonksiyonu için manipüle edilebilir. Çünkü soy-içsel, kendi kendine organizasyon meme epitel hücrelerinin doğuştan gelen birözelliğidir 15,16,17, bu hücre fraksiyonları rekombinerek araştırmacılar çift katmanlı, mozaik organoidler oluşturmak için izin verir. Biz enzimatik yağ dokusu sindirerek başlar, ve daha sonra 24 saat için bir doku kültür çanak üzerinde meme parçaları kuluçka(Şekil 1). Doku parçaları polistiren tabaklar üzerinde iki katmanlı parçalar olarak in vivo organizasyon: iç luminal katmanları çevreleyen dış miyoepitelyal tabaka yerleşmek. Bu hücresel organizasyon, dış MiyoEC'lerin tripsin-EDTA (%0.05) ile izolasyonuna izin verir. tedavi 3-6 dk ve ardından ikinci bir tripsin-EDTA turu (%0.05) kalan iç LEC'leri ayıran tedavi (Şekil 2). Bu nedenle farklı tripsin duyarlılığı olan bu hücre tipleri izole edilir ve daha sonra ECM ile karıştırılarak kaplanabilir (Şekil 3). Hücreler, iç LEC'leri çevreleyen MiyoEC'lerin dış tabakasından oluşan iki katmanlı küreler oluşturmak için kendi kendini örgütlemeden geçerler. Lümen oluşumu hücreler büyüme faktörleri nin bir kokteyl içeren bir ortamda büyümek gibi oluşur (Büyüme Orta için tariflere bakın)13. 5 gün sonra, organoidler Alveologenesis Medium'a geçerek süt üreten acini'ye ayrılabilir (bkz. tarifler ve Şekil 3F)ve 5 gün daha kuluçkaya yatırılabilir. Alternatif olarak, organoidler en az 10 gün boyunca Büyüme Ortamı'nda genişlemeye ve dallanmaya devam edecektir. Organoidler immünororesans(Şekil 3D-F)kullanılarak analiz edilebilir veya ecm'den bir kurtarma solüsyonu kullanılarak serbest bırakılabilir (bkz. Malzeme Tablosu)ve diğer yöntemlerle analiz edilebilir (örn. immünoblot, RT-qPCR).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Burada açıklanan tüm yöntemler California Üniversitesi, Santa Cruz Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır.

1. Gün 1: Meme bezi sindirim

  1. 10-14 haftalık olgun dişi farelerden MG'leri hasat etmeye hazırlanın.
    1. Aseptik koşullar altında açık bir bankta hasat gerçekleştirin.
    2. Ameliyattan önce 20 dakika boyunca %70 alkol le otoklavlama ve ıslatma ile tüm cerrahi malzemeleri, mantar panoları ve pimleri sterilize edin.
    3. 0.5 mL insülin şırınga ile intraperitoneal enjeksiyon yoluyla verilen sodyum pentobarbital (0.06 mg/g vücut ağırlığı 2X anestezik doz) ile hayvanları anestezik.
    4. Refleks yanıtı kontrol etmek için hayvanın ayak parmaklarını çimdikleyerek anestezi seviyesini izleyin ve protokolü ancak hayvan tamamen anestezi edildikten sonra başlatın.
    5. Hayvanı sırtına yerleştirin, uzantılarını mantar tahtasına sabitle ve karnını ve göğsünü etanolle silin.
  2. Bir fareden (yani 8 MGs, Şekil 1A)#2 3, 4 ve 5 MG'yi hasat etmek için, iki arka bacak arasındaki orta çizgiyi belirleyin ve karın derisinde keskin makaslarla küçük bir kesi (1 cm) yapın, sonra kesiği boynuna kadar uzatın18.
  3. Bir pamuklu bez kullanarak cildin serbest bırakılması için izin vermek için bacaklar ve kollar doğru yanal küçük kesimler yaparak izleyin. Deriyi çekin ve bir tarafa sabitlemeden önce sıkı bir şekilde gerin(Şekil 1B, adım 1)18. Altlarını keserek MGs çıkarın ve #4 bezlerilenf düğümleri kaldırmak(Şekil 1B, adım 2, 3)18. Vücudun diğer tarafında prosedürü tekrarlayın.
  4. MG dokusunu 4 °C Dulbecco'nun Modifiye Kartal Medyasının (DMEM)/Besin Karışımı F12 (F12) 50 mL'lik kısmını %5 fetal sığır serumu (FBS) ve 1X Antibiyotik Antimikotik (Anti-Anti)18ile destekletamama .
  5. Bezleri 35 mm'lik bir tabakta veya seramik bir tabakta jilet veya doku helikopteri kullanarak doğrayın. Doku parçaları 1 mL mikropipet ucuna kolaylıkla sığabilecek olana kadar plakayı her beş manuel doğrayın veya doku helikopterinin her bir yuvarlarını kolayca (~0,1 mm/fragment, Şekil 1C)döndürün.
  6. Sindirim Ortamı'ndaki MG'leri sindirin (tablo 1'ebakınız) 37 °C,%5 CO2'de6 iyi düşük yapışma kabında 14 saat boyunca .

