Method Article

Kafa Uzayı Gaz Kromatografisi Kullanan ZebraBalığı Embriyolarında Etanol Düzeylerinin Ölçülmesi

DOI:

10.3791/60766

⸱

February 11th, 2020

1Department of Biochemistry and Molecular Genetics, Alcohol Research Center, University of Louisville

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, uygun maruzkalma yöntemlerinden embriyo işleme ve etanol analizine kadar kafa uzayı gaz kromatografisi kullanarak zebra balığı embriyosundaki etanol düzeylerini ölçmek için bir protokol tanımlamaktadır.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fetal Alkol Spektrum Bozuklukları (FASD), yüz dismorfolojileri ve nörolojik bozukluklar da dahil olmak üzere etanol kaynaklı gelişimsel defektlerin son derece değişken bir sürekliliğini tanımlar. Karmaşık bir patoloji ile, FASD her yıl Amerika Birleşik Devletleri'nde doğan her 100 çocuktan yaklaşık 1'ini etkiler. FASD'nin son derece değişken doğası nedeniyle, hayvan modelleri etanol kaynaklı gelişim kusurları mevcut mekanistik anlayış kritik kanıtlamıştır. Laboratuvarların giderek artan sayıda etanol kaynaklı gelişimsel kusurları incelemek için zebra balığı kullanarak odaklanmıştır. Zebra balıkları çok sayıda dıştan döllenmiş, genetik olarak çıkarılabilir, yarı saydam embriyo üretirler. Bu araştırmacılar tam olarak zamanlaması ve birden fazla genetik bağlamda etanol maruziyetinin dozajını kontrol etmek ve canlı görüntüleme teknikleri ile embriyonik etanol maruziyetinin etkisini ölçmek için izin verir. Bu, insanlar ile hem genetik ve gelişme koruma yüksek derecede ile birlikte, hangi etanol teratojenite mekanistik temeli çalışma için güçlü bir model olduğu zebra balığı kanıtlamıştır. Ancak, etanol maruziyetrejimleri bu çalışmalar arasında zebra balığı verilerinin yorumlanması şaşırttı farklı zebra balığı çalışmaları arasında farklılık göstermiştir. Burada kafa uzayı gaz kromatografisi kullanarak zebra balığı embriyolarında etanol konsantrasyonları ölçmek için bir protokoldür.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fetal Alkol Spektrum Bozuklukları (FASD) nörolojik bozukluklar ve embriyonik etanol maruziyeti ile ilişkili kraniyofasiyal dismorfolojileri geniş bir dizi açıklar1. Birden fazla faktör, zamanlama ve etanol maruziyeti ve genetik arka plan dozajı da dahil olmak üzere, FASD varyasyonkatkıda2,3. İnsanlarda, bu değişkenlerin karmaşık ilişkisi, FASD'nin etyolojisini incelemeyi ve anlamayı zorlaştırır. Hayvan modelleri etanol teratojenite mekanistik temelanlayışımızı geliştirmede önemli olduğunu kanıtlamıştır. Hayvan modeli sistemleri geniş bir yelpazede FASD birden fazla yönünü incelemek için kullanılmıştır ve sonuçlar son derece insanlarda maruz kalma bulunan ne ile tutarlı olmuştur4. Kemirgen model sistemleri FASD birçok yönünü incelemek için kullanılır, fareler en yaygın olan5,6,7. Bu çalışmanın çoğunluğu erken etanol maruziyeti gelişimsel bozukluklar üzerinde duruldu8, daha sonra etanol maruz ilikal anomalilere neden olduğu gösterilmiştir rağmen9. Ayrıca, farelerin genetik yetenekleri büyük ölçüde FASD10,11genetik temelleri araştırmak için yeteneğimizi yardımcı olmuştur. Farelerde bu çalışmalar kuvvetle sonik kirpi yolu ile gen-etanol etkileşimleri olduğunu göstermektedir, retinoik asit sinyalizasyonu, Süperoksit dismutaz, Nitrik oksit synthase I, Aldh2 ve Fancd28,10,11,12,13,14,15,16,17,18, 19,20,21. Bu çalışmalar, hayvan modellerinin FASD ve onun altında yatan mekanizmaları anlamamızı ilerletmek için kritik öneme sahip olduğunu göstermektedir.

