Kafa Uzayı Gaz Kromatografisi Kullanan ZebraBalığı Embriyolarında Etanol Düzeylerinin Ölçülmesi

Summary

Bu çalışma, uygun maruzkalma yöntemlerinden embriyo işleme ve etanol analizine kadar kafa uzayı gaz kromatografisi kullanarak zebra balığı embriyosundaki etanol düzeylerini ölçmek için bir protokol tanımlamaktadır.

Abstract

Fetal Alkol Spektrum Bozuklukları (FASD), yüz dismorfolojileri ve nörolojik bozukluklar da dahil olmak üzere etanol kaynaklı gelişimsel defektlerin son derece değişken bir sürekliliğini tanımlar. Karmaşık bir patoloji ile, FASD her yıl Amerika Birleşik Devletleri'nde doğan her 100 çocuktan yaklaşık 1'ini etkiler. FASD'nin son derece değişken doğası nedeniyle, hayvan modelleri etanol kaynaklı gelişim kusurları mevcut mekanistik anlayış kritik kanıtlamıştır. Laboratuvarların giderek artan sayıda etanol kaynaklı gelişimsel kusurları incelemek için zebra balığı kullanarak odaklanmıştır. Zebra balıkları çok sayıda dıştan döllenmiş, genetik olarak çıkarılabilir, yarı saydam embriyo üretirler. Bu araştırmacılar tam olarak zamanlaması ve birden fazla genetik bağlamda etanol maruziyetinin dozajını kontrol etmek ve canlı görüntüleme teknikleri ile embriyonik etanol maruziyetinin etkisini ölçmek için izin verir. Bu, insanlar ile hem genetik ve gelişme koruma yüksek derecede ile birlikte, hangi etanol teratojenite mekanistik temeli çalışma için güçlü bir model olduğu zebra balığı kanıtlamıştır. Ancak, etanol maruziyetrejimleri bu çalışmalar arasında zebra balığı verilerinin yorumlanması şaşırttı farklı zebra balığı çalışmaları arasında farklılık göstermiştir. Burada kafa uzayı gaz kromatografisi kullanarak zebra balığı embriyolarında etanol konsantrasyonları ölçmek için bir protokoldür.

Introduction

Fetal Alkol Spektrum Bozuklukları (FASD) nörolojik bozukluklar ve embriyonik etanol maruziyeti ile ilişkili kraniyofasiyal dismorfolojileri geniş bir dizi açıklar¹. Birden fazla faktör, zamanlama ve etanol maruziyeti ve genetik arka plan dozajı da dahil olmak üzere, FASD varyasyonkatkıda^2,3. İnsanlarda, bu değişkenlerin karmaşık ilişkisi, FASD'nin etyolojisini incelemeyi ve anlamayı zorlaştırır. Hayvan modelleri etanol teratojenite mekanistik temelanlayışımızı geliştirmede önemli olduğunu kanıtlamıştır. Hayvan modeli sistemleri geniş bir yelpazede FASD birden fazla yönünü incelemek için....

Protocol

Bu işlemde kullanılan tüm zebra balığı embriyoları, kurulan IACUC protokolleri^27'yegöre yükseltildi ve yetiştirildi. Bu protokoller Austin'deki Texas Üniversitesi ve Louisville Üniversitesi tarafından onaylandı.

NOT: Bu çalışmada zebra balığı hattı Tg(fli1:EGFP)^y1 kullanılmıştır²⁸. Bu işlemde kullanılan tüm su steril ters ozmoz suyudur. Tüm istatistiksel analizler Graphpad Prism v8.2.1 kullanılarak yapılmıştır.

