Yöntem makalesi

Canlı ve Fonksiyonel Murine Koklear Saç Hücrelerinde Dekstran Etiketleme ve Alımı

DOI:

10.3791/60769

⸱

8 Şubat 2020

 , 
1Molecular Physiology and Biophysics Section, National Institute of Neurological Disorders and Stroke, National Institutes of Health

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, fonksiyonel mekanotransdüksiyon kanalları ile işitsel saç hücrelerinde 3 kDa Texas Kırmızı etiketli dextran alımını görselleştirmek için bir yöntem salıyoruz. Buna ek olarak, 3-10 kDa dekstrans saç endositoz ve Corti organının destekleyici hücreleri çalışmak için kullanılabilir.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Saç hücreli meçakondüksiyon (MET) kanalı işitmede önemli bir rol oynar. Ancak MET'nin moleküler kimliği ve yapısal bilgileri bilinmemektedir. Saç hücrelerinin elektrofizyolojik çalışmalar MET kanalı büyük bir iletkenlik olduğunu ve nispeten büyük floresan katyonik moleküllere geçirilebilir olduğunu ortaya koymuştur, bazı stratil boyalar ve Texas Kırmızı etiketli aminoglikozit antibiyotikler de dahil olmak üzere. Bu protokolde, fonksiyonel MET kanalları için analiz etmek için kullanılabilecek Corti eksbitkilerinin organının saç hücrelerindeki floresan dekstrans alımını görselleştirmek ve değerlendirmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Biz bulduk 3 kDa Texas Kırmızı etiketli dextran özellikle etiketler fonksiyonel işitsel saç hücreleri 1-2 h kuluçka sonra. Özellikle, 3 kDa dextran etiketler iki kısa stereocilia satır ve fonksiyonel MET kanalları mevcut olduğunda bir diffüz desen hücre gövdesinde birikir. Saç hücrelerinin hücre vücudunda ve destekleyici hücrelerde vezür benzeri bir etiketleme deseni gözlendi. Verilerimiz, hücresel boya alımı için iki yolu görselleştirmek ve incelemek için 3 kDa Texas-Red dextran'ın kullanılabileceğini göstermektedir; fonksiyonel MET kanalları ve endositoz yoluyla bir saç hücresi özgü giriş yolu, bir desen de büyük dextran için kullanılabilir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İç kulağın saç hücreleri, sesi algılayan ve elektrik sinyallerindeki mekanik uyaranları getkileyen duyu hücreleridir ve bu hücreler sonuçta beynimiz tarafından yorumlanır. Bu hücreler, stereosilya olarak bilinen ve apikal bölge1,2'dençıkıntı yapan üç sıra aktin bazlı filamentten oluşan merdiven şeklinde bir demet vardır. Mekanik uyaranlar stereositif filamentleri en uzun sıraya doğru saptırır ve meçakontransdüksiyon (MET) kanallarının açılmasını tetikler3. MET kanallarının açılması hücrede polarize ve dolayısıyla saç hücresibazal bölgede sinaps veziküllerin serbest sinyalleri katyon akını yol açar.