Zebra balığı etanol teratogenez22,23birçok yönünü incelemek için güçlü bir model sistemi olarak ortaya çıkmıştır. Dış döllenme, yüksek fecundity, genetik sedatability ve canlı görüntüleme yetenekleri nedeniyle, zebrabalığı ideal zamanlama, dozaj ve etanol teratogenez genetik gibi faktörlerir çalışma için uygundur. Etanol tam olarak sahnelenen embriyolar için uygulanabilir ve embriyolar daha sonra gelişimsel süreçler sırasında etanol doğrudan etkisini incelemek için görüntülenebilir. Bu çalışma doğrudan insanlarla ilgili olabilir, çünkü genetik gelişim programları zebra balığı ve insanlar arasında son derece korunur ve bu nedenle FASD insan çalışmaları24rehberlik yardımcı olabilir. Zebra balığı etanol teratogenezini incelemek için kullanılırken, embriyonik etanol konsantrasyonlarının raporlanmasında konsensüs eksikliği insanlara kıyasla zor25. Memeli sistemlerinde, kan-alkol düzeyleri doku etanol düzeyleri ile doğrudan ilişkilidir26. Zebra balıklarının çoğu, dolaşım sistemleri tam olarak oluşmadan önce embriyoları tedavi eder. İncelemek için hiçbir anne örneği ile, embriyo içinde etanol düzeylerini ölçmek için etanol konsantrasyonlarını değerlendirmek için bir süreç gereklidir. Burada kafa uzayı gaz kromatografisi kullanarak gelişmekte olan bir zebra balığı embriyosundaki etanol konsantrasyonlarını ölçmek için bir süreç anlatıyoruz.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu işlemde kullanılan tüm zebra balığı embriyoları, kurulan IACUC protokolleri27'yegöre yükseltildi ve yetiştirildi. Bu protokoller Austin'deki Texas Üniversitesi ve Louisville Üniversitesi tarafından onaylandı.

NOT: Bu çalışmada zebra balığı hattı Tg(fli1:EGFP)y1 kullanılmıştır28. Bu işlemde kullanılan tüm su steril ters ozmoz suyudur. Tüm istatistiksel analizler Graphpad Prism v8.2.1 kullanılarak yapılmıştır.

1. Embriyo ortamı nın yapılması

  1. Embriyo medya 20x stok yapmak için, NaCl 17.5 g, KCl 0.75 g, 2.9 g CaCl2, 0.41 g K2HPO4, 0.142 g NA2HPO4, ve 4.9 g MgSO4·7H2O 1 L su. Beyaz çökelti bu formları görmezden; bu medyayı etkilemez. Filtre stok çözeltisini sterilize edin ve 4 °C'de saklayın.
  2. Çalışan embriyo media çözümünün oluşturulması için, 1,2 g NaHCO3'ü 1 L'de 20x embriyo media stokuna eritin ve 19 L su ekleyin. Çalışan embriyo media çözeltisini 28 °C'de saklayın.

2. Su deplasmanı kullanarak embriyonik hacmin ölçülmesi

NOT: Bu protokolde 24 saat postfertilizasyon (hpf) embriyoları(Şekil 1)kullanılmaktadır. Hacim ölçümlerinde kullanılan embriyolar etanol analizinde kullanılmaz.

  1. 10 embriyoyu ve ekstraembriyonik sıvıyı 250 μL hacimde işaretlenmiş 1,5 mL mikrosantrifüj tüpe yerleştirin(Şekil 2A). 250 μL dolgu hattına su ekleyin (Bkz. Şekil 2B'dekiboyalı su ile örnek).
  2. Koroları çıkarılmış embriyolar için reseptörleri kurmak için adım 2.1'i tekrarlayın.
    1. Chorion kaldırmak için, oda sıcaklığında embriyo medyada proteaz kokteyl 2 mg / mL ile 100 mm Petri çanak kendi korolarında embriyoyerleştirin (RT) oda sıcaklığında 10 dakika. Birkaç dakikada bir, embriyoları yavaşça döndürüp koroyu kırın.
    2. Bir kez tüm embriyolar kendi chorion ücretsiz, proteaz kokteyl / embriyo medya den dechorionated embriyolar kaldırmak ve yeni bir 100 mm Petri çanak taze embriyo medya ile embriyoları yıkamak için yerleştirin. Bu yıkama adımını 1 kez daha tekrarlayın (toplam 2 yıkama için). Embriyoları taze 100 mm Petri kabına aktarın.
  3. Mümkün olan en küçük ucu kullanarak ve embriyolara zarar vermeden, p200 mikropipettor(Şekil 2C)kullanarak embriyoların etrafındaki tüm sıvıyı dikkatlice çıkarın ve suyu <0.1 mg hassasiyetle tartın. 10 embriyodan oluşan numunenin hacmini belirlemek için, 250 μL'den çıkarılan suyun ağırlığını/hacmini (1 mL su = 1 g su.) çıkarın. Tek bir embriyonun hacmini belirlemek için, farkı 250°L ile çıkarılan suyun ağırlığı arasındaki 10'a bölün.