2. Gün 2: Meme epitel doku parçalarının izolasyonu

  1. 14 saat sindirimden sonra, sindirilmiş doku 10X'i 1 mL mikropipet kullanarak, kalan stroma veya yağ dokusunu parçalayarak, ne kabarcıkların ne de aşırı mekanik kuvvetin üretilmesini sağlayarak hafifçe karıştırın.
    NOT: 14 saat sonra eksik sindirim varsa, bu yıkınan DNA birikimi nedeniyle olabilir. Bu durumda, Sindirim Ortamı 2 mL başına 1 mg/mL deoksiribononükle 1 (DNase I) ekleyin. 37 °C'de 30 dk daha kuluçka, %5 CO2.
  2. 15 mL'lik bir tüpte doku ları toplayın ve sindirim için kullanılan 1X Dulbecco'nun Fosfat Tamponlu Salini (DPBS) ca2+ ve Mg2+içermeyen 2-3 mL doku kültürü ile durulayın. 10 dk için 600 x g santrifüj.
  3. Lipid tabakası ve orta içeren supernatant boşaltın ve daha sonra DPBS 5 mL pelet resuspend ve yeni bir 15 mL tüp geçmek. 10 dk için 600 x g santrifüj.
  4. Santrifüj sırasında 50 mL'lik bir tüpe 70 m naylon hücreli süzgeç yerleştirin ve süzgeci 10 mL 37 °C DMEM/F12 kullanarak önceden ıslayın.
  5. 5 mL DPBS kullanarak protokol adım 2.4 doku parçalarını yeniden askıya alın ve stromal hücreleri ve tek hücreleri temizlemek için süspansiyonu önceden ıslak 70 μm naylon hücresüzden geçirin(Şekil 1D).
  6. Hücre süzgecindeki doku parçalarını toplayın. 10 mL 37 °C DMEM/F12(Şekil 1D)ile 4X durulayın.
    DİkKAT: Eksik durulama, epitel olmayan hücrelerle kontamine olmuş kültürlere neden olur.
  7. Süzgeç sekmesini eldivenli parmaklarla tutarak, süzgecin 60 mm'lik doku kültür çanağı üzerinde ters çevrilerek ve 1 mL aliquot'u Bakım Ortamı'ndan geçirerek doku parçalarını serbest bırakın (Bkz. Tablo 1) süzgeç 4X'in altından(Şekil 1E).
  8. Çıplak gözle görülebilecek doku parçası kalıntıları için süzgecin imasını kontrol edin ve süzgeci 1 mL Bakım Ortamı ile 1 x daha fazla durula. Durulanan doku parçaları artık stromal hücrelerden arındırılmış olmalıdır.
  9. Protokol adımı 2.9'dan MG parçalarını içeren 60 mm'lik kabı ters bir mikroskop altında (4X veya 10X objective, Şekil 1F)hızlı bir şekilde inceleyin. Sekiz MGs tipik bir hazırlık ~ 500 parçaları verir. Tek hücre veya yağ damlacıkları ve kirletici hücreler olup olmadığını arayın.
    NOT: Kirlenen hücreler varsa, 60 mm'lik çanaktan orta ve parçaları 5 mL pipet kullanarak toplayarak ve parçayı 70 m'lik taze bir süzgeçten tekrar filtreleyerek 2.6, 2.8-2.10 protokol adımlarını tekrarlayarak filtrasyon adımını tekrarlayın.
  10. 37 °C'de 24 saat kuluçka, %5 CO2, doku parçasının yapışmasını ve çift katmanlı parçalar üretmesini sağlar(Şekil 2A).
    NOT:Parçalar 24 saate kadar yerleşmemişse, yapıştırılınana kadar kuluçkaya yatırmaya devam edin. Parçalar iyi yapışmazsa, hücre bölmelerinin ayrılması çalışmaz. Araştırmacılar yapışma konusunda endişeleriniz varsa, doku kültürü plakaları parça eki (örneğin, poli-L-lizin) teşvik etmek için tedavi edilebilir.

