Yöntem makalesi

Mavi ve Kırmızı-shifted Channelrhodopsins ile Inferior Colliculus Nöronların Uzun menzilli Channelrhodopsin destekli Devre Haritalama

6.8K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/60760

⸱

7 Şubat 2020

 , 
1Kresge Hearing Research Institute, Department of Otolaryngology - Head and Neck Surgery, University of Michigan

Bu makalede

Özet

Channelrhodopsin destekli devre haritalama (CRACM) anatomik ve / veya genetik olarak tanımlanan nöron grupları arasında uzun menzilli nöronal projeksiyonlar fonksiyonel haritalama için hassas bir tekniktir. Burada, işitsel beyin sapı bağlantılarını haritalamak için CRACM'nin nasıl kullanılacağını anlatıyoruz, buna kırmızı-shifted opsin, ChrimsonR'ın kullanımı da dahil.

Özet

Nöral devreleri araştırırken, in vitro yama kıskaç yaklaşımının standart bir sınırlaması, birden fazla kaynaktan gelen aksonlar genellikle birbirine karışmak, elektrikstimülasyon ile bireysel kaynaklardan girişleri izole etmek zor hale olmasıdır. Ancak, channelrhodopsin destekli devre haritalama (CRACM) kullanılarak, bu sınırlama artık aşılabilir. Burada, düşük işitsel beyin sapı çekirdekleri ve komiser girişleri artan girdileri alt kolikulus (IC), işitsel sistemin orta beyin çekirdeği nöronların tanımlanmış bir sınıfa haritalamak için CRACM kullanmak için bir yöntem rapor. IC'de, lokal, komiser, yükselen ve azalan aksonlar yoğun bir şekilde iç içe geçmiştir ve bu nedenle elektriksel uyarılma ile ayırt edilemez. Bir presinaptik çekirdekte bir kanaloidofin ekspresyonu sürücü için viral bir yapı enjekte ederek, kanalrhodopsin ifade sinaptik girdilerin varlığı ve fizyolojisi karakterize etmek için yama kıskaç kaydı takip, belirli bir kaynaktan projeksiyonlar IC nöronların belirli bir nüfusa hücre tipine özgü doğruluk ile eşlenebilir. Bu yaklaşımın hem Mavi ışıkla aktive edilmiş channelrhodopsin chronos, hem de kırmızı vitesli bir channelrhodopsin olan ChrimsonR ile çalıştığını gösteriyoruz. Ön beyin önceki raporların aksine, biz ChrimsonR sağlam dorsal koklear çekirdek çekirdek nöronlar aksonları aşağı ticareti olduğunu bulmak, ChrimsonR beyin sapı CRACM deneyler için yararlı bir araç olabileceğini gösteren. Burada sunulan protokol, dorsal koklear çekirdeğive farelerin IC enjeksiyonlarını hedeflemek için stereotaksik koordinatlar da dahil olmak üzere intrakranial virüs enjeksiyon cerrahisinin ayrıntılı açıklamalarını ve tüm hücre yama kıskaç kaydının nasıl birleştirileceğini içerir. IC nöronlar için uzun menzilli projeksiyonlar araştırmak için channelrhodopsin aktivasyonu ile. Bu protokol, işitsel girdileri IC'ye göre karakterize etmek için tasarlanmış olsa da, işitsel beyin sapı ve ötesindeki diğer uzun menzilli projeksiyonları araştırmak için kolayca uyarlanabilir.

Giriş

Sinaptik bağlantılar nöral devre fonksiyonu için çok önemlidir, ancak nöral devreler içindeki sinapsların hassas topolojisi ve fizyolojisini deneysel olarak araştırmak genellikle zordur. Bunun nedeni, hücresel elektrofizyolojinin geleneksel aracı olan elektriksel stimülasyonun, stimülasyon bölgesine yakın aksonların gelişigüzel aktive edilmesidir ve çoğu beyin bölgesinde, farklı kaynaklardan (lokal, yükselen ve/veya azalan) aksonların iç içe geçmiş olmasıdır. Ancak, channelrhodopsin destekli devre haritalama (CRACM)1,2kullanarak, bu sınırlama şimdi3aşılabilir . Channelrhodopsin (ChR2) bir ışık aktive, katyon seçici iyon kanalı aslında yeşil yosun Chlamydomonas reinhardtiibulundu. ChR2 450-490 nm civarında bir dalga boyu mavi ışık ile aktive edilebilir, katyon akını ile hücre depolarize. ChR2 ilk açıklanan ve Nagel ve meslektaşları tarafından Xenopus oositler ifade4. Bundan kısa bir süre sonra, Boyden ve meslektaşları5 memeli nöronlarda ChR2 ifade ve güvenilir bir milisaniye zaman ölçeğinde spiking kontrol etmek için ışık darbeleri kullanabilirsiniz gösterdi, mavi ışık ile ChR2 aktivasyonu ndan sonra eylem potansiyelleri ~ 10 ms indükleyen. Son zamanlarda daha hızlı kinetik içeren optogenetik kanallar bulunmuştur (örneğin, Chronos6).

Bir CRACM deneyiçin temel yaklaşım bir konfotik adeno-ilişkili virüs (rAAV) bir channelrhodopsin için genetik bilgi taşıyan putatif presinaptik nöronlar bir nüfus transfect etmektir. RAAV ile nöronların transfeksiyon kodlanmış channelrhodopsin ekspresyonuna yol açar. Tipik olarak, channelrhodopsin GFP gibi bir floresan protein ile etiketlenir (Yeşil Floresan Protein) veya tdTomato (kırmızı floresan protein), böylece hedef bölgede nöronların transfeksiyon kolayca floresan görüntüleme ile teyit edilebilir. RAAVs non-patojenik olduğundan, düşük inflamatuar potansiyeli ve uzun ömürlü gen ekspresyonuvar 7,8, onlar nöronlara channelrhodopsins sunmak için standart bir teknik haline gelmiştir. Eğer, nöronların putatif presinaptik popülasyontransfeksiyon sonra, ışık yanıp söner yoluyla bir channelrhodopsin aktivasyonu mesaj yofetik potansiyelleri veya hedef nöronlarda akımlar ortaya çıkarır, Bu transfected çekirdekten kaydedilmiş hücreye aksonal bağlantı kanıtıdır. Beyin dilimi deneylerinde kopmuş aksonları channelrhodopsin aktivasyonu yoluyla nörotransmitter serbest bırakmak için tahrik edilebilir çünkü, akut dilim dışında yalan ama postsinaptik beyin bölgesine akson göndermek çekirdekleri CRACM ile tespit edilebilir. Bu tekniğin gücü, tanımlanan uzun menzilli sinaptik girdilerin bağlantısı ve fizyolojisinin doğrudan araştırılabildiğidir.

Mavi ışık tarafından heyecanlı olan kanaloidofinler ek olarak, araştırmacılar son zamanlarda birkaç kırmızı kaydırılmış channelrhodopsins tespit var9,10, Chrimson ve daha hızlı analog ChrimsonR dahil, her ikisi de ~ 660 nm6kırmızı ışık ile heyecanlıyız . Kırmızı ışık mavi ışık daha iyi doku nüfuz çünkü kırmızı kaydırılmış opsins ilgi vardır, ve kırmızı ışık mavi ışık10daha düşük bir sitotoksisite olabilir10 ,11,12. Kırmızı-shifted channelrhodopsins da aynı nöron üzerinde farklı çekirdeklerden aksonların yakınsama bir deneydetest edilebilir çift renkli CRACM deneyleri, olasılığını açmak 6,13,14. Ancak, mevcut kırmızı-shifted opsins genellikle mavi ışık 15 ile istenmeyen çapraz aktivasyonsergilemek 15,16,17, iki renk deneyleri zor hale. Buna ek olarak, bazı raporlar ChrimsonR sınırlı aksonal ticareti uğrar göstermiştir, hangi CRACM deneyleri için ChrimsonR kullanmak zor yapabilirsiniz16,17.

Alt işitsel beyin sapı çekirdeklerinden gelen neredeyse tüm yükselen projeksiyonlar, merkezi işitsel yolun orta beyin merkezi olan alt koliulusta (IC) yakınlaşır. Bu koklear çekirdeğin projeksiyonları içerir (CN)18,19, üstün olilik kompleksi en (SOC)20, ve dorsal (DNLL) ve ventral (VNLL) lateral lemniscus çekirdekleri21. Ayrıca, işitsel korteksten büyük bir azalan projeksiyon IC sona erer18,19,20,21,22, ve IC nöronlar kendilerini ic yerel ve kontralateral loblar içinde geniş sinaps23. Birçok kaynaktan aksonların içiçe olması, ic devrelerinin elektriksel stimülasyon kullanılarak sondalanmasını zorlaştırmıştır24. Sonuç olarak, IC nöronlar ses lokalizasyonu ve konuşma ve diğer iletişim sesleri nin belirlenmesi için önemli hesaplamalar gerçekleştirmek rağmen25,26, IC nöral devrelerin organizasyonu büyük ölçüde bilinmemektedir. Yakın zamanda IC27'dekiilk moleküler olarak tanımlanabilir nöron sınıfı olarak VIP nöronları tanımladık. VIP nöronlar, işitsel talamus ve üstün kolikulus da dahil olmak üzere birçok uzun menzilli hedefe proje glutamaterjik stellat nöronlardır. Artık VIP nöronlara yerel ve uzun menzilli girdilerin kaynaklarını ve işlevini ve bu devre bağlantılarının ses işlemeye nasıl katkıda bulunduğunu belirleyebiliyoruz.

Burada sunulan protokol, özellikle kontralateral IC ve DCN'den(Şekil 1)farelerin IC'sindeki VIP nöronlara sinaptik girdilerin araştırılması için uyarlanmıştır . Protokol kolayca giriş farklı kaynaklara adapte edilebilir, farklı bir nöron tipi veya tamamen farklı bir beyin bölgesi. Ayrıca ChrimsonR'ın işitsel beyin sapında uzun menzilli devre haritalaması için etkili bir kırmızı kaydırmalı kanalrhodopsin olduğunu da gösteriyoruz. Ancak, ChrimsonR güçlü mavi ışık tarafından aktive olduğunu göstermektedir, düşük yoğunluklarda bile, ve böylece, iki renkli CRACM deneylerde Chronos ile ChrimsonR birleştirmek için, dikkatli kontroller ChrimsonR çapraz aktivasyonu önlemek için kullanılmalıdır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Yerel Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi'nden (IACUC) onay alın ve laboratuvar hayvanlarının bakımı ve kullanımı yla ilgili NIH yönergelerine uyun. Bu protokoldeki tüm prosedürler Michigan IACUC Üniversitesi tarafından onaylanmış ve laboratuvar hayvanlarının bakımı ve kullanımı için NIH yönergelerine uygun olarak yapılmıştır.

1. Cerrahi Preparatlar

  1. Aseptik koşullarda ameliyatlar yapın. Ameliyat öncesi tüm cerrahi araç ve gereçleri otoklav/sterilize edin. Ameliyat için ameliyat elbisesi ve maske giyin.
  2. Ameliyat alanını dezenfekte edin (%70 etanol ile püskürtün ve silin) ve ameliyat alanını kapsayacak şekilde steril havlu perdeleri yerleştirin.
  3. Kurtarma kafesini hazırlayın. Boğulma riskini sınırlamak için kafes yataklarını çıkarın. Kafesin altına Bir ısıtma yastığı koyun. Bir gıda ve su kaynağı sağlayın.
  4. Bir pipet çekmece üzerinde nanoenjektör için bir cam kılcal çekin. Çekme işlemi sırasında ısıtma filamentinin yoğun ısısı cam kılcal damarı sterilize edecektir. Çapı yaklaşık 5 μm'lik bir açıklık elde etmek için ucu kesin veya kırın.
  5. Doku penetrasyonunu artırmak ve tıkanmayı azaltmak için kılcal ucu yaklaşık 30° açıya doğru bevel. Kapilleri mineral yağla doldurun ve nanolitre enjektöre yerleştirin.
  6. İstediğin kanalrhodopsin kodlama rAAV bir aliquot elde ve steril PBS kullanarak istenilen titretin seyreltmek.
    NOT: Serotip 1 rAAV'ların işitsel beyin sapı çekirdeklerinin transfeksiyonunda iyi çalıştığını bulduk. Özellikle, rAAV1.Syn.Chronos-GFP.WPRE.bGH (mavi ışık la aktive edilmiş channelrhodopsin) ve rAAV1.Syn.ChrimsonR-tdTomato.WPRE.bGH (kırmızı-shifted channelrhodopsin), hangi kamuya açık depove vektör çekirdekleri mevcuttur, sürekli yüksek ifade düzeyleri ve iyi uzun menzilli aksonal kaçakçılık channelrhopsins CRACM deneyler için gerekli verim.
  7. Steril PBS'de ön dolgu kılcal damarı için enjektör talimatlarına 1-3 μL rAAV uygulayın.

2. Cerrahi

  1. Bir indüksiyon odasına hayvan koyun ve kalibre isofluran buharlaştırıcı ile teslim oksijen% 3 izofluran ile anestezi neden. Nefes derin ve yavaş ve bir ayak tutam refleks yok olana kadar fare gözlemleyin, yaklaşık 3-5 dk.
  2. Hayvanı stereotaksik bir çerçeveye aktarın. Ağzını gaz anestezi maskesi ile bir damak barına koyarak ve her iki kulak kanalına delik siz kulak çubuklarını yerleştirerek hayvanın başını sabitleyin.
  3. Bir rektal sıcaklık probu takın ve homeostatik sıcaklık kontrol cihazını açın.
  4. Gözlerin kurumasını önlemek için oftalmik merhem uygulayın.
  5. Preemptive analjezik uygulayın (örneğin, deri altı enjeksiyon 5 mg/kg karprofen).
  6. Anestezi durumuna göre isoflurane'yi %1-2,5'e ayarlayın. İşlem sırasında mukozanın sıcaklığını, solunumu ve rengini en az 15 dakikada bir takip edin.
  7. Elektrikli makasile kafa derisini tıraş edin. Aseptik povidon-iyot ve% 70 etanol üç alternatif swabs ile kafa derisi hazırlamak.
  8. Kulaklar arasında başlayan ve gözlere devam rostral orta hat boyunca kafa derisi bir kesi olun, lambda ve bregma dikişleri açığa. Cildi yana doğru itin ve gerekirse açıktaki kemikten periostalını çıkarın.
  9. Lambda sütür'ü steril bir cerrahi belirteçle işaretleyin, nanoenjektörün ucunu sadece lambda'ya dokunsa ve mikromanipülatör koordinatlarını sıfırla. Lambda ve bregma dikişleri arasındaki yükseklik farkını ölçmek için nanoenjektör ucu ve mikromanipülatör kullanın. ± 100 μm yükseklik farkı içinde lambda ve bregma getirmek için damak çubuğu yüksekliği ayarlayın.
  10. Nanoenjektör ucu ve mikromanipülatör koordinat sistemini kullanarak enjeksiyon bölgesini haritalayın ve bölgeyi steril bir cerrahi belirteçle işaretleyin. P21-P30 farelerinin IC veya DCN'ine enjekte etmek için Tablo 1'degösterildiği gibi lambda sütüre göre koordinatlar kullanın. Koordinatlarımızdaki Z derinliğinin lambda'daki kafatası yüzeyinden ölçüldüğüne dikkat edin.
  11. Enjeksiyon bölgesi üzerinde kraniyotomi yapmak için steril 0,5 mm matkap çapaklı bir mikromotor matkap kullanın.
  12. Hedef çekirdekteki nöronların geniş transfeksiyonunu sağlamak için, dokuya çeşitli derinliklerde enjeksiyonlar yapın(Tablo 1, Z koordinatları) ve IC gibi daha büyük beyin bölgeleri söz konusu olduğunda, farklı X ve Y koordinatlarında iki veya daha fazla penetrasyon sırasında enjeksiyonlar yapın(Tablo 1, Sağ IC penetrasyon 1 ve Sağ IC penetrasyonu 2).
  13. İğne yap. IC enjeksiyonları için, 2.250 μm ile 1750 m derinlik arasında Z ekseni (enjeksiyon derinliği) boyunca 250 μm aralıklarla 20 nL virüs yatırın. DCN enjeksiyonları için, sırasıyla 4.750 μm ve 4.550 μm derinlikte 20 nL virüs yatırın.
  14. Her Z koordinatına enjeksiyondan sonra enjektörü bir sonraki Z koordinatına taşımadan önce 2-3 dk bekleyin. Bu, virüsün enjeksiyon bölgesinden uzaklaşması için zaman sağlayacak ve nanoenjektör yeniden konumlandırıldığında virüsün enjeksiyon bölgesine çekilme olasılığını azaltacaktır.
  15. Bir penetrasyon son enjeksiyondan sonra, beyinden nanoenjektör çekmeden önce 3-5 dk bekleyin.
  16. Nanoenjektör, penetrasyonlar arasında ve hayvanlar arasında beyinden çıkarıldığında, ucun tıkanıp tıkanmadığını kontrol etmek için uçtan küçük bir miktarda virüs çıkar.
  17. Enjeksiyonlardan sonra, kafa derisinin kesilmiş kenarlarını ısladıktan sonra cildi yavaşça orta hatta doğru hareket ettirmek için steril PBS kullanın. 6-0 (0,7 metrik) naylon dikişler kullanarak basit kesilmiş dikişler ile yara kapatın.
  18. Yaraya 0.5-1 mL %2 lidokain jel uygulayın.
  19. Kulak çubuklarını ve sıcaklık sondasını çıkarın, izofluran'ı kapatın, fareyi damak çubuğundan çıkarın ve kurtarma kafesine aktarın.
  20. Kurtarmayı yakından izleyin. Bir kez hayvan tamamen uyanık, hareket, ve ağrı veya sıkıntı hiçbir belirti gösteren, onun kafes içine geri aktarın ve vivarium kafes dönmek.
  21. Ameliyatlar bir gün içinde birden fazla hayvan üzerinde yapılacaksa, bir sonraki ameliyattan önce ameliyat aletlerini dezenfekte etmek ve çapak delmek için sıcak boncuk sterilizatörü kullanın.

3. Cerrahi Takip

  1. Hayvanların her gün yara kapanması, enfeksiyon veya önümüzdeki 10 gün boyunca ağrı veya sıkıntı belirtileri olup olmadığını kontrol edin ve kurumun hayvan bakım kurallarına uyun.
  2. Kanaloidofinlerin en iyi şekilde ifade edilebilmesi için deneylerde hayvanları kullanmadan önce 3-4 hafta bekleyin.

4. Beyin Dilimi Hazırlama ve Enjeksiyon Hedef Onayı

  1. CRACM için, burada kısaca açıklanan standart in vitro elektrofizyoloji deneylerinde transfected hayvanlardan akut olarak hazırlanmış beyin dilimleri kullanın (daha ayrıntılı bir açıklama için Goyer ve ark. 2019'a bakın27).
  2. Hazırlayın yapay beyin omurilik sıvısı (ACSF) içeren (mM): 125 NaCl, 12.5 D-glukoz, 25 NaHCO3, 3 KCl, 1.25 NaH2PO4, 1.5 CaCl2, 1 MgSO4. Kabarcık ACSF% 95 O2%5 CO2 ile 7,4 pH için .
  3. İn vitro elektrofizyoloji dahil olmak üzere, kanaloidofinlerin aktivasyonunu sınırlamak için karanlığa yakın veya kırmızı ışıkta aşağıdaki tüm adımları gerçekleştirin.
  4. Derinden izoflurane ile fare anestezik ve hızlı bir şekilde decapitate. ~ 34 °C ACSF'de beyni hızlı bir şekilde inceleyin.
  5. ~34 °C ACSF'de IC'yi içeren koronal dilimleri (200-250 μm) titreşen bir mikrotomla kesin ve dilimleri 34 °C'de 30 dakika boyunca ACSF ile dolu bir tutma odasında %95 O2'de%5 CO2 ile kabardı. Kuluçkadan sonra, kayıtları için kullanılana kadar dilimleri oda sıcaklığında saklayın.
  6. Enjeksiyon hedefi IC değilse, enjekte edilen beyin bölgesinin ek koronal dilimlerini kesin ve floresan mikroskop altında hedef çekirdeğin transfeksiyonunu kontrol edin. Hedef çekirdekte transfeksiyon veya farklı beyin bölgelerinde ek transfeksiyon yoksa, denemeye devam etmeyin.

5. In Vitro Kayıt ve CRACM Deney

NOT: Chronos ve ChrimsonR'ın optik stimülasyonunu sağlamak için mikroskobun epifloresans portuna göre LED'ler kullanıyoruz. Ancak LED yerine lazerler kullanılabilir. Lazer kullanıyorsanız, kurumsal güvenlik yetkililerinden önceden onay alın ve güvenli lazer kullanımı için uygun yönergeleri uygulayın.

  1. Borosilikat camdan elektrotları 3,5-4,5 MΩ direncine çekin. Elektrot iç çözeltisi içermelidir (mM): 115 K-glukonat, 7.73 KCl, 0.5 EGTA, 10 HEPES, 10 Na2 fosfokreatin, 4 MgATP, 0.3 NaGTP, %0.1 biyositin (w/v), pH 7.3'e ayarlanan KOH ve osmolalite ile 290 mOsm/kg sakkaroz.
  2. Kayıtları yapmak için standart yama kelepçesi yöntemlerini kullanın. Dilimi sabit bir sahne dik mikroskobu altında bir kayıt odasına yerleştirin ve ~2 mL/dk. Sıcaklıklara (~34-36 °C) yakın bir zamanda ACSF ile sürekli olarak nüfuz edin.
  3. Uygun bir yama kelepçeamplifikatör kullanarak görsel kontrol altında yama nöronlar. Seri direnci, pipet kapasitansi ve sıvı bağlantı potansiyeli için doğru.
  4. Tüm hücre kayıtları sırasında, ticari olarak kullanılabilen LED'ler aracılığıyla 580 nm ışıktan oluşan kısa darbeler ile 470 nm ışık veya ChrimsonR'dan oluşan kısa darbeler (1-5 ms) sağlayarak Chronos'u etkinleştirin. Opsin aktivasyon eşiğini belirleyin ve postsinaptik potansiyelleri ortaya çıkarmak için minimal stimülasyon protokolü kullanın. Genel olarak, PSP ortaya çıkarır kısa uyarıcı süresi kullanın ve PSPs ortaya çıkarmak için gerekli eşik gücü% 120 optik güç ayarlayın.
  5. Membran potansiyelinde kaydedilen değişikliklerin gerçekten nörona sinaptik girdiler olduğunu doğrulamak için, uyarıcı / inhibitör postsinaptik reseptörleri için standart antagonistler deney sırasında yıkanabilir. PSP'ye (örneğin NMDA vs AMPA reseptörleri) farklı reseptör katkılarını araştırmak için uygun reseptör antagonistleri yıkanabilir. Her reseptör antagonist için, ilaç etkileri yıkama sonra ters etmelidir.
  6. Akrobasin ifade eden sinapsların araya giren bir şekilde aktivasyonunun aksine, ışıkla aktive edilen sinaptik girişlerin kayıtlı nöron üzerindeki sinapsların doğrudan optik aktivasyonundan kaynaklandığını doğrulamak için PSP'lerin gecikmesini, gerginliğini ve güvenilirliğini kullanın. kaydedilen nöron üzerinde sinaps nöron. Genel olarak düşük gecikme (<2 ms), düşük titreme (<1 ms standart gecikme sapması) ve yüksek güvenilirlik (>%50) kaydedilen nörona presinaptik nöron ifade channelrhodopsin doğrudan bir sinaptik bağlantı gösterir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Biz VIP-IRES-Cre fareler geçti(Viptm1(cre)Zjh/ J) ve Ai14 Cre-muhabir fareler (B6). Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J) hangi VIP nöronlar floresan protein tdTomato ifade F1 yavruları oluşturmak için. Her iki cinsiyetin F1 yavruları, doğum sonrası gün (P) 21-P70 yaş olarak kullanıldı. Bu çalışmada toplam 22 hayvan kullanılmıştır.

AAV1 stereotaksik enjeksiyon. Syn.Chronos-GFP.WPRE.bGH ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Cracm'nin fare IC'deki nöronlara uzun menzilli sinaptik girdileri tanımlamak ve karakterize etmek için güçlü bir teknik olduğunu bulduk. Burada ayrıntılı olarak yapılan protokolü takiben, DCN ve IC'deki nöronların sağlam transfeksiyonunun yanı sıra Chronos ve ChrimsonR'ın IC'deki sinaptik terminallere güvenilir aksonal ticareti sağladık. Ayrıca, bu tekniğin PSP genliği, yarıgenişlik, çürüme süresi ve reseptör farmakolojisi de dahil olmak üzere postsinaptik olayların ölçülmesini ve analizini sağladığını gösterdik. Deneyim...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Teşekkürler

Bu çalışma Deutsche Forschungsgemeinschaft Research Fellowship (GO 3060/1-1, proje numarası 401540516, DG) ve Ulusal Sağlık Enstitüleri hibe R56 DC016880 (MTR) tarafından desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
AAV1. Syn.ChrimsonR-tdTomato.WPRE.bGHAddgene59171-AAV1
AAV1. Syn.Chronos-GFP.WPRE.bGHAddgene59170-AAV1
Ai14 muhabir fareler (B6. Cg-Gt (ROSA) 26Sortm14 (CAG-tdTomato) Hze / J)Jackson Laboratuvarstoğu #007914
Amber (590nm) LUXEON Asi LEDLuxeon Yıldız LED'leriSP-01-A8
Mavi (470nm) LUXEON Asi LEDLuxeon Yıldız LED'leriSP-01-B4
Carproject (carprofen)Henry Schein Hayvan Sağlığı59149
Drummond glas kılcal damarlarDrummond Scientific Company3-000-203-G/X
Drummond Nanoject 3Drummond Scientific Company3-300-207
Elektrot bevelerSutter EnstrümanFG-BV10-D
Ethilon 6-0 (0.8 metrik) naylon sütürlerEthiconyerel eczane
Sabit kademeli mikroskopherhangi birn/a
Gaz anestezi kafa tutucusuDavid Kopf Aletler933-B
Genel cerrahi aletleriGüzel Bilim AraçlarıN/A
Altın A5 evcil hayvan kesme makinesiOster078005-010-003
Isıtma yastığıÖzel yapıN/A
Vakum sistemli kapüşonlu indüksiyon odasıPatterson Scientific78917760
Sıcak boncuk sterilizatörü Steri 250InotechIS-250
İyot çözeltisi% 10MedChoiceyerel eczane
İzofluran buharlaştırıcıPatterson Scientific07-8703592
Lidokain topikal jöle %2Akornyerel eczane
Mikro motorlu matkap 1050Henry Schein Hayvan Sağlığı7094351
Mikro motorlu matkap uçları 0,5 mmGüzel Bilim Araçları19007-05
Motorlu MikromanipülatörSutter AletiMP-285 / R Oftalmik
merhem Yapay GözyaşlarıAkornyerel eczane
P-1000 elektrot çektirmeSutter EnstrümanıP-1000
Yama kelepçesi amplifikatör dahil veri toplama yazılımıherhangi birn / a
Taşınabilir anesya makinesiPatterson Scientific07-8914724
Küçük hayvan steroetaksik çerçeveDavid Kopf Instruments930-B
Standart kimyasallaryerel satıcılarN/A
standart görüntüleme çözümleri
Steril havlu perdeleriDynarex4410
Cerrahi işaretleyiciGüzel Bilim Araçları18000-30
Sıcaklık kontrolörüÖzel yapıN / A
Vibratomherhangi birn / a
VIP-IRES-Cre fareleri (Viptm1 (cre) Zjh / J)Jackson Laboratuvarstoğu #010908
Su banyosuherhangi birn / a

Kaynaklar

  1. Petreanu, L., Huber, D., Sobczyk, A., Svoboda, K. Channelrhodopsin-2-assisted circuit mapping of long-range callosal projections. Nature Neuroscience. 10, 663-668 (2007).
  2. Atasoy, D., Aponte, Y., Su, H. H., Sternson, S. M. A FLEX Switch Targets Channelrhodopsin-2 to Multiple Cell Types for Imaging and Long-Range Circuit Mapping. Journal of Neuroscience. 28, 7025-7030 (2008).
  3. Deisseroth, K. Optogenetics. Nature Methods. 8, 26-29 (2011).
  4. Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100, 13940-13945 (2003).
  5. Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale genetically targeted optical control of neural activity. Nature Neuroscience. 8, 1263-1268 (2005).
  6. Klapoetke, N. C., et al. Independent optical excitation of distinct neural populations. Nature Methods. 11, 338-346 (2014).
  7. Flotte, T. R. Gene Therapy Progress and Prospects: Recombinant adeno-associated virus (rAAV) vectors. Gene Therapy. 11, 805-810 (2004).
  8. Aponte-Ubillus, J. J., et al. Molecular design for recombinant adeno-associated virus (rAAV) vector production. Applied Microbiology and Biotechnology. 102, 1045-1054 (2018).
  9. Kim, C. K., et al. Simultaneous fast measurement of circuit dynamics at multiple sites across the mammalian brain. Nature Methods. 13, 325-328 (2016).
  10. Lin, J. Y., Knutsen, P. M., Muller, A., Kleinfeld, D., Tsien, R. Y. ReaChR: a red-shifted variant of channelrhodopsin enables deep transcranial optogenetic excitation. Nature Neuroscience. 16, 1499-1508 (2013).
  11. Mager, T., et al. High frequency neural spiking and auditory signaling by ultrafast red-shifted optogenetics. Nature Communications. 9, (2018).
  12. Oda, K., et al. Crystal structure of the red light-activated channelrhodopsin Chrimson. Nature Communications. 9, (2018).
  13. Hooks, B. M. Dual-Channel Photostimulation for Independent Excitation of Two Populations. Current Protocols in Neuroscience. 85, e52(2018).
  14. Schild, L. C., Glauser, D. A. Dual Color Neural Activation and Behavior Control with Chrimson and CoChR in Caenorhabditis elegans. Genetics. 200, 1029-1034 (2015).
  15. Rost, B. R., Schneider-Warme, F., Schmitz, D., Hegemann, P. Optogenetic Tools for Subcellular Applications in Neuroscience. Neuron. 96, 572-603 (2017).
  16. Maimon, B. E., Sparks, K., Srinivasan, S., Zorzos, A. N., Herr, H. M. Spectrally distinct channelrhodopsins for two-colour optogenetic peripheral nerve stimulation. Nature Biomedical Engineering. 2, 485(2018).
  17. Asrican, B., et al. Next-generation transgenic mice for optogenetic analysis of neural circuits. Frontiers in Neural Circuits. 7, (2013).
  18. Oliver, D. L. Dorsal cochlear nucleus projections to the inferior colliculus in the cat: A light and electron microscopic study. Journal of Comparative Neurology. 224, 155-172 (1984).
  19. Oliver, D. L. Projections to the inferior colliculus from the anteroventral cochlear nucleus in the cat: Possible substrates for binaural interaction. Journal of Comparative Neurology. 264, 24-46 (1987).
  20. Glendenning, K. K., Masterton, R. B. Acoustic chiasm: efferent projections of the lateral superior olive. Journal of Neuroscience. 3, 1521-1537 (1983).
  21. Adams, J. C. Ascending projections to the inferior colliculus. Journal of Comparative Neurology. 183, (1979).
  22. Winer, J. A., Larue, D. T., Diehl, J. J., Hefti, B. J. Auditory cortical projections to the cat inferior colliculus. Journal of Comparative Neurology. 400, 147-174 (1998).
  23. Saldaña, E., Merchań, M. A. Intrinsic and commissural connections of the rat inferior colliculus. Journal of Comparative Neurology. 319, 417-437 (1992).
  24. Sivaramakrishnan, S., Sanchez, J. T., Grimsley, C. A. High concentrations of divalent cations isolate monosynaptic inputs from local circuits in the auditory midbrain. Frontiers in Neural Circuits. 7, (2013).
  25. Felix, R. A., Gourévitch, B., Portfors, C. V. Subcortical pathways: Towards a better understanding of auditory disorders. Hearing Research. 362, 48-60 (2018).
  26. Winer, J. A., Schreiner, C., et al. The inferior colliculus: with 168 illustrations. Winer, J. A., Schreiner, C. , Springer. New York, NY. (2005).
  27. Goyer, D., et al. A novel class of inferior colliculus principal neurons labeled in vasoactive intestinal peptide-Cre mice. eLife. 8, e43770(2019).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Stereotaksik KoordinatlarT m H cre Yama KenetlemeChronos ChrimsonRDorsal Koklear NukleusUzun Menzilli Projeksiyonlaritsel Beyin SapViral Enjeksiyon CerrahisiOptik Aktivasyon

İlgili makaleler