figure-protocol-1

figure-protocol-2

3. Embriyoların etanol ile tedavi

  1. Uzamış tanklardan embriyotop ve standart 100 mm Petri kabına yerleştirin. Tek petri kabı başına en fazla 100 embriyo sayma ve 28,5 °C'de kuluçkaya yatırın.
    NOT: Korrion kaldırılacaksa (adım 2.2), etanol eklemeden önce kaldırılması gerekir.
  2. 6 hpf'de, embriyo media veya embriyo media + %1 etanol (v/v) ile yeni bir standart 100 mm Petri kabına 100 embriyo ekleyin. Kapak, ama Petri çanak mühür YAPMAYIN. Embriyoları 18 saat boyunca 28,5 °C olarak ayarlanmış düşük sıcaklıklı bir kuluçka makinesine yerleştirin veya embriyolar 24 hpf gelişimsel zaman noktasına ulaşana kadar.

4. Kafa uzayı gaz kromatografisi için embriyoları işlemeden önce iş akışının hazırlanması

  1. Tüm proteinleri dentabiate etmek ve etanol metabolizmasını önlemek için suda 5 M NaCl 'lik bir çözelti (numune tüpü başına 450°L gerekecektir). Proteaz kokteylini(Malzeme Tablosu)embriyo media'da 2 mg/mL konsantrasyonda yapın.
  2. Her numune için 1,5 mL mikrosantrifüj tüp ve 2 mL gaz kromatograf şişesini etiketlayın. Aşağıda açıklanan etanol standartlarının yanı sıra hava, su ve 5 M NaCl/proteaz kokteyl boşlukları için ek 2 mL gaz kromatograf şişelerini etiketleyin.
  3. Üç p200 mikropipettor iki set 50 μL ve üçüncü seti 200 μL ayarlayın; bir p1000 micropipettor 450 μL ve p2 micropipettor 2 μL olarak ayarlayın. Petri yemeklerinden 1,5 mL mikrosantrifüj tüplerine embriyo aktarmak için kullanılan cam pipetler için, pipet ucunu hızlı bir şekilde bir alev geçirerek kenarları yumuşatmak için embriyolara pipetin içine çizerken zarar vermez.

5. Kafa uzayı gaz kromatografisi için embriyoların işlenmesi

NOT: Hem korolarındaki hem de daha önce korolarından çıkarılan embriyolar seyreltme faktörlerinin hesaplanmasında tutarlılık açısından aynı şekilde tedavi edilir.