MET kanalının işitme için gerekli olan biyofiziksel özellikleri kapsamlı bir şekilde karakterize edilmiştir. Diğer özellikleri arasında, bu kanallar katyonik seçici ve nispeten büyük iletkenlik var (150-300 düşük Ca2 +pS )4,5,6,7,8,9,10. Dikkat çekici, FM1-43 ve Texas Kırmızı etiketli aminoglikozitler gibi büyük floresan moleküller MET kanalının perkast blokerler, floresan mikroskopi11,12,13,14kullanılarak görselleştirilebilir saç hücre gövdesinde bunların birikimi ile sonuçlanan . Tam tersine, MET kanalının moleküler kimliği ve yapısı ve geçirim yolu zor kalmıştır. Deneysel kanıt artan transmembran benzeri kanal protein 1 (TMC1) olgun saç hücrelerinde MET kanalının bir bileşeni olduğunu gösterir15,16,17,18,19. Transmembran benzeri kanal 1 'deki (TMC1) mutasyonlar MET kanal özelliklerini19,20,21,22 olarak değiştirir ve sağırlık lara neden olur. Buna ek olarak, TMC1 MET kanal18,23 sitesine lokalize ve MET kanal24,25mekanik kuvvet iletimi sorumlu ucu bağlantı ile etkileşime . Ayrıca, son biyoinformatik analizi mechanosensitive kanalları TMEM63/OSCA proteinleri ve TMEM16 proteinleri, kalsiyum aktive klorür kanalları ve lipid scramblases bir aile ile ilgili evrimsel olarak TMC proteinleri tespit etmiştir26,27,28. Bu proteinler arasındaki ilişkiye dayanan TMC1 yapısal bir model protein-lipid arayüzü nde büyük bir kavite varlığını ortaya27. Bu kavite otozomal dominant işitme kaybına neden iki TMC1 mutasyonu barındıran (DFNA36)27,29,30,31,32, ve kavite kalıntıları için sistein mutantların seçici modifikasyonMET kanal özellikleri değiştirmek28, MET kanalının permeasyon yolu olarak işlev olabileceğini belirten. TMC proteinlerinde öngörülen bu kavitenin büyük boyutu, büyük moleküllerin MET kanalına nüfuz etme yeteneğini açıklayabilir. MET kanalının alışılmadık derecede büyük bir permeasyon yolu içerdiği öngörüsünü test etmek ve TMC1'de gözlenen boşluğun büyüklüğünün sınırlarını zorlamak için Corti ekspertizlerinin organında daha büyük bir moleküle sahip 3 kDa dextran floresan ile alım deneyleri yapmak için bir protokol geliştirdik.

Dextran alfa-1,6 glikozidik bağlantılarla bağlanmış birçok D-glukoz molekülünden oluşan karmaşık dallı bir polisakkarittir. Su, düşük hücre toksisitesi ve biyoinertite yüksek çözünürlük çeşitli hücresel süreçleri incelemek için çok yönlü bir araç yapmak. Buna ek olarak, dextran boyutları geniş bir yelpazede mevcuttur ve floresan çeşitli renk floroforlar ile etiketlenmiş. Floresan etiketli dekstrans yaygın hücre ve doku geçirgenlik araştırma33,34, birden fazla hücresel sistemlerde endositon çalışması için kullanılır35,36, ve nöral izleme için37,38. İşitsel alanda, dextran molekülleri de hücre-hücre kavşak bozulması ve Corti chinchilla organında yoğun gürültüye maruz kaldıktan sonra işitsel duyusal epitel bütünlüğünün kaybı nı değerlendirmek için kullanılmıştır39,40.

Bu çalışmada, bazı küçük özellikleri istismar (3 ve 10 kDa) floresan deksan dextrans minten iç kulak saç hücrelerinde alım deneyleri gerçekleştirmek ve iç kulak saç hücresi MET kanalının permeasyon yolunun boyutunu keşfetmek için. Buna ek olarak, stereositya ve işitsel saç hücrelerinin hücre gövdesinde floresan dekstran görselleştirmek ve lokalize etmek için airyscan dedektörü ile donatılmış bir lazer tarama konfokal mikroskop (LSM) 880 kullandık.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hayvan bakımı ve deneysel prosedürler, Ulusal Nörolojik Bozukluklar ve İnme Enstitüsü Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (KJS'ye #1336 Hayvan protokolü) tarafından onaylanan Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı ile ilgili yönergelere uygun olarak gerçekleştirilmiştir.

1. Fareler

  1. Yavruların doğum tarihini kontrol etmek ve yavruların yaşını takip etmek için hayvan tesisinde üremek için C57BL/6J yabani tip üreme çiftleri bir çift ayarlayın.