3. Gün 3: Miyoepitelyal ve luminal epitel hücrelerinin diferansiyel tripsinizasyonu

  1. MiyoEC'leri LED'lerden ayırmak için, ortamı yemekten boşaltın, 1 mL DPBS ile 1 x durulayın ve 1 mL taze tripsin-EDTA (%0,05) ekleyin ve ters bir mikroskop altında (10X veya 20X hedefi, Şekil 2B,C,F)altında sindirimi dikkatle izleyin. Dış MyoEC tabakasının ayrılması, tripsin-EDTA (%0.05) bağlı olarak 3-6 dakika gerektirir Gücü.
    NOT: Bu işlemi gösteren temsili görüntüler için lütfen Şekil 2'ye bakın. Brightfield aydınlatma altında, MyoECs yuvarlak görünür ve LED'ler ile karşılaştırıldığında daha parlak bir görünüme sahip, hangi merkezinde bağlı kalır ve koyu görünür.
  2. 2 mL %10 FBS/DPBS içeren 15 mL'lik bir tüpte MyoEC fraksiyonu toplayın. LED'leri rahatsız etmeden, 60 mm'lik kabı 2 mL DPBS ile hafifçe durulayın ve DPBS'yi atın(Şekil 2H-I).
    NOT: MyoECs için olağan kurtarma (3.5 x 106-1.5 x 106) MGs boyutuna bağlı olarak bir aralık içindedir.
  3. LEC fraksiyonu kaldırmak için 1 mL tripsin-EDTA (%0.05) ekleyin tekrar çanak ve kuluçka 7-15 dk, dikkatle aşırı hazımsızlığı önlemek için izleme. Tripsin-EDTA'yı söndürmek (%0.05) %10 FBS/DPBS 2 mL ile çanak üzerinde. Yeni bir 15 mL tüp LEC fraksiyonu toplamak.
    NOT: LED'ler için olağan iyileşme bir aralık içindedir (2 x 106-4.2 x 106) MG'lerin boyutuna bağlı olarak. Rutin olarak, immünohistokimya tarafından titreyen her iki fraksiyonun saflığı ~%9019 'dur(Şekil 2E).
  4. Tripsin-EDTA'yı (%0.05) çıkarmak için 300 x g'da 5 dk için her fraksiyonu santrifüj edin. 250 μL'lik Maintenance Medium'da peleti yeniden askıya alın ve her hücre popülasyonunu hemositometre veya otomatik hücre sayacı kullanarak sayın. Sayarken hücreleri buzüzerine yerleştirin.
    NOT: Hücre fraksiyonlarının genetik manipülasyonu isteniyorsa, primer hücreler düşük yapışma yemeklerinde yetiştirilebilir ve lentivirus20ile enfekte edilebilir.