  1. 50 μL'ye ayarlanmış iki p200 mikropipettorkullanarak, proteaz kokteyl çözeltisinin 50 μL'sini bir e tek bir e ve 50°L'lik suyu ikinciye çekin.
  2. Cam pipet ve mikropipettor kullanarak, hızlı bir şekilde 10 embriyo (adım 3.2) bir 1.5 mL microcentrifuge tüp yerleştirin ve kapağı kapatın (Şekil 2Aaçıklandığı gibi). Test edilecek tüm örnekler için tekrarlayın, kontroller, ve etanol tedavi embriyolar.
  3. 200 μL olarak ayarlanmış p200 mikropipettor kullanarak, hızlı bir şekilde kapağı açın ve tüm artık embriyo ortamı kaldırmak (Şekil 2C'deaçıklandığı gibi). Hızlı bir şekilde tüp ve hızlı ama yavaşça (embriyolar zarar vermemek için) su 50 μL su içeren pipet yerleştirin, sonra su kaldırın. Bekleyen pipettordan proteaz kokteyl çözeltisinin 50 μL'sini hızla ekleyin ve tüp kapağını kapatın(Şekil 2D).
    NOT: Bu işlemi her seferinde bir örnek gerçekleştirin.
  4. Proteaz kokteylinin chorion'u bozabilmesi için numunenin 10 dk rt'de oturmasını bekleyin. Daha sonra, hızlı bir şekilde 5 M NaCl 450 μL ekleyin ve tüp kapağını kapatın(Şekil 2E). 10 dk için örnekleri girdap. İşlemi hızlandırmak için mikseri aynı anda birden fazla numuneyi girdap lamak üzere ayarlayın.
    NOT: 24 hpf'den büyük embriyoları olan herhangi bir tüpe silika boncuk karışımından (2 beden, 0,5 mm ve 1 mm boncuk) az miktarda (~100 μL) ekleyin. Eski embriyolarda, notochord ne kadar homojenize olursa olsun bozulmadan kalacaktır.
  5. 10 dakika homojenleştikten sonra, hızlı bir şekilde homojenize embriyo supernatant 2 μL çıkarın ve bir gaz kromatograf şişe ekleyin. Şişeyi politetrafloroetilen kapakla hızlıbir şekilde kapatın.

6. Ortam ve etanol standartlarının hazırlanması

  1. Medya standartlarını hazırlamak için, 5 M NaCl/proteaz kokteyl çözeltisi ile medyayı 10 kat seyreltin. Her numuneden 2 μL'lik gaz kromatograf şişesine ekleyin ve politetrafloroetilen kapaklı mühürleyin.
  2. Etanol standartlarını hazırlamak için, 5 M NaCl/proteease kokteyl çözeltisinde 0 etanolün seri seyreltilmesini aşağıdaki konsantrasyonlara göre oluşturun: 0.3125, 0.625, 1.25, 2.5, 5, 10, 20 ve 40 mM. Bir gaz kromatograf şişesine her standarttan 2 μL ekleyin ve politetrafloroetilen kapaklı mühürleyin.

7. Baş uzay gazı kromatografı hazırlama

NOT: Bu kurulum ve protokolün kullanılan gaz kromatografına bağlı olarak değiştirilmesi gerekebilir. Kafa uzayı gaz kromatografisi etanol düzeylerini ölçmek için kullanılır, ayırma için değil.

  1. Otomatik numuneleyicinin ısıtıcısını 58 °C'ye ayarlayın ve açın. Isıtıcının 58 °C'ye ulaşmasına izin verin ve gaz kromatografisini besleyen hava ve hidrojen gazı hatlarını açın (etanolün ölçülmesinde kullanılan alev iyonizasyonu için).
    NOT: Psi, kromatografiyi üreticinin özelliklerine göre düzgün bir şekilde işletecek şekilde ayarlanmalıdır. Helyum hattı açık olduğundan emin olun ve uygun psi ayarlayın.
  2. Septum için enjekte edilen numune sayısının >100 olmadığından emin olun. Enjeksiyon lifi için enjekte edilen numune sayısının >500 olmadığından emin olun.
    NOT: Enjeksiyon miktarının üzerindeyse, test örneklerini çalıştırmadan önce bunların değiştirilmesi gerekir.
  3. Analiz yazılımını açın ve iş istasyonunun düzgün ayarlandıkdığından emin olun. Tüm verileri laboratuvar/departman standartlarına göre saklayın. Çalıştırılacak örnekler için yeni bir örnek listesi oluşturun.
  4. Başlatma yöntemini başlatın ve örnekleri çalıştırmadan önce alev iyonizasyon dedektöründen stabilize olmasını bekleyin. Kararlı bir kez, fiber temizlemek için yazılım başlangıç yöntemi çalıştırın.