2. Kokleae Diseksiyonu

  1. Diseksiyonları gerçekleştirmek için stereomikroskoba yakın temiz bir alan ayarlayın(Şekil 1A). Alanı ve çevreyi temizlemek ve temiz bir tezgah pedi yerleştirmek için %70 etanol kullanın. Bir Tıbbi Patolojik Atık (MPW) plastik torba hayvan leşleri atmak için gerekli olacaktır.
  2. Bazı Leibovitz's L15 medya ile birkaç 35 mm yemekler hazırlayın.
    NOT: Leibovitz's L-15 hücreli medya içerir 1-2 mM Ca2 +, uç bağlantılarının bütünlüğünü korumak için gerekli olan, ve esansiyel amino asitler içerir, vitaminler, ve hücre sağlığını ve sağkalımını artırmak için sodyum pirüuvat. Serum, düşük tanımlı bileşimi ve dekstran ile potansiyel girişim nedeniyle deneysel değişkenlik önlemek için dışlandı.
  3. Doğum sonrası-gün-6 (P6) farelerin kafasını nisbeten ötenazi.
    NOT: 6 günlük fareler inhalant anestezilere karşı biraz dirençlidir. Ötenazi için izofluran veya uzun süreli CO2 pozlama (50 dakikaya kadar) kullanılsa da, ölümü sağlamak için ikincil bir fiziksel yöntem önerilir.
  4. Arka uç ve dış işitsel kanallar arasında ön yüzeysel bir kesim yaparak kafatası deri kaldırmak için cerrahi makas kullanın.
  5. Kafatasını ortaya çıkarmak için deriyi buruna doğru katlayın (Şekil 2B).
  6. Arkadan kafatasının önüne ve göz çizgisinden(Şekil 2B-C)bir kesi yapın.
  7. Kafatasını iki ye ayırın ve temporal kemikleri ortaya çıkarmak için küçük bir spatula kullanarak beyni çıkarın (Şekil 2C-D).
  8. Küçük makas ile, temporal kemiklerin etrafında kesilmiş ve doku çıkarmak.
  9. Her iki temporal kemiği de 35 mm'lik bir tabağa yerleştirin ve L15 media(Şekil 2E)ile kaplanmış olduğundan emin olun.
    NOT: Aşağıdaki adımlar stereomikroskop altında gerçekleştirilir. Siyah bir arka plan genellikle ince diseksiyon adımları sırasında doku görselleştirmek için yardımcı olur.
  10. Geniş alan lı bir mercek (10X büyütme gücü (WF10X) ve harici alternatif akım (AC) halojen ışık kaynağı ile donatılmış stereomikroskop altında, çevredeki koklea dokularını, yarım daire kanalları ve cerrahi çalgılarile vestibüler organları çıkarın(Şekil 2F).
  11. Dextran ve L15 medyasının koklear kanala girmesine izin vermek için, biri yuvarlak pencerede diğeri apikal koklear bölgede olmak üzere, parçalanmış kokleae üzerinde iki delik sınırı gerçekleştirin.
  12. 9 kuyulu cam depresyon plakasından her kuyuya 300 mL Leibovitz'in L15 ortamı ekleyin.
  13. Her kuyuya en az üç tane parçalanmış kokleae yerleştirin.

3. Dextran Etiketleme

  1. Hanks'in dengeli tuz çözeltisindeki dekstranı Ca2+ ve Mg2+ (HBSS-CFM) olmadan 10 mg/mL'lik son konsantrasyonda yeniden oluşturun. Bu stok çözeltisi opak siyah tüplerde (ışıktan korunmuş) ve kullanıma kadar -30 °C'de saklanmalıdır.
    NOT: Lizin düzeltilebilir dextran kullanımı bu protokolün başarılı bir sonucu için çok önemlidir.
  2. Leibovitz'in L15 media'sının 500 mL'sinde her dekstran 2 mg/mL'lik son konsantrasyonda hazırlayın.
  3. Kokleadan ortamı çıkarın ve Leibovitz'in 2 mg/mL'lik son konsantrasyonda ilgi dekstraniçeren L15 ortamını ekleyin.
    NOT: MET kanallarının bir kısmı41,42'deaçık olmasına rağmen, MET kanalının açık olasılığını artırmak için ekskütiflerin hafifçe sallanması ile dextran kuluçka işlemi gerçekleştirilmiştir.
  4. 25° eğimli açıya sahip 3 boyutlu bir çalkalayıcı kullanarak hafif sallayarak 2 saat oda sıcaklığında kuluçkaya yatın ..
    NOT: Floresan etiketli dextran mümkünolduğunda ışıktan korunmalıdır. 2 saat kuluçka sırasında dextran korumak için, alüminyum folyo sarılmış bir hücre kültürü P150 çanak içine 9 iyi cam plaka yerleştirin.