4. Gün 3: Hücre fraksiyonlarını hücre dışı bir matriste birleştirme ve yerleştirme

NOT: MyoEC ve LEC fraksiyonları toplandıktan ve sayıldıktan sonra birleştirilebilir. Tipik MyoEC/LEC oranı 1:3 'dür (Şekil 3A)19. Farklı çalışmalar yapılabilir. Örneğin, mozaik çalışmaları gerçekleştirmek için, kesirler yabani tip (WT) ve mutant (Mut) farelerden oluşturulabilir ve kombine edilebilir (MyoEC/LEC: WT/WT; WT/Mut; Mut/WT; Mut/Mut)21veya kesirler MiyoECs/LECs19farklı oranlarda kullanılarak kombine edilebilir.

  1. Hücre sayılarına göre, 12.000 hücre/kuyu için hazırlanması gereken kuyu sayısını (8 kuyu odası, bkz. Malzeme Tablosu)hesaplayın (örn. 3.000 MyoEC:9.000 LEC).
  2. Her kuyuya %50 ECM (%50 ECM/50 DMEM/F12) 90 μL ekleyerek 3D kültür için Table of Materialstaban katmanını kurun. Hiçbir kabarcıklar ve kuyular eşit olarak kaplanır olduğundan emin olun. Taban tabakasını sağlamlaştırmak için, slaytları 37 °C'de, %5 CO2'yi 30 dk'da kuluçkaya yatırın.
    NOT: ECM'nin bu adıma kadar buz gibi kalması gerekir, aksi takdirde erken polimerize olur ve pürüzlü taban kaplamave polimerizasyona yol açar. Bir taban ECM kullanarak tek bir düzlemde organoid büyümesini artırır, hangi görüntü yakalama yardımcı olur. Bu da daha hızlı organoid büyüme elde eder ve daha az ECMkullanır 22.
  3. Polimerizasyon sırasında hücre karışımlarını hazırlayın. Pelet MyoEC ve LEC fraksiyonları 300 x g için 5 dakika ve her hücre fraksiyonu askıya 10% ECM/90% Büyüme Orta böylece her iyi 100 μL (Büyüme Orta yapmak için nasıl Tablo 1 bakınız).
    NOT: Hazırlık kolaylığı için, aynı hücre karışımları kullanarak kuyuçoğaltmak. Bunlar bir tüp halinde birleştirilebilir ve hazırlanabilir (örneğin, aynı hücre karışımının dört kuyusu 400 μL %10 ECM/90% Büyüme Ortamı'nda hazırlanabilir).
  4. Her hücre karışımından 100 μL'yi %10 ECM/90% Büyüme Ortamı'na ekleyin ve organoidlerin 37 °C'de 20 dk, %5 CO2'yeyerleşmelerine izin verin.
  5. Hücreler yerleştikten sonra, her kuyunun hazne duvarını yavaşça borulayarak 100 μL'lik Büyüme Ortamı ekleyin. Slaytları 37 °C, %5 CO2'de kuluçkaya yatırın (her kuyunun toplam bileşimi için Şekil 3A'ya bakınız).
    NOT: Rho Kiazaz inhibitörü, R-spondin ve Nrg1 hem primer meme hücreleri hem de insan meme kanseri hücrelerinden yetiştirilen organoidlerin uzun vadeli kültür için önemli olarak tespit edilmiştir faktörlerdir13,14. Buna ek olarak, kök hücre faktörleri B27 ve N2 organoidler kültürlü olabilir süresini uzatmak.
  6. Görüntü hücreleri büyümelerini izlemek ve 100 μL/iyi kullanarak her 2-3 günde bir Büyüme Ortamını yavaşça yenilemek için her 24 saatte bir(Şekil 3B-E).
    NOT: Ortamı yenilerken aşırı özen kullanın. Kuyuların bir köşesinde orta toplamak için oda slaytlar tilt. Ortamın ≤100 μL'sini çıkarın ve ECM tabakasını rahatsız edilmeden bırakmaya özenle doldurulun.
  7. Araştırmacılar emzirme/alveologenez araştırmakla ilgileniyorsa,Figure 3F5. Table 1 Table of Materials
    NOT: Bu noktada, organoidler 4 °C'de 400 μL'lik 4 °C'de kuluçkaya yatarak ECM'den izole edilebilirler (protokol ve reaktif bilgileri için Malzeme Tablosu'na bakınız).

5. Gün 5 veya 10: Sabitleme ve immünboyama organoidler

  1. Ortamı hafifçe boruyla çalarak dikkatlice çıkarın (ampul pipeti en iyi şekilde çalışır). 1x Dulbecco'nun Fosfat Tamponlu Salin (DPBS, tariflere bakın) 200 μL'lik 200 μL'lik bir kısmını iyi durula.
  2. Organoidleri oda sıcaklığında 10 dakika soğuk (4 °C) 4% (w/v) paraformaldehit (PFA, bkz. tarifler) kullanarak düzeltin.
    DİkKAT: PFA tehlikelidir. Kişisel koruyucu ekipman (laboratuvar önlüğü, eldiven ve güvenlik gözlükleri) giyin. Bu adım bir duman başlık içinde yapılmalıdır.
    NOT: ECM PFA tedavisi ile çözülür. Organoidler immünofloresan siniflar idardi edildiğinde eksik ECM çıkarılması arka plan boyamayol açabilir.
  3. %4'lük PFA'yı çıkarın ve her kuyuya %0,2 (w/v) glisin/DPBS 200 μL ekleyin (tablo 1'ebakınız). Slaytları oda sıcaklığında bir gecede 30 dakika veya 4 °C'de sallanan bir yüzeye tüphaline koyun.
    NOT: Organoidler bir sonraki adımdan önce 4 °C'de DPBS'de 1-3 gün saklanabilir.
  4. DPBS + %0.25 Triton X-100 (PBST, bakınız Tablo 1)kullanarak organoidleri oda sıcaklığında 10 dakika geçirin.
  5. DPBS'de sallanan bir yüzeyde 1 saat boyunca %5 eşek serumu (DS) (veya ikincil antikor türüne uyan başka bir serum) kullanarak organoidleri engelleyin.
    NOT: Bu adım bir gecede 4 °C'de sallanan bir yüzeyüzerinde yapılabilir.
  6. Primer antikorları %1 DS/DPBS olarak hazırlayın. Her kuyu için 125-200 μL kullanın. Bir gecede 4 °C'de birincil antikordaki organoidleri sallanan bir yüzeyde kuluçkaya yatırarak immünoboyama yapın.

6. Gün 11: Komple immünofloresans

  1. Her 2X'i 5 dk boyunca 200 μL PBST ile yıkayın. Her kuyu için 125-200 μL kullanarak %1 DS/DPBS'de ikincil antikor ekleyin. 45 dakika boyunca sallanan bir yüzeyüzerinde oda sıcaklığında kuluçka.
  2. Her 200 μL PBST'yi iyi kullanarak her 2X iyi yıkayın.
  3. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca DPBS'de (DPBS'de 1:2.000) Hoechst DNA boyası kullanarak çekirdekleri lekelayın.
  4. Bir vakum ile hafifçe emerek kuyuda kalan tüm sıvıyı çıkarın.
  5. Odaları ve contayı dikkatlice çıkarın, kabarcıkları temizlemeye özen tayarak, her kuyuya ve kapak kaymasına bir damla montaj ortamı (~30°L) Table of Materialsyerleştirin. 1-2 gün boyunca karanlık bir alanda slayt kurumasını bekleyin. Açık oje ile mühür. Organoidleri konfokal mikroskop üzerinde görüntüleyin (Şekil 3E-F).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Burada sunulan protokol, mozaik organoidlerden yararlanılarak meme epitel hücrelerinin belirli soy katkılarını araştırmak için kullanılan bir yöntemi açıklamaktadır. Organoidler için primer minros hücreleri elde etmek için, meme bezi epiteli öncelikle çevredeki adiposit bakımından zengin stromadan izole edilmelidir (Şekil 1). Bu süreç burada kısaca açıklanmıştır ve daha önce yayınlanmış bir çalışmada18açıklanmıştır. Yeterli hücre elde ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Burada, araştırmacıların birincil MG hücrelerini kullanarak 3D organoid kültürleri nasıl üretebildiğini anlatan bir yöntem sunulmuştur. Bu ve diğer protokoller arasındaki fark, iki ayrı MG hücre bölmesi ayırmak için bir yöntem detay olmasıdır: dış bazal MiyoECs ve iç LECs. Yöntemimiz iki aşamalı tripsin-EDTA (%0.05) kullanır diferansiyel tripsinizasyon dediğimiz tedavi19. Bu prosedür, araştırmacıların gelişmiş akış sitometrisi kullanmadan MiyoeC'leri ve LEC'leri izole etmesine olanak sağlar ve böy...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Teşekkürler