8. Kafa uzayı gaz kromatografisi kullanılarak numune ölçümleri

  1. Başlatma yöntemi tamamlandıktan sonra, örnek listesinde örnek başına 1 yeni satır oluşturun. Analiz yazılımındaki yöntem menüsünden, 436 Güncel spme etanol 2013 3dk 2_5min rg çalıştırın. Örnek listedeki her örnek için METH.
    1. Hava, su, 5 M NaCl/proteease kokteyl boşlukları ile başlayan örnek listesini doldurun. Daha sonra 0,3125'ten 40 mM'ye kadar standartları sırayla girin. Hava, su ve 5 M NaCl/proteease kokteyl boşlukları ikinci tur ile standartları izleyin.
    2. Test edilecek tüm homojenize embriyo supernatant örneklerini girin, en düşükten en yüksek tahmin edilen etanol konsantrasyonuna kadar. Hava, su ve 5 M NaCl/proteease kokteyl boşluklarının üçüncü ve son turuna girerek sona erin.
  2. Numunelerin girildiği sırada gaz kromatograf şişelerini otoörnekleyiciye ekleyin. Örneklerin 10-15 dk. Yazılımda numune çalıştırmalarını başlatın.
  3. Tüm örnekler ve son boşluklar çalıştırdıktan sonra, örnek listesine son bir örnek ekleyerek ve bekleme de çalıştırarak yazılımdaki kapatma yöntemini etkinleştirin. METH. Örnek çalışır sırasında elde edilen tüm verileri yedekle. Ekipmanı aşağıdaki sırayla kapatın: otomatik numune ısıtıcı, hidrojen tankı ve ancak kromatograf sıcaklığı 30 °C'ye ulaştıktan sonra hava tankı. Balmumu sütunkorumak için helyum tankı bırakın.

9. Örnek etanol pik entegrasyonu ve numune konsantrasyon analizi

NOT: 9.3'teki tüm değerler, tüm denklemlerin önceden doldurulduğu bir excel dosyasında hesaplanmıştır.

  1. Kapatma yöntemi tamamlandıktan sonra Kromatogramı Aç'a tıklayın. Sonuçları içeren klasörü açın. Örnekler otomatik olarak bu programa entegre edilir.
  2. Sonuçlarda, doğru zirvelerin entegre olduğundan emin olun (etanol 2 ile 2,5 arasında zirveyapar). Tüm numuneler onaylandıktan sonra sonuçları yazdırın veya dışa aktarın.
  3. Bir grafikte etanol standartlarının en yüksek yüksek liğini çizin. Etanol standartları için eğim, Y kese ve R2 değerlerini hesaplayın (R2 >0.99 olmalıdır).
    NOT: Bu değerler, örnek tepe yüksekliğinden etanol konsantrasyonunu belirlemek için kullanılacaktır.
  4. Her örnek için, etanol standartlarının Y kesişme sinden numunenin en yüksek yüksekliğini çıkarın. GC şişelerinde her örnek için etanol değerini elde etmek için bu değeri etanol standartlarının eğimine bölün.

figure-protocol-3

  1. Embriyolarda etanol konsantrasyonu hesaplamak için, ilk her örnek için seyreltme faktörü hesaplamak. Bu protokolün 2.3. Bu, embriyo işleme sırasında her bir örneğe eklenen 5 M NaCl/proteaz kokteyl çözeltisini temsil eder (5.3 ve 5.4. adımlar).

figure-protocol-4

  1. Bu örnek seyreltme faktörlerini kullanarak, her numune için örnek etanol değeri ile çarpın. Sonuçlar mm konsantrasyonu olacaktır. Ortam etanol değerini 10'un seyreltme faktörüyle çarparak ortam referans örneklerini hesaplayın.

figure-protocol-5

figure-protocol-6

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kan etanol düzeyleri erken embriyonik zebra balıklarında belirlenemez, çünkü tam olarak oluşmuş bir dolaşım sistemi vardır. Zebra balığı embriyolarında etanol konsantrasyonu düzeyini belirlemek için, etanol düzeyleri doğrudan homojenize embriyonik doku dan ölçülür. Düzgün embriyonik etanol konsantrasyonları ölçmek için, embriyonik hacim dikkate alınmalıdır. Embriyo (sarısı ekli) ekstraembriyonik sıvı ile çevrili chorion (yumurta kabuğu) içinde oturur(Şekil 1). Embriyonun herhangi bir hacim ö...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gelişimsel bir model sistemi olarak, zebra balıkları çevresel faktörlerin gelişim üzerindeki etkisini incelemek için idealdir. Onlar etanol çalışmalarında kesin zamanlama ve dozaj paradigmaları sağlar dıştan döllenmiş embriyolar, çok sayıda üretmek. Bu, canlı görüntüleme yetenekleri ve insanlar ile genetik ve gelişimsel koruma ile birlikte, zebra balığı teratoloji çalışmaları için güçlü bir model sistemi yapmak. Açıklanan kafa uzayı gaz kromatografisi kullanarak zebra balığı embriyoları geliştirmede embriyonik etanol kon...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu makalede sunulan araştırma, Ulusal Sağlık Enstitüleri/Ulusal Diş ve Kraniyofasiyal Araştırma Enstitüsü (NIH/NIDCR) R01DE020884'ten J.K.E.'ye daha önce verilen hibelerle desteklenmiştir. ve Ulusal Sağlık Enstitüleri/Ulusal Alkol Bağımlılığı ve Alkolizm Enstitüsü (NIH/NIAAA) F32AA021320'den C.B.L.'ye ve Ulusal Sağlık Enstitüleri/Ulusal Alkol Bağımlılığı Enstitüsü'nden (NIH/NIAAA) R00AA023560'dan C.B.L'ye verilen hibe. Rueben Gonzales'e gaz kromatograf analizini sağladığı ve yardımcı olduğu için teşekkür ederiz. Tiahna Ontiveros ve Dr. Gina Nobles'a yardım da çok teşekkür ederiz.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Üniversiteye sözleşme ile sağlananhava
Analitik TeraziVWR10204-962
Otomatik Numune Alma Cihazı, CP-8400VarianGaz Kromatografı Otomatik Numune Alma
Cihazı Kalsiyum KlorürVWR97062-590
EtanolDecon Labs2701
Politetrafloroetilen/silikon septumlu ve plastik kapaklı gaz kromatograf şişesi 2 mLAgilent8010-0198Şişeleri temizledikten sonra tekrar kullanabilir, ancak kapakları/septaları kullanamaz
Gaz Kromatografı, CP-3800Varian
HelyumÜniversiteye sözleşme ile sağlanan
HP Innowax kılcal kolonAgilent19095N-123I30 m x 0,53 mm x 1,0 μ m film kalınlığında
HyrdogenÜniversiteye yapılan sözleşme ile sağlanır
Magnezyum Sülfat (Heptahidrat)Fisher ScientificM63-500
Mikrosantrifüj tüpü 1.5 mLFisher Scientific2682002
Mikropipet uçları 10 & mu; LFisher Scientific13611106
Mikropipet uçları 1000 μ LFisher Scientific13611127
Mikropipet uçları 200 μ LFisher Scientific13611112
Petri kapları 100 mmFisher ScientificFB012924
Pipetman L p1000L MikropipetGilsonFA10006M
Pipetman L p200LMikropipet GilsonFA10005M
Pipetman L p2L MikropipetGilsonFA10001M
Politetrafloroetilen/silikon septum ve plastik kapakAgilent5190-7021Gaz kromatograf şişeleri için yedek kapaklar/septa
Potasyum KlorürFisher ScientificP217-500
Potasyum Fosfat (Dibazik)VWRBDH9266-500G
PronaseVWR97062-916
Silika Boncuk .5 mmBiospec Ürünler11079105z
Silika Boncuklar 1.0 mmBiospec Ürünleri11079110z
Sodyum BikarbonatVWRBDH9280-500G
Sodyum KlorürFisher ScientificS271-500
Sodyum Fosfat (Dibazik)Fisher ScientificS374-500
Katı fazlı mikroekstraksiyon fiber düzeneği Karboksen / PolidimetilsiloksanMillipore Sigma57343-UYedek lifler
Yıldız Kromatografisi İş İstasyonuVarianKromatografi yazılımı
Thermogreen Düşük Kanama (LB-2) SeptaMillipore Sigma23154Yedek giriş septası

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Elliott, E. J., Payne, J., Morris, A., Haan, E., Bower, C. Fetal alcohol syndrome: a prospective national surveillance study. Archive of Diseases in Childhood. 93 (9), 732-737 (2008).
  2. Cudd, T. A. Animal model systems for the study of alcohol teratology. Experimental Biology and Medicine. 230 (6), 389-393 (2005).
  3. Williams, J. F., Smith, V. C. Committee on Substance Abuse. Fetal Alcohol Spectrum Disorders. Pediatrics. 136 (5), 1395-1406 (2015).
  4. Patten, A. R., Fontaine, C. J., Christie, B. R. A comparison of the different animal models of fetal alcohol spectrum disorders and their use in studying complex behaviors. Frontiers in Pediatrics. 2, 93(2014).
  5. Petrelli, B., Weinberg, J., Hicks, G. G. Effects of prenatal alcohol exposure (PAE): insights into FASD using mouse models of PAE. Biochemistry and Cell Biology. 96 (2), 131-147 (2018).
  6. Mayfield, J., Arends, M. A., Harris, R. A., Blednov, Y. A. Genes and Alcohol Consumption: Studies with Mutant Mice. International Review Neurobiology. 126, 293-355 (2016).
  7. Marquardt, K., Brigman, J. L. The impact of prenatal alcohol exposure on social, cognitive and affective behavioral domains: Insights from rodent models. Alcohol. 51, 1-15 (2016).
  8. Sulik, K. K. Genesis of alcohol-induced craniofacial dysmorphism. Experimental Biology and Medicine. 230 (6), 366-375 (2005).
  9. Lipinski, R. J., et al. Ethanol-induced face-brain dysmorphology patterns are correlative and exposure-stage dependent. PLoS One. 7 (8), 43067(2012).
  10. Eberhart, J. K., Parnell, S. The genetics of fetal alcohol spectrum disorders. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 40 (6), 1154-1165 (2016).
  11. Becker, H. C., Diaz-Granados, J. L., Randall, C. L. Teratogenic actions of ethanol in the mouse: a minireview. Pharmacology, Biochemistry and Behavior. 55 (4), 501-513 (1996).
  12. Ahlgren, S. C., Thakur, V., Bronner-Fraser, M. Sonic hedgehog rescues cranial neural crest from cell death induced by ethanol exposure. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (16), 10476-10481 (2002).
  13. Loucks, E. J., Ahlgren, S. C. Deciphering the role of Shh signaling in axial defects produced by ethanol exposure. Birth Defects Research Part A: Clinical and Molecular Teratology. 85 (6), 556-567 (2009).
  14. Hong, M., Krauss, R. S. Cdon mutation and fetal ethanol exposure synergize to produce midline signaling defects and holoprosencephaly spectrum disorders in mice. PLoSGenetics. 8 (10), 1002999(2012).
  15. Aoto, K., Shikata, Y., Higashiyama, D., Shiota, K., Motoyama, J. Fetal ethanol exposure activates protein kinase A and impairs Shh expression in prechordal mesendoderm cells in the pathogenesis of holoprosencephaly. Birth Defects Research Part A: Clinical and Molecular Teratology. 82 (4), 224-231 (2008).
  16. Deltour, L., Ang, H. L., Duester, G. Ethanol inhibition of retinoic acid synthesis as a potential mechanism for fetal alcohol syndrome. The FASEB Journal. 10 (9), 1050-1057 (1996).
  17. Wentzel, P., Eriksson, U. J. Ethanol-induced fetal dysmorphogenesis in the mouse is diminished by high antioxidative capacity of the mother. Toxicological Sciences. 92 (2), 416-422 (2006).
  18. Karacay, B., Mahoney, J., Plume, J., Bonthius, D. J. Genetic absence of nNOS worsens fetal alcohol effects in mice. II: microencephaly and neuronal losses. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 39 (2), 221-231 (2015).
  19. Bonthius, D. J. Jr, Winters, Z., Karacay, B., Bousquet, S. L., Bonthius, D. J. Importance of genetics in fetal alcohol effects: null mutation of the nNOS gene worsens alcohol-induced cerebellar neuronal losses and behavioral deficits. Neurotoxicology. 46, 60-72 (2015).
  20. Bonthius, D. J., et al. Deficiency of neuronal nitric oxide synthase (nNOS) worsens alcohol-induced microencephaly and neuronal loss in developing mice. Brain Research. Developmental Brain Research. 138 (1), 45-59 (2002).
  21. Langevin, F., Crossan, G. P., Rosado, I. V., Arends, M. J., Patel, K. J. Fancd2 counteracts the toxic effects of naturally produced aldehydes in mice. Nature. 475 (7354), 53-58 (2011).
  22. Lovely, C. B., Fernandes, Y., Eberhart, J. K. Fishing for Fetal Alcohol Spectrum Disorders: Zebrafish as a Model for Ethanol Teratogenesis. Zebrafish. 13 (5), 391-398 (2016).
  23. Fernandes, Y., Buckley, D. M., Eberhart, J. K. Diving into the world of alcohol teratogenesis: a review of zebrafish models of fetal alcohol spectrum disorder. Biochemistry and Cell Biology. 96 (2), 88-97 (2018).
  24. McCarthy, N., et al. Pdgfra protects against ethanol-induced craniofacial defects in a zebrafish model of FASD. Development. 140 (15), 3254-3265 (2013).
  25. Lovely, C. B., Nobles, R. D., Eberhart, J. K. Developmental age strengthens barriers to ethanol accumulation in zebrafish. Alcohol. 48 (6), 595-602 (2014).
  26. Harris, R. A., Trudell, J. R., Mihic, S. J. Ethanol's molecular targets. Science Signaling. 1 (28), (2008).
  27. Westerfield, M. The Zebrafish Book: A guide for the laboratory use of zebrafish Danio (Brachydanio) rerio. , University of Oregon Press. Eugene, OR. (1993).
  28. Lawson, N. D., Weinstein, B. M. In vivo imaging of embryonic vascular development using transgenic zebrafish. Developmental Biology. 248 (2), 307-318 (2002).
  29. Hagedorn, M., Kleinhans, F. W., Artemov, D., Pilatus, U. Water Distribution and permeability of zebrafish embryos, Brachydanio rerio. Journal of Experimental Zoology. 278 (6), 356-371 (1997).
  30. Lippi, G., et al. The alcohol used for cleansing the venipuncture site does not jeopardize blood and plasma alcohol measurement with head-space gas chromatography and an enzymatic assay. Biochemia Medica. 27 (2), 398-403 (2017).
  31. Poklis, J. L., Wolf, C. E., Peace, M. R. Ethanol concentration in 56 refillable electronic cigarettes liquid formulations determined by headspace gas chromatography with flame ionization detector (HS-GC-FID). Drug Testing and Analysis. 9 (10), 1637-1640 (2017).
  32. Heit, C., et al. Quantification of Neural Ethanol and Acetaldehyde Using Headspace GC-MS. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 40 (9), 1825-1831 (2016).
  33. Chun, H. J., Poklis, J. L., Poklis, A., Wolf, C. E. Development and Validation of a Method for Alcohol Analysis in Brain Tissue by Headspace Gas Chromatography with Flame Ionization Detector. Journal of Analytical Toxicology. 40 (8), 653-658 (2016).
  34. Schlatter, J., Chiadmi, F., Gandon, V., Chariot, P. Simultaneous determination of methanol, acetaldehyde, acetone, and ethanol in human blood by gas chromatography with flame ionization detection. Human and Experimental Toxicology. 33 (1), 74-80 (2013).
  35. Schier, C. J., Mangieri, R. A., Dilly, G. A., Gonzales, R. A. Microdialysis of ethanol during operant ethanol self-administration and ethanol determination by gas chromatography. Journal of Visualized Experiments. (67), e4142(2012).
  36. Adalsteinsson, E., Sullivan, E. V., Mayer, D., Pfefferbaum, A. In vivo quantification of ethanol kinetics in rat brain. Neuropsychopharmacology. 31 (12), 2683-2691 (2006).
  37. Quertemont, E., Green, H. L., Grant, K. A. Brain ethanol concentrations and ethanol discrimination in rats: effects of dose and time. Psychopharmacology. 168 (3), 262-270 (2003).
  38. Flentke, G. R., Klinger, R. H., Tanguay, R. L., Carvan, M. J., Smith, S. M. An evolutionarily-conserved mechanism of calcium-dependent neurotoxicity. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 38 (5), 1255-1265 (2014).
  39. Reimers, M. J., Flockton, A. R., Tanguay, R. L. Ethanol- and acetaldehyde-mediated developmental toxicity in zebrafish. Neurotoxicology and Teratology. 26 (6), 769-781 (2004).
  40. Zhang, C., Ojiaku, P., Cole, G. J. Forebrain and hindbrain development in zebrafish is sensitive to ethanol exposure involving agrin, Fgf, and sonic hedgehog function. Birth Defects Research Part A: Clinical and Molecular Teratology. 97 (1), 8-27 (2013).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Ethanol QuantificationHead Space Gas ChromatographyZebrafish EmbryosFetal Alcohol Spectrum DisordersProtease Cocktail TreatmentEmbryo Volume MeasurementGas Chromatography AnalysisEthanol Concentration CalculationMedia Reference SamplesEmbryonic Water Content

Related Articles