4. Görüntüleme için Örnek Hazırlama

  1. Dekstran ile kuluçkadan sonra, 2 dk boyunca iki kez media ve bir kez HBSS ile doku yıkayın.
  2. Hanks'in dengeli tuz çözeltisinde (HBSS) %4 paraformaldehit ile 30 dk oda sıcaklığında doku kuluçka.
    DİkKAT: Formaldehite maruz kalmak gözlerde, burunda ve üst solunum yollarında tahriş edici olabilir. Bazı kişilerde, formaldehit tekrarlanan cilt maruziyeti alerjik dermatit neden olabilir duyarlılık neden olabilir. Formaldehit bilinen bir insan karsinojenve şüpheli bir üreme tehlikesidir.
  3. Paraformaldehiti çıkarmak için sabit dokuyu HBSS ile iki kez hızlı ve hafifçe yıkayın.
    NOT: Kokleanın bu gelişim evresinde temporal kemiklerin kireçlenmesine gerek yoktur.
  4. Corti organını incelemek için spiral ligamenti ve tektorial membranı ince uçlu terpler ile çıkarın (Şekil 2G).
  5. Doku tüm küçük parçaları çıkarın ve HBSS ile doku yıkayın.
  6. F-aktin etiketlemek ve görselleştirmek için 30 dakika boyunca 1:200 seyreltme de floresan etiketli phalloidin içeren PBS%0.5 Triton X-100 dokuyu permeabilize (TR veya FITC etiketli dextran alımını test ederken yeşil veya kırmızı konjuge) aktin bazlı stereocilia.
  7. Triton ve phalloidin fazlalığı kaldırmak için HBSS tampon ile 2-3 dakika her zaman doku yıkayın ve bir kez PBS ile tuzları kaldırmak için.
  8. Corti dokularının organını mikroskop slaytına monte edin ve üzerini montaj lı ortamla kapatın.
    NOT: Doku monte ederken, saç hücresi stereocilia içeren doku tarafında coverslip karşı karşıya olduğundan emin olun.
  9. Montaj ortamının eklenmesi sırasında oluşan olası kabarcıkları çıkarın ve kapak kaymasının yerleştirilmesi sırasında yeni kabarcıkların oluşmasını önleyin.
    NOT: Bir pipet ile aspire herhangi bir kabarcık montaj ortamının eklenmesi sırasında oluşturulan. Hava kabarcıklarının örtü altında sıkışıp kalmamasını önlemek için, coverslip'in kenarını numunenin yakınına yerleştirin ve coverslip'i forceps veya pipet ucu kullanarak dikkatlice ve yavaşça doku üzerinde indirin.
  10. Montaj ortamlarında dokuyu cam bir kapak fişi ile kapatın (Şekil 2H).
    NOT: 0,4'ün üzerinde sayısal diyafram açıklığına sahip hedefler, #1,5 kapaklı (0,17 mm kalınlık) kullanacak şekilde tasarlanmıştır. Yanlış kapak kaymasını kullanmak, görüntülerin yoğunluğu ve kalitesi açısından ciddi sonuçlar doğurabilir.
  11. Monte edilen dokuyu oda sıcaklığında bir gece boyunca kuluçkaya yatırın ve montaj ortamının kurumasını bekleyin ve slaytları görüntülemeye kadar 4 °C'de saklayın.

5. Görüntü Edinme ve Görüntü İşleme

NOT: Konfokal görüntüler, süper çözünürlüklü (SR) mod 43 ve63x objektifte 32 kanallı Airyscan dedektörü ile donatılmış lsm 880 konfokal mikroskop ile çekildi.

