Biyomalzeme Membranlar Üzerinde İnsan ve Koyun Korneal Endotel Hücre Tabakalarının Büyümesi

Kornea gözün önünde bulunan şeffaf bir dokudur. Üç ana tabakadan oluşur: dış yüzeyde bir epitel tabakası, bir orta stroma tabakası, ve kornea endotel denilen bir iç tabaka. Kornea endotel Descemet membran denilen bir bodrum membran üzerinde oturur hücrelerin bir monolayer ve altta yatan sulu mizah stroma girer sıvı miktarını düzenleyerek kornea şeffaflığını korur. Stroma içinde çok fazla sıvı kornea şişmesine neden olur, opaklık ve görme kaybı. Endotel bu nedenle görme korumak için hayati önem taşımaktadır.

Kornea endotel yaşlanma, hastalık ve yaralanma gibi nedenlerle bir dizi için işlevsiz olabilir, ve tek mevcut tedavi nakli ameliyatı. Bu ameliyat sırasında endotel ve Descemet'in zarı hastanın korneasından çıkarılır ve donör korneadan elde edilen endotel ve Descemet membranı grefti ile değiştirilir. Birçok endotel greftleri de taşıma ve ev sahibi kornea¹eki yardımcı olmak için stromal doku ince bir tabaka içerir.

Dünya çapında, organ nakli ameliyatları için kornea donör dokusu için talep göz bankaları tarafından temin edilebilir miktardan daha fazladır². Bu nedenle bu açığı hafifletmek için kullanılabilecek doku mühendisliği kornea endotel nakli geliştirmek için bir sürücü olmuştur³. Bunun gerekçesi şu anda, tek bir korneadan endotel sadece tek bir hastaya transfer edilebilir gerçeğine dayanmaktadır, ancak, kornea endotel hücreleri ilk genişletilmiş ve doku kültüründe biyomalzeme iskeleler üzerinde yetiştirilen ise, birden fazla hasta tedavisinde kullanılabilir.

Doku mühendisliğikorneal endotel nakli cerrahlar için uygun bir seçenek haline gelmeden önce ele alınması gereken başlıca zorluklar şunlardır: (1) yüksek kaliteli kornea endotel hücrelerini genişletmek ve olgun ve üretmek için teknikler kurmak fonksiyonel kornea endotel hücre tabakaları in vitro, ve (2) biyomalzeme iskelelerinde hücreleri büyütmek için teknikler oluşturarak şu anda kullanılan donör kornea kaynaklı greftlere eşit veya daha iyi doku mühendisliği greftler üretmek için.

Korneal endotel hücreleri in vivo çok düşük proliferatif potansiyele sahip ama in vitro bölmek için uyarılabilir⁴. Yine de, onlar in vitro epitelyal-mezenkimal geçiş geçmesi için güçlü bir eğilim var (EMT), hangi olgun, fonksiyonel endotel tabakası oluşturmak için kapasitelerini azaltır. Kornea endotel hücrelerinde EMT için bilinen tetikleyiciler bazı büyüme faktörleri ve hücre-hücre teması kaybı maruz kalma içerir⁵. Bu nedenle alt kültür sırasında enzimatik olarak ayrıştırılan kornea endotel hücre kültürlerinin EMT ile ilişkili değişikliklere uğraması neredeyse kaçınılmazdır. Burada, izolasyon, genişleme ve alt kültür aşamalarında hücre-hücre temaslarının bozulmasını en aza indirmek ve EMT potansiyelini azaltmak için tasarlanmış insan veya koyun kornea endotel hücreleri için bir hücre kültürü yöntemi salıyoruz. Ayrıca, donör kornea kaynaklı endotel/Descemet membran/stromal doku greftlerine benzeyen doku yapımı greftlerin, biyomalzeme zarının her iki tarafında ki kültürlü hücre tabakalarının özel yapım bir montaj cihazında nasıl yetiştirilebildiğini gösteriyoruz.

Araştırma için donör onayı ile insan korneaları Queensland Göz Bankası'ndan alındı ve Metro South Hastanesi ve Sağlık Servisi İnsan Araştırma Etik Komitesi (HREC/07/QPAH/048) etik onayı ile kullanıldı. Koyun korneaları queensland Üniversitesi Herston Tıbbi Araştırma Tesisi'nde bir doku paylaşımı anlaşması ile ötenazi hayvanlardan elde edildi.