Ben Abrams'a Kaliforniya Üniversitesi, Santa Cruz (UCSC) Kök Hücrelerin Biyolojisi Enstitüsü'nden (IBSC) teknik yardım ve çekirdek destek için teşekkür ederiz. Susan Strome ve Bill Saxton'a Solamere İplik Disk Konfokal Mikroskobu'nu kullandıkları için teşekkür ederiz. Bu çalışma kısmen Howard Hughes Tıp Enstitüsü'nden UCSC'ye James H. Gilliam Fellowships for Advanced Study programı (S.R.), NIH'den (NIH GM058903) öğrenci gelişimini en üst düzeye çıkarma (H.M.) ve Ulusal Bilim Vakfı lisansüstü araştırma bursu (O.C. DGE 1339067) ve bir hibe (A18-0370) UC-Kanser Araştırma Koordinasyon Komitesi (LH) tarafından.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
15 ml Yüksek Berraklıkta Polipropilen Konik Boru (BD Falcon)Fisher Scientific352096
24 kuyulu ultra düşük bağlantı plakası (Corning)Fisher ScientificCLS3473-24EA
35 mm TC ile işlenmiş Kolay Kavranan Hücre Kültürü Kabı (BD Falcon)Fisher Scientific353001
50 ml Yüksek Berraklıkta polipropilen konik boru (BD Falcon)Fisher Scientific
60 mm TC ile işlenmiş Kolay Kavranan Hücre Kültürü Kabı (BD Falcon)Fisher Scientific353004
70 & M naylon hücre süzgeci (Corning)Fisher Scientific08-771-2
Antibiyotik-Antimikotik (100X)Thermo Fisher Scientific15240062Pen/Strep ayrıca
A vitamini içermeyen B27 takviyesi de çalışır (50x)Thermo Fisher Scientific12587010
B6 ACTb-EGFP farelerJackson Laboratuvarı003291
BD İnsülin şırıngası 0.5 mLThermo Fisher Scientific14-826-79
Sınıf 2 Dispase (Roche)Millipore Sigma4942078001
Sınıf 3 KollajenazWorthington BiyokimyasalLS004206
Corning Hücre Geri Kazanım çözümüFisher Scientific354253Kullanım yönergelerini izleyin – Corning Matrigel Matrisinden Üç Boyutlu Yapıların
Çıkarılması Corning Costar Ultra Düşük Ataşman 6 kuyuluFisher ScientificCLS3471
DeksametazonMillipore SigmaD4902-25MG
DMEM/F12, fenol kırmızısı yokThermo Fisher Scientific11039-021
DNaz (Deoksiribonükleaz I)Worthington BiyokimyasalLS002007
Eşek anti-Keçi 647Thermo Fisher ScientificA214471:500'de kullanın, Lot: 1608641, stok 2 mg / mL, RRID:AB_2535864
Eşek anti-Fare 647Jackson ImmunoResearch715-606-1501:1000'de kullanın, Lot: 140554, stok 1.4 mg / mL
Dulbecco'nun Modifiye Eagle Medium: Besin Karışımı F-12 (DMEM/F12)Thermo Fisher Scientific11330-057
Dulbecco'nun fosfat tamponlu salin (DPBS)Thermo Fisher Scientific14190-250Mg2 + / Ca2 +
EGFFisher ScientificAF-100-15-100ug
Fetal Sığır SerumuVWR97068 ve ndash; 085%100 ABD Menşeli, birinci sınıf, Lot: 059B18
Fluoromount-G (Southern Biotech)Fisher Scientific0100-01Metinde montaj ortamı olarak anılır
GentamisinThermo Fisher Scientific15710064
GlycineFisher ScientificBP381-5
Keçi anti-WAPSanta Cruz BiotechSC-148321:250'de kullanın, Lot: J1011, stok 200 ve mikro; g / mL, RRID: AB_677601
Hoechst 33342AnaSpecAS-83218Kullanım 1: 2000, stok 20mM
İnsülinMillipore SigmaI6634-100mg
KClFisher ScientificP217-500
KH2PO4Fisher ScientificP285-500
KRT14– CreERtamJackson Laboratuvarı5107
Matrigel Büyüme Faktörü Azaltılmış (GFR); fenol kırmızısı içermez; 10 mLFisher ScientificCB-40230CLot: 8204010, stok konsantrasyonu 8.9 mg / mL
MillexGV Filtre Ünitesi 0.22 & mikro; mMillipore SigmaSLGV033RS
Millicell EZ SLIDE 8 oyuklu cam, sterilMillipore SigmaPEZGS0816Bu hazne kızakları contanın çıkarılması için mükemmeldir ancak diğer markalar iyi çalışabilir (örn. Lab Tek II).
Fare anti-SMAMillipore SigmaA25471:500'de kullanın, Lot: 128M4881V, stok 5.2 mg / mL, RRID: AB_476701
N-2 Takviyesi (100x)Thermo Fisher Scientific17502048
NaClFisher ScientificS671-3
NaH2PO4Fisher ScientificS468-500
Nrg1 R& D5898-NR-050
Küçükbaş Hipofiz ProlaktinUlusal Hormon ve Peptit ProgramıHarbor-UCLA Araştırma ve Eğitim Enstitüsü'nde Dr. Parlow'dan Satın Alındı
ParaformaldahydeMillipore SigmaPX0055-3
PentobarbitalMillipore SigmaP3761
R26R-EYFPJackson Laboratuvarı6148
Rho inhibitörü Y-27632Tocris1254
R-spondinPeprotech120-38
Sodyum HidroksitFisher ScientificS318-500
Steril Filtreli EşekSerumu Equitech-Bio Inc.SD30-0500
Steril Filtreli Eşek SerumuEquitech-Bio Inc.SD30-0500
Triton X-100Millipore Sigmax100-500MLLaboratuvar sınıfı
Tripsin EDTA% 0.05Thermo Fisher Scientific25300-062
352098

Kaynaklar

  1. Macias, H., Hinck, L. Mammary gland development. Wiley Interdisciplinary Reviews in Developmental Biology. 1 (4), 533-557 (2012).
  2. Daniel, C. W., De Ome, K. B., Young, J. T., Blair, P. B., Faulkin, L. J. Jr The in vivo life span of normal and preneoplastic mouse mammary glands: a serial transplantation study. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 61 (1), 53-60 (1968).
  3. Ip, M. M., Asch, B. B. Methods in Mammary Gland Biology and Breast Cancer Research. , Kluwer Academic/Plenum Publishers. (2000).
  4. Shackleton, M., et al. Generation of a functional mammary gland from a single stem cell. Nature. 439 (7072), 84-88 (2006).
  5. Stingl, J., et al. Purification and unique properties of mammary epithelial stem cells. Nature. 439 (7079), 993-997 (2006).
  6. Lasfargues, E. Y. Cultivation and behavior in vitro of the normal mammary epithelium of the adult mouse. II. Observations on the secretory activity. Experimental Cell Research. 13 (3), 553-562 (1957).
  7. Simian, M., Bissell, M. J. Organoids: A historical perspective of thinking in three dimensions. Journal of Cell Biology. 216 (1), 31-40 (2017).
  8. Orkin, R. W., et al. A murine tumor producing a matrix of basement membrane. Journal of Experimental Medicine. 145 (1), 204-220 (1977).
  9. Lee, E. Y., Parry, G., Bissell, M. J. Modulation of secreted proteins of mouse mammary epithelial cells by the collagenous substrata. Journal of Cell Biology. 98 (1), 146-155 (1984).
  10. Lee, E. Y., Lee, W. H., Kaetzel, C. S., Parry, G., Bissell, M. J. Interaction of mouse mammary epithelial cells with collagen substrata: regulation of casein gene expression and secretion. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 82 (5), 1419-1423 (1985).
  11. Bissell, M. J., Barcellos-Hoff, M. H. The influence of extracellular matrix on gene expression: is structure the message? Journal of Cell Science. 8 (Suppl), 327-343 (1987).
  12. Petersen, O. W., Ronnov-Jessen, L., Howlett, A. R., Bissell, M. J. Interaction with basement membrane serves to rapidly distinguish growth and differentiation pattern of normal and malignant human breast epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 89 (19), 9064-9068 (1992).
  13. Jarde, T., et al. Wnt and Neuregulin1/ErbB signalling extends 3D culture of hormone responsive mammary organoids. Nature Commununications. 7, 13207(2016).
  14. Sachs, N., et al. A Living Biobank of Breast Cancer Organoids Captures Disease Heterogeneity. Cell. 172 (1-2), 373-386 (2018).
  15. Daniel, C. W., Strickland, P., Friedmann, Y. Expression and functional role of E- and P-cadherins in mouse mammary ductal morphogenesis and growth. Developmental Biology. 169 (2), 511-519 (1995).
  16. Runswick, S. K., O'Hare, M. J., Jones, L., Streuli, C. H., Garrod, D. R. Desmosomal adhesion regulates epithelial morphogenesis and cell positioning. Nature Cell Biology. 3 (9), 823-830 (2001).
  17. Chanson, L., et al. Self-organization is a dynamic and lineage-intrinsic property of mammary epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 108 (8), 3264-3269 (2011).
  18. Honvo-Houeto, E., Truchet, S. Indirect Immunofluorescence on Frozen Sections of Mouse Mammary Gland. Journal of Visualized Experiments. (106), e53179(2015).
  19. Macias, H., et al. SLIT/ROBO1 signaling suppresses mammary branching morphogenesis by limiting basal cell number. Developmental Cell. 20 (6), 827-840 (2011).
  20. Welm, B. E., Dijkgraaf, G. J., Bledau, A. S., Welm, A. L., Werb, Z. Lentiviral transduction of mammary stem cells for analysis of gene function during development and cancer. Cell Stem Cell. 2 (1), 90-102 (2008).
  21. Smith, P., et al. VANGL2 regulates luminal epithelial organization and cell turnover in the mammary gland. Scientific Reports. 9 (1), 7079(2019).
  22. Lee, G. Y., Kenny, P. A., Lee, E. H., Bissell, M. J. Three-dimensional culture models of normal and malignant breast epithelial cells. Nature Methods. 4 (4), 359-365 (2007).
  23. Campbell, J. J., Davidenko, N., Caffarel, M. M., Cameron, R. E., Watson, C. J. A multifunctional 3D co-culture system for studies of mammary tissue morphogenesis and stem cell biology. PLoS One. 6 (9), e25661(2011).
  24. Labarge, M. A., Garbe, J. C., Stampfer, M. R. Processing of human reduction mammoplasty and mastectomy tissues for cell culture. Journal of Visualized Experiments. (71), e50011(2013).
  25. Marlow, R., Dontu, G. Modeling the breast cancer bone metastatic niche in complex three-dimensional cocultures. Methods in Molecular Biology. 1293, 213-220 (2015).
  26. Koledova, Z., Lu, P. A 3D Fibroblast-Epithelium Co-culture Model for Understanding Microenvironmental Role in Branching Morphogenesis of the Mammary Gland. Methods in Molecular Biology. 1501, 217-231 (2017).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Miyoepitelyal HücrelerLümen HücreleriDoku SindirimiHücre İzolasyonuHücre Dışı MatrisFloresan MikroskobiHücre KültürüGen Ekspresyonu
Diferansiyel Tripsinizasyon a göre Mozaik Meme Organoidlerinin Üretimi
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.