  1. Amaç daldırma yağı küçük bir damla ekleyin.
  2. Monte edilmiş doku örneğini içeren mikroskop slaytını, daldırma yağına bakan cam kapak lı mikroskop aşamasına yerleştirin.
  3. Örneğe odaklanın ve görüntü edinme yazılımını kullanarak görüntüleme parametrelerini ayarlayın.
  4. Her bağımsız deneme için x, y ve z çözünürlüğü için aynı görüntü alma ayarlarını ve en uygun parametreleri kullanın. Bir piezo odaklı odak sistemi hızlı ve hassas görüntü z-yığın elde ederken hedefi taşımak için gereklidir.
    NOT: Saç hücrelerinin tüm apikal bölgesini görüntülemek için, en uygun ayarları kullanarak stereocilia'dan saç hücresi vücudunun apikal yarısına kadar bir z-görüntü yığını toplayın. Vezikül benzeri parçacıkların görüntülenmesi için saç hücresi boyunca büyük bir z-yığını toplamak çok önemlidir.
  5. Airyscan 3D yeniden yapılandırma algoritmasını kullanarak ham confocal görüntüleri otomatik varsayılan dekonvolution filtresi ayarlarıyla işlemek için görüntü edinme yazılımını kullanın.
  6. Parlaklığı ve kontrastı ayarlamak, ölçek çubuğunu eklemek ve son rakamlar için görüntüleri dışa aktarmak için görüntü işleme yazılımındaki konfokal görüntüleri açın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biz 3 kDa dextran floresan Texas Red (dextran-TR)(Şekil 2A-B)ile etiketli yabani tip postnatal-day-6 (P6) farelerden Corti ekstrenlerin organ 2h kuluçka sonra saç hücrelerinin sağlam ve spesifik etiketleme gözlendi. Dekstran etiketleme, Corti organının bazal, orta ve apikal bölgelerinde hem iç hem de dış saç hücrelerinde (IHC ve OHC) gözlendi(Şekil 2B).

Floresan etiketli phalloidin filamentöz aktin (F...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, 3 kDa dextran Texas Red ile Corti ekstremitelerinin murine organında alım deneylerinin nasıl yapılacağını açıklar. Bu yöntemin amacı, daha önce test edilmiş diğerlerinden daha büyük moleküllerin aynı zamanda işitsel saç hücrelerini özel olarak etiketleyip MET kanalına nüfuz edip edemediğini test etmektir. Benzer deneysel protokoller daha önce FM1-43 (0,56 kDa)12,19,20 ve Texas Kırmızı etiketli aminoglikozitler (1.29...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biz confocal görüntü edinimi yardımcı olmak için NICHD mikroskobu ve görüntüleme çekirdek Vincent Schram teşekkür, ve Tsg-Hui Chang koloni yönetimi ve fare bakımı ile paha biçilmez yardım için. Bu araştırma NINDS, NIH, Bethesda, MD Intramural Araştırma Programı tarafından K.J.S. A.B. tarafından NINDS, NIH Intramural Araştırma Programı ve intramural araştırma programından Robert Wenthold Doktora Sonrası Bursu tarafından desteklenmiştir. NIDCD'nin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
# 1.5 cam lameller 18mmWarner Instruments64-0714
Alexa Fluor 488 PhalloidinThermoFisherA12379
Alexa Fluor 594 PhalloidinThermoFisherA12381
alfa Plan-Apochromat 63X / 1.4 Yağ Corr M27 objektifCarl Zeiss420780-9970-000
Amilorid hidroklorürEMD MILLIPORE
Benchwaver 3 boyutlu RockerKarşılaştırmaları bilimselB3D5000
C57BL/6J vahşi tip faretürü 000664Jackson Laboratuvarı
Hücre impermean BAPTA tetrapotasyum tuzuThermoFisherB1204
Dekstran, Floresein, 10.000 MW, Anyonik, Lizin SabitlenebilirThermoFisherD1820
Dekstran, Teksas Kırmızısı, 10.000 MW, Lizin SabitlenebilirThermoFisherD1863
Dekstran, Teksas Kırmızısı, 3000 MW, Lizin SabitlenebilirThermoFisherD3328
Formaldehit Sulu Çözelti EM Sınıfı Elektronmikroskobu bilimi15710
HBSS, kalsiyum, magnezyum, fenol kırmızısı yokThermoFisher14025
HBSS, kalsiyum yok, magnezyum yok, fenol kırmızısı yokThermoFisher14170
Görüntü J veya FIJINIHhttp://fiji.sc/
Immersol 518F yağa daldırma ortamıCarl Zeiss444970-9000-000
Leibovitz'in L-15 Medium, GlutaMAX TakviyesiThermoFisher31415029
neomisin trisülfat tuzu hidratSigmaN6386
PBS (10X), pH 7.4ThermoFisher70011069
Phalloidin-CF405MBiotium00034
ProLong Elmas antifade montaj ortamıThermoFisherP36970
superfrost plus mikroskop slaytıFisherbrand22-037-246
Triton X-100SigmaT8787
Zen Black 2.3 SP1 yazılımıCarl Zeisshttps://www.zeiss.com/microscopy/us/products/microscope-software/zen.html
129876