1. Diseksiyon araçlarının hazırlanması

1. 4 numaralı saat üreticisi iki çift forsepsi 5 dakika boyunca %70 etanol çözeltisinde ıslatarak veya otoklavlayarak sterilize edin.

2. Kültür ortamı ve doku kültür plakalarının hazırlanması

1. Opti-MEM 1 (1x) + GlutaMAX-1, %5 fetal büyükbaş ve 100 U/mL Pen/Strep içeren 100 mL kültür ortamı hazırlayın. Bu kültür ortamı koyun korneal endotel hücre kültürleri için yeterlidir, ancak, insan kornea endotel hücre kültürleri için orta 50 μg / mL sığır hipofiz ekstresi, 0.08% kondroitin sülfat, 200 μg/mL kalsiyum klorür ve 0.3 mM L-askorbik asit 2-fosfat ile takviye edilmelidir. Kültür ortamı karanlıkta 4 °C'de iki hafta saklanabilir.
2. Üreticinin talimatlarını kullanarak Ek Faktörü ile 6 kuyulu doku kültür plakasının kuyularını katlayın ve daha sonra kaplanmış her bir kuyuya 1 mL kültür ortamı ekleyin. Her kornea için bir iyi hazırlayın.

3. Explant diseksiyonu ve hücre kültürü prosedürü

1. Kornea yerleştirin, endotel tarafı yukarı, bir diseksiyon mikroskop aşamasında steril bir Petri kabına. Endüste'yi kornea yüzeyinin endotel tabakasını vurgulamak için yeterli kontrastla iyi aydınlatılmış olması için ayarlayın. Zum, kenar Ve bazı merkezi kornea endotel görünümünde olacak şekilde ayarlayın.
2. Descemet'in membranını altta yatan stromadan yavaşça kaldırmak ve yırtmak için sterilize edilmiş saat çicitlerini kullanın (Şekil 1). Membran hemen kıvrılır bir şerit olarak stroma ayıracak. Şerit, Ek Faktörü ile kaplanmış ve 1 mL kültür ortamı içeren 6 kuyulu doku kültürü plakasının bir kuyuya yerleştirin. Doku kültür plakasının kapağı kontaminasyon riskini azaltmak için eksektisek bitkilerin ekildiği durumlar dışında her zaman tutulmalıdır.
3. Descemet'in membran şeritlerini önce endotel'in aşırı çevresinden sonra da merkezi bölgelerden çıkarın. 6-iyi plaka içinde tek bir kuyuiçine bir kornea tüm şeritler yerleştirin.
4. %5 CO₂ ve 37 °C olarak belirlenen nemli hücre kültürü kuluçka makinesinde ekskütörlerin kuluçkaya yatırın. Ekstesyon ve plaka yüzeyine bağlamak için eksbitki izin vermek için 2 gün boyunca kültür rahatsız edilmeden bırakın. Tipik olarak, eksebitkilerin üçte biri kadarı plakaya bağlanmayı başaramaz.
5. 4 gün sonra orta ve herhangi bir bekar eksbitkiyi kültürden çıkarın ve ekli eksplants rahatsız etmemeye özen alarak yavaşça taze kültür ortamı 2 mL ekleyin. Kültür ortamı haftada iki kez değiştirilmelidir.

4. Seri eksplant kültürüne göre kornea endotel hücrelerinin sürekli üretimi

NOT: Ekstremiteler ek kornea endotel hücre kültürleri oluşturmak için 10 gün sonra taze doku kültür plakaları transfer edilebilir.

1. Eksplant kültürünü bir diseksiyon mikroskobunun aşamasına yerleştirin ve eksplantların görünür olması için aydınlatmayı ve yakınlaştırmayı ayarlayın.
2. Sterilize saat çicitleri kullanarak, her explant'ı kültür plakasından yavaşça koparın ve Ek Faktörü ile kaplanmış ve 1 mL kültür ortamı içeren 6 kuyulu doku kültür plakasının taze kuyuya aktarın.
3. Ekseforların kültür ortamını 2 mL taze kültür ortamıyla değiştirmeden önce 4 gün boyunca yeni plakalarının yüzeyine yerleşmelerine izin verin. Değişim kültür ortamı haftada iki kez değişti.

5. İmmünfloresan analizleri için cam kapaklarda kornea endotel hücrelerinin büyümesi

NOT: İmmünfloresan kullanılarak analiz edilmesi gereken hücre kültürleri, boyama işleminden sonra cam mikroskop slaytlarına monte edilebilen cam kapaklar üzerine kurulmalıdır.

1. Bir otoklavda 13 mm çapındaki yuvarlak cam kapaklı bir paketi sterilize edin veya 15 dakika boyunca %70 etanol ve ardından fosfat tamponlu salin (PBS) üç durulama yıkıntArak.
2. 24 kuyulu doku kültürü plakasının kuyularına tek tek kapakları yerleştirin, Ek Faktörü ile kaplayın ve her kuyuya 0,5 mL kültür ortamı ekleyin.
3. Sterilize saat çicitleri kullanarak doku kültür plakalarından eksplinleri çıkarır ve kapak içeren kuyulara aktarın. Explants orta değiştirmeden önce 4 gün boyunca kapakları üzerine yerleşmek için izin verin.
4. Gerekli kuluçka döneminden sonra, kültür kuyuları içindeki örtüör kültürleri düzeltin ve lekelayın. Lekeli kapakları, floresan mikroskobu altında analiz için cam mikroskop slaytlarına monte edin.

6. Dispase II kullanarak kornea endotel hücrelerinin alt kültürü

NOT: Büyük fibroblastik hücreler bu prosedürü kullanmadan önce 6 kuyulu plakalarda eksplant kültürlerinden seçici olarak çıkarılabilir. Tüm hücreler alt kültüre alınacaksa, 6.2 ile 6.4 adımlarını gerçekleştirmeyin. Bu işlemin amacı hücreleri mümkün olduğunca hücreden hücreye temaslarını sürdürürken yeni plakalara aktarmaktır. Hücreler nazikçe ele alınmalıdır. Tamamen confluent kuyular 1:2 oranında geçilmelidir, subconfluent kuyular ise 1:1 veya daha az bir oranda geçilmelidir.

1. Ortamı kültürden çıkarın ve DPBS ile kısa bir süre durulanın.
2. Versene 1 mL ekleyin. 30 s için oda sıcaklığında kuluçka.
3. Versene kaldırın ve TrypLE 1 mL ekleyin. 3 7 °C'de doku kültürü kuluçka makinesinde 3 dk kuluçkaya yatırın.
4. Bir faz kontrast mikroskobu kullanarak kültürü gözlemleyin. Hücreleri plakadan çıkarmak için kültüre hafifçe dokunun. En kısa sürede büyük fibroblastik hücreler plaka dan ayrılmış onları ve TrypLE 1 mL pipet kullanarak kaldırın. Kalan hücrelerden kalan TrypLE'ı 2 mL DPBS ile iki kez durulayarak yıkayın.
5. 1 mg/mL Dispase II'nin kültüre 1 mL'sini ekleyin ve doku kültürü kuluçka makinesinde 1 ila 2 saat veya tüm hücreler plakadan ayrılana kadar kuluçkaya yatırın. Hücreler yavaş yavaş kümeler halinde plaka uzak yüzen gerekir.
6. Hücreleri 1 mL pipet kullanarak toplayın ve 50 mL'lik bir santrifüj tüpte 20 mL DPBS'ye aktarın. Oda sıcaklığında 300 x g 5 dakika santrifüj.
7. Supernatant çıkarın ve yavaşça kültür orta 1 mL pipet ile triturasyon ile hücre pelet yeniden askıya. Hücre süspansiyonuna 6 kuyuluk bir veya iki kuyuya, sırasıyla 1:1 veya 1:2 oranında geçiş eaktarın.
8. 2 mL yapmak ve doku kültürü kuluçka içine kültürleri yerleştirmek için her kuyuda orta kadar top. Orta yı haftada iki kez 2 mL taze orta ile değiştirin.

7. Biyomalzeme zarlarında kornea endotel hücre tabakalarının büyümesi

NOT: Aşağıdaki yordam, hücre kültürü için mikro Boyden odası adı verilen özel yapım bir montaj cihazına membranöz biyomalzeme nin monte edilmesiyle ilgili adımları açıklar. Cihaz hakkında daha fazla bilgi ve satın alma ayrıntıları için lütfen son yayın^6'ya bakın.

1. Mikro Boyden haznesinin üst odasını, ortasına kırmızı bir O-halkası yerleştirerek birleştirin.
2. Bir politetrafloroetilen (PTFE) kesme tahtası üzerindeki biyomalzeme levhasından bir diski delmek için 18 mm çapında bir trephine kullanın. Bu diski mikro Boyden odasının üst odasına kırmızı o-halkasının üzerine yerleştirin.
3. Alt hazneyi üst hazneye vidala, aradaki biyomalzeme diskini emniyete ala.
4. Sterilize etmek için 1 saat boyunca % 70 etanol içinde monte mikro-Boyden odası ıslatın.
5. Etanol çıkarmak için 10 dakika boyunca steril HBSS'de birleştirilmiş mikro Boyden haznesini tamamen batırın. Bu yıkama adımLarını iki kez tekrarlayın. Tamamlanmamış kültür ortamda 10 dakika için son bir yıkama adımı gerçekleştirin.
6. Sterilize mikro-Boyden haznesini, üst haznenin en üstte olmasını sağlayan 6 kuyulu bir plakanın kuyusundaki kültür ortamına aktarın. Biyomalzeme zarının alt yüzeyine temas eder ancak üst hazneye akmayacak şekilde kültür ortamının seviyesini ayarlayın.
7. Bölüm 6'da belirtilen prosedürü kullanarak kornea endotel hücrelerinin süspansiyon hazırlayın. Mikro-Boyden haznesinde membranda cm² başına en az 100.000 hücrenin tohumlama yoğunluğuna izin vermek için süspansiyonda yeterli hücre yoğunluğu sağlanmalıdır. Mikro Boyden haznesindeki kültür yüzey alanı 0,5 cm² olup 100 μL hacimde olabilir. Bu nedenle 500.000 hücre/mL içeren bir süspansiyon hazırlanmalıdır.
8. Pipet 100 μL hücre süspansiyonu (50.000 hücre) mikro-Boyden odasındamembran üzerine. Doku kültürü kuluçka kuluçka 4 saat için tamamen oda batırmak için orta kadar tepesi önce. Haftada iki kez orta yerine, gerekli süre için kültür kuluçka.
   NOT: Kornea endotel hücreleri biyomateryal membranın üst yüzeyine bağlandıktan sonra mikro-Boyden haznesi kültür içinde ters çevrilebilir, böylece alt oda en üstte yer alabilir. Daha fazla hücre daha sonra membranın diğer yüzeyinde hücre kültürleri başlatmak için odasına eklenebilir. Örneğin, kornea stromal hücreleri kolayca alternatif yüzeye böylece arka kornea içinde görüldüğü gibi kornea hücre tiplerinin göreli konumunu taklit uygulanabilir.

Kornea endotel hücrelerinin insan veya koyun kornealarından izole etme ve genişletme yöntemi Şekil 1 ve Şekil 2'deözetlenmiştir. 1 ila 2 yaşındaki koyunların kornealarından elde edilen ekbitkilerin çoğu veya 30 yaşından küçük insan donörler bir hafta içinde Ek Faktör kaplı doku kültür plakalarına eklenecektir, ancak eksebitkilerin üçte birinin bu süre içinde bağlanmadığını görmek olağandışı değildir. Bu 'yüzen' eksplants kültürlerden kaldırılabilir. 30 yaşından büyük insan donörlerden ekbitkilerin tabağa bağlanma ve hücre kültürleri üretme olasılığı daha düşüktür. Koyun ve insan eksbitkilerinden üretilen kornea endotel hücre kültürlerinin temsili görüntüleri Şekil 3 ve Şekil 4'tegösterilmiştir. Eksekbitkilerden çıkan hücreler genellikle plakaya geçerken birbirleriyle temas halinde kalırlar. Bu tür göçkolektif hücre göçü olarak bilinir ve epitel hücrelerinin bir özelliğidir7. Kültür 2 hafta, küçük, sıkıca paketlenmiş hücrelerin yamalar hemen koyun ve insan kornea8hem de eksgelenen birçok yanında oluşmuş olacak. Hücrelerin bu yamalar EMT morfolojik özellikleri sergilemek ve zaman içinde yavaş yavaş genişletmek yok. Daha düzensiz, fibroblastik şekillere sahip daha büyük hücreler bu yamalar dışında bulunabilir. Kültürler kurulduktan sonra, ekseler pİşme lerle çıkarılabilir ve yeni kültürler oluşturmak için taze tabaklara yerleştirilebilir.

Kornea endotel hücre kültürleri içinde küçük, sıkıca paketlenmiş hücreler TrypLE ile sindirime çok dayanıklıdır, büyük fibroblastik hücreler buna karşı daha duyarlı iken. TrypLE direncindeki bu fark, küçük hücreleri yeni plakalara aktarmadan önce kültürlerden büyük hücreleri seçici olarak kaldırmak için kullanılabilir. TrypLE ve Dispase II kullanılarak subküle işlemi boyunca insan korneal endotel hücre kültürlerinin temsili görüntüleri Şekil 4'tegösterilmiştir.

İmmünofloresans analizleri hücrelerde belirli proteinleri bulmak için kornea endotel hücre kültürleri üzerinde yapılabilir. Bunun bir örneği Şekil 5'teverilmiştir. Koyun ve insan korneasından ekbitkiler 24 kuyulu tabaklarda Ek Faktör kaplı cam örtülere konulmuş ve 4 hafta boyunca kültürlenmiştir. Eksplants kaldırıldı ve daha sonra kültürler ZO-1 varlığı için immünofloresan kullanılarak analiz edildi, sıkı bir kavşak protein, ve N-kadherin, bir yapışık kavşak protein, bizim yayınlananprotokol9 göre . Aynı anti-ZO-1 ve anti-N-kadherin antikorları hem koyun hem de insan hücreleri için kullanıldı ve sonuçlar her iki proteinin de her iki türün plazma zarlarında tespit edildiğini gösterdi. ZO-1 normalde hücre sınırında ayrı bir bant olarak bulunur ancak EMT uygulanan hücrelerde zayıf veya yok olur. Bu nedenle, bu kültürlerdeki sağlam ZO-1 ifadesi hücrelerin EMT'den geçmedi.

Bizim özel yapılmış mikro Boyden odaları 6-iyi doku kültür plakası(Şekil 6)kuyu içinde bir biyomalzeme membran askıya almak için tasarlanmıştır. Biyomalzeme zarının mikro-Boyden haznesine monte edilebilmektedir Şekil 7'degösterilmiştir. Mikro-Boyden haznesinin tasarımı, içinde asılı olan zarın her iki tarafının hücre kültürü yüzeyi olarak aynı anda kullanılmasını sağlar. Bunu göstermek için kornea stromal dokusundan elde edilen koyun stromal hücreleri 100.000 hücre/cm2 yoğunlukta kollajen tip I zarının bir tarafına tohumlanmış ve 24 saat sonra oda ters çevrilmiş ve koyun kornea endotel hücreleri 400.000 hücre/cm2yoğunlukta membranın diğer tarafına tohumlanmış. Doku mühendisliği hücre katmanları 4 hafta boyunca kültüre alındı, daha sonra % 10 nötr tamponlu formalin ile sabitlendi ve rhodamine phalloidin ve Hoechst nükleer boya 33342 kullanılarak lekelendi. Daha sonra konfokal mikroskop kullanılarak incelenmiş ve fotoğraflandılar (Şekil 8). Doku mühendisliği hücre yapısının kesit görünümü kollajen membran bir yüzeyve diğer yüzeyde kornea stromal hücrelerinin çok katmanlı bir kültür kornea endotel hücrelerinin tek bir tabaka ortaya koymuştur.

Şekil 1: Taze kornealardan endotel/Descemet zarının eksektisin elde edilmesi için teknik. (A)Kornea, endoskopi mikroskobun altında petri kabına yerleştirilir. (B) Kırmızı dikdörtgen ile gösterilen alanın görünümünü(A)kapatın. Saat çicitleri descemet zarını altta yatan stromadan nazikçe soymak için kullanılır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Endotel/Descemet membran eksfrezlerinden korneal endotel hücrelerinin kültürlerinin oluşturulması ve genişletilmesi prosedürü. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Koyun kornea endotel/Descemet zarının eksfretlerinden ilk kuruluş sırasında endotel hücre kültürlerinin temsili faz kontrast görüntüleri. (A) Bir koyun kornea endotel / Descemet membran kültür de 3 gün sonra ekstreğe. Kornea endotel hücreleri tabağa göç etmeye başladı. (B) Bir koyun 1 hafta sonra kültür eksplant. Ekstranda, enfluent bir hücre tabakası ile çevrilidir. (C) Bir koyun 2 hafta sonra kültür eksplant. Daha büyük hücreler daha uzakta bulunurken küçük hücreler eksplantın etrafını sarar. (D) Bir koyun 6 hafta sonra kültür eksplant. Küçük, sıkıca paketlenmiş hücrelerden oluşan bir bölge, daha büyük hücrelerden oluşan bir bölgenin yanında görülür. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: Alt kültürler için küçük, sıkıca paketlenmiş insan kornea endotel hücrelerinin izolasyonu. (A) Bir insan kornea endotel / Descemet membran eksplant kültür 7 hafta sonra. Birçok küçük, sıkıca paketlenmiş hücreler ekstrplant yanında mevcuttur. (B) Küçük, sıkıca paketlenmiş hücrelerin bölgeleri insan eksplant kültürlerinde koyun eksplant kültürlerinde gözlenene benzer bir şekilde gelişir. (C) Explant çıkarıldıktan sonra ve TrypLE 20 dk maruz kaldıktan sonra bir insan ekstrüzyon kültürü. Küçük, sıkıca paketlenmiş hücreler, büyük hücreler yüzerken plakaya olan bağlılıklarını korumuşturlar. (D) Dispase II'de 1 saat sonra bir insan kornea endotel hücre kültürü. Çoğu hücre serbest yüzen kümeler olarak plakadan ayrılmıştır. (E) 1 gün sonra bir insan kornea endotel hücre alt kültürü. Hücreler, orijinal ekstrkül kültüründen izole edilmiş hücre kümelerinden dışa doğru göç ettiler. (F) 12 gün sonra bir insan kornea endotel hücre alt kültürü. Hücreler enakıcı bir monolayer oluşturdular. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 5: ZO-1 ve N-kadherin proteinlerinin koyun ve insan korneal endotel hücrelerinin zarlarında çift etiketleme immünoresans ile lokalizasyonu. Koyun ve insan kornea endotel/Descemet membran eksplant kültürleri Ek Faktör kaplı cam kapaklar üzerine kurulmuş ve 4 hafta sonra analiz edilmiştir. Hem ZO-1 (yeşil leke) hem de N-kadherin (kırmızı leke) koyun(A ve B)ve insan(D ve E)kornea endotel hücrelerinin zarlarında saptandı. Birleştirilmiş görüntülerin analizi, iki proteinin kültürler(C ve F)içinde yüksek oranda lokalize olduğunu ortaya koymuştur. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 6: Kesitte gösterilen bir mikro Boyden haznesinin diyagramı. Bizim özel yapılmış mikro Boyden odası bir üst oda, bir alt oda ve bir O-halka oluşur. Bu iyi bir doku kültürü içinde membranöz malzeme nin her türlü askıya almak için kullanılabilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 7: Doku kültürü için mikro-Boyden haznesinde biyomalzeme zarı montajı prosedürü. (A)Bu işlem için gerekli ekipman bir politetrafloroetilen kesme tahtası, bir çift forseps, çapı 18 mm trephine, özel olarak yapılmış bir mikro Boyden odası ve bir biyomalzeme membran içerir. (B) Biyomalzeme zarından bir disk ilerletmek için trephine kullanın. (C) O-halkasını montaj cihazının üst odasına yerleştirin ve üzerine biyomalzeme diski yerleştirin. (D) Alt hazneyi montaj cihazının üst haznesine vidalayın. (E) Monte edilmiş mikro-Boyden haznesi p etanol ile sterilize edilmeye hazırdır. (F) Sterilize mikro-Boyden haznesini 6 kuyulu doku kültür plakasının kuyusundaki doku kültürü ortamına batırın. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 8: Kollajen tip I zarının karşı taraflarında kornea endotel ve stromal hücreler. Hücreler, çekirdekleri (mavi) görselleştirmek için aktin (kırmızı) ve Hoechst'i görselleştirmek için phalloidin rhodamine ile boyandı. Kollajen tip I membran lekeli değildi ve bu nedenle konfokal mikroskopi ile toplanan bu görüntülerde görünür değildir. (A) Doku mühendisliği yapının düşük büyütme, kesit görünümü. Bir kornea endotel hücre kültürünü temsil eden aktin ince bir tabaka membranın üst yüzeyinde görünür, ve bir stromal hücre kültürünü temsil eden aktin kalın bir tabaka membranın alt yüzeyinde mevcuttur. Mavi çekirdekler bu resimde gösterilmez. (B) Hem aktin hem de nükleus boyamasını gösteren kornea endotel hücre tabakasının yüz görünümü. (C) Hem aktin hem de nükleus boyamasını gösteren kornea stromal hücre tabakasının en yüz görünümü. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarları olduğunu beyan.