1. Embriyo ortamı nın yapılması

1. Embriyo medya 20x stok yapmak için, NaCl 17.5 g, KCl 0.75 g, 2.9 g CaCl₂, 0.41 g K<....

Results

Kan etanol düzeyleri erken embriyonik zebra balıklarında belirlenemez, çünkü tam olarak oluşmuş bir dolaşım sistemi vardır. Zebra balığı embriyolarında etanol konsantrasyonu düzeyini belirlemek için, etanol düzeyleri doğrudan homojenize embriyonik doku dan ölçülür. Düzgün embriyonik etanol konsantrasyonları ölçmek için, embriyonik hacim dikkate alınmalıdır. Embriyo (sarısı ekli) ekstraembriyonik sıvı ile çevrili chorion (yumurta kabuğu) içinde oturur(Şekil 1). Embriyonun herhangi bir hacim ö.......

Discussion

Gelişimsel bir model sistemi olarak, zebra balıkları çevresel faktörlerin gelişim üzerindeki etkisini incelemek için idealdir. Onlar etanol çalışmalarında kesin zamanlama ve dozaj paradigmaları sağlar dıştan döllenmiş embriyolar, çok sayıda üretmek. Bu, canlı görüntüleme yetenekleri ve insanlar ile genetik ve gelişimsel koruma ile birlikte, zebra balığı teratoloji çalışmaları için güçlü bir model sistemi yapmak. Açıklanan kafa uzayı gaz kromatografisi kullanarak zebra balığı embriyoları geliştirmede embriyonik etanol kon.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Üniversiteye sözleşme ile sağlanan	hava
Analitik Terazi	VWR	10204-962
Otomatik Numune Alma Cihazı, CP-8400	Varian		Gaz Kromatografı Otomatik Numune Alma
Cihazı Kalsiyum Klorür	VWR	97062-590
Etanol	Decon Labs	2701
Politetrafloroetilen/silikon septumlu ve plastik kapaklı gaz kromatograf şişesi 2 mL	Agilent	8010-0198	Şişeleri temizledikten sonra tekrar kullanabilir, ancak kapakları/septaları kullanamaz
Gaz Kromatografı, CP-3800	Varian
Helyum			Üniversiteye sözleşme ile sağlanan
HP Innowax kılcal kolon	Agilent	19095N-123I	30 m x 0,53 mm x 1,0 μ m film kalınlığında
Hyrdogen			Üniversiteye yapılan sözleşme ile sağlanır
Magnezyum Sülfat (Heptahidrat)	Fisher Scientific	M63-500
Mikrosantrifüj tüpü 1.5 mL	Fisher Scientific	2682002
Mikropipet uçları 10 & mu; L	Fisher Scientific	13611106
Mikropipet uçları 1000 μ L	Fisher Scientific	13611127
Mikropipet uçları 200 μ L	Fisher Scientific	13611112
Petri kapları 100 mm	Fisher Scientific	FB012924
Pipetman L p1000L Mikropipet	Gilson	FA10006M
Pipetman L p200L	Mikropipet Gilson	FA10005M
Pipetman L p2L Mikropipet	Gilson	FA10001M
Politetrafloroetilen/silikon septum ve plastik kapak	Agilent	5190-7021	Gaz kromatograf şişeleri için yedek kapaklar/septa
Potasyum Klorür	Fisher Scientific	P217-500
Potasyum Fosfat (Dibazik)	VWR	BDH9266-500G
Pronase	VWR	97062-916
Silika Boncuk .5 mm	Biospec Ürünler	11079105z
Silika Boncuklar 1.0 mm	Biospec Ürünleri	11079110z
Sodyum Bikarbonat	VWR	BDH9280-500G
Sodyum Klorür	Fisher Scientific	S271-500
Sodyum Fosfat (Dibazik)	Fisher Scientific	S374-500
Katı fazlı mikroekstraksiyon fiber düzeneği Karboksen / Polidimetilsiloksan	Millipore Sigma	57343-U	Yedek lifler
Yıldız Kromatografisi İş İstasyonu	Varian		Kromatografi yazılımı
Thermogreen Düşük Kanama (LB-2) Septa	Millipore Sigma	23154	Yedek giriş septası