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Furness, D. N., Hackney, C. M. The Structure and Composition of the Stereociliary Bundle of Vertebrate Hair Cells. , Springer. New York. (2006).
  2. Barr-Gillespie, P. G. Assembly of hair bundles, an amazing problem for cell biology. Molecular Biology of the Cell. 26 (15), 2727-2732 (2015).
  3. Shotwell, S. L., Jacobs, R., Hudspeth, A. J. Directional sensitivity of individual vertebrate hair cells to controlled deflection of their hair bundles. Annals of the New York Academy of Sciences. 374, 1-10 (1981).
  4. Fettiplace, R., Kim, K. X. The physiology of mechanoelectrical transduction channels in hearing. Physiological Reviews. 94 (3), 951-986 (2014).
  5. Fettiplace, R. Hair Cell Transduction, Tuning, and Synaptic Transmission in the Mammalian Cochlea. Comprehensive Physiology. 7 (4), 1197-1227 (2017).
  6. Corey, D. P., Hudspeth, A. J. Ionic basis of the receptor potential in a vertebrate hair cell. Nature. 281 (5733), 675-677 (1979).
  7. Beurg, M., Evans, M. G., Hackney, C. M., Fettiplace, R. A large-conductance calcium-selective mechanotransducer channel in mammalian cochlear hair cells. The Journal of Neuroscience. 26 (43), 10992-11000 (2006).
  8. Geleoc, G. S., Lennan, G. W., Richardson, G. P., Kros, C. J. A quantitative comparison of mechanoelectrical transduction in vestibular and auditory hair cells of neonatal mice. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 264 (1381), 611-621 (1997).
  9. Kros, C. J., Rusch, A., Richardson, G. P. Mechano-electrical transducer currents in hair cells of the cultured neonatal mouse cochlea. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 249 (1325), 185-193 (1992).
  10. Ohmori, H. Mechano-electrical transduction currents in isolated vestibular hair cells of the chick. The Journal of Physiology. 359, 189-217 (1985).
  11. Gale, J. E., Marcotti, W., Kennedy, H. J., Kros, C. J., Richardson, G. P. FM1-43 dye behaves as a permeant blocker of the hair-cell mechanotransducer channel. The Journal of Neuroscience. 21 (18), 7013-7025 (2001).
  12. Lelli, A., Asai, Y., Forge, A., Holt, J. R., Geleoc, G. S. Tonotopic gradient in the developmental acquisition of sensory transduction in outer hair cells of the mouse cochlea. Journal of Neurophysiology. 101 (6), 2961-2973 (2009).
  13. Alharazneh, A., et al. Functional hair cell mechanotransducer channels are required for aminoglycoside ototoxicity. PLoS One. 6 (7), 22347(2011).
  14. Marcotti, W., van Netten, S. M., Kros, C. J. The aminoglycoside antibiotic dihydrostreptomycin rapidly enters mouse outer hair cells through the mechano-electrical transducer channels. The Journal of Physiology. 567, Pt 2 505-521 (2005).
  15. Corns, L. F., Jeng, J. Y., Richardson, G. P., Kros, C. J., Marcotti, W. TMC2 Modifies Permeation Properties of the Mechanoelectrical Transducer Channel in Early Postnatal Mouse Cochlear Outer Hair Cells. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 326(2017).
  16. Kawashima, Y., Kurima, K., Pan, B., Griffith, A. J., Holt, J. R. Transmembrane channel-like (TMC) genes are required for auditory and vestibular mechanosensation. Pflügers Archiv: European Journal of Physiology. 467 (1), 85-94 (2015).
  17. Kim, K. X., Fettiplace, R. Developmental changes in the cochlear hair cell mechanotransducer channel and their regulation by transmembrane channel-like proteins. The Journal of General Physiology. 141 (1), 141-148 (2013).
  18. Kurima, K., et al. TMC1 and TMC2 Localize at the Site of Mechanotransduction in Mammalian Inner Ear Hair Cell Stereocilia. Cell Reports. 12 (10), 1606-1617 (2015).
  19. Pan, B., et al. TMC1 and TMC2 are components of the mechanotransduction channel in hair cells of the mammalian inner ear. Neuron. 79 (3), 504-515 (2013).
  20. Kawashima, Y., et al. Mechanotransduction in mouse inner ear hair cells requires transmembrane channel-like genes. Journal of Clinical Investigation. 121 (12), 4796-4809 (2011).
  21. Beurg, M., Goldring, A. C., Fettiplace, R. The effects of Tmc1 Beethoven mutation on mechanotransducer channel function in cochlear hair cells. The Journal of General Physiology. 146 (3), 233-243 (2015).
  22. Corns, L. F., Johnson, S. L., Kros, C. J., Marcotti, W. Tmc1 Point Mutation Affects Ca2+ Sensitivity and Block by Dihydrostreptomycin of the Mechanoelectrical Transducer Current of Mouse Outer Hair Cells. The Journal of Neuroscience. 36 (2), 336-349 (2016).
  23. Beurg, M., Fettiplace, R., Nam, J. H., Ricci, A. J. Localization of inner hair cell mechanotransducer channels using high-speed calcium imaging. Nature Neuroscience. 12 (5), 553-558 (2009).
  24. Maeda, R., et al. Tip-link protein protocadherin 15 interacts with transmembrane channel-like proteins TMC1 and TMC2. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (35), 12907-12912 (2014).
  25. Assad, J. A., Shepherd, G. M., Corey, D. P. Tip-link integrity and mechanical transduction in vertebrate hair cells. Neuron. 7 (6), 985-994 (1991).
  26. Medrano-Soto, A., et al. Bioinformatic characterization of the Anoctamin Superfamily of Ca2+-activated ion channels and lipid scramblases. PLoS One. 13 (3), 0192851(2018).
  27. Ballesteros, A., Fenollar-Ferrer, C., Swartz, K. J. Structural relationship between the putative hair cell mechanotransduction channel TMC1 and TMEM16 proteins. Elife. 7, (2018).
  28. Pan, B., et al. TMC1 Forms the Pore of Mechanosensory Transduction Channels in Vertebrate Inner Ear Hair Cells. Neuron. 99 (4), 736-753 (2018).
  29. Kitajiri, S., Makishima, T., Friedman, T. B., Griffith, A. J. A novel mutation at the DFNA36 hearing loss locus reveals a critical function and potential genotype-phenotype correlation for amino acid-572 of TMC1. Clinical Genetics. 71 (2), 148-152 (2007).
  30. Makishima, T., Kurima, K., Brewer, C. C., Griffith, A. J. Early onset and rapid progression of dominant nonsyndromic DFNA36 hearing loss. Otology & Neurotology. 25 (5), 714-719 (2004).
  31. Noguchi, Y., et al. Multiple quantitative trait loci modify cochlear hair cell degeneration in the Beethoven (Tmc1Bth) mouse model of progressive hearing loss DFNA36. Genetics. 173 (4), 2111-2119 (2006).
  32. Vreugde, S., et al. Beethoven, a mouse model for dominant, progressive hearing loss DFNA36. Nature Genetics. 30 (3), 257-258 (2002).
  33. Hulstrom, D., Svensjo, E. Intravital and electron microscopic study of bradykinin-induced vascular permeability changes using FITC-dextran as a tracer. The Journal of Pathology. 129 (3), 125-133 (1979).
  34. Mayhan, W. G., Heistad, D. D. Permeability of blood-brain barrier to various sized molecules. American Journal of Physiology. 248 (5), Pt 2 712-718 (1985).
  35. Makarow, M. Endocytosis in Saccharomyces cerevisiae: internalization of alpha-amylase and fluorescent dextran into cells. The EMBO Journal. 4 (7), 1861-1866 (1985).
  36. Clayton, E. L., Cousin, M. A. Quantitative monitoring of activity-dependent bulk endocytosis of synaptic vesicle membrane by fluorescent dextran imaging. Journal of Neuroscience Methods. 185 (1), 76-81 (2009).
  37. Allman, B. L., Keniston, L. P., Meredith, M. A. Adult deafness induces somatosensory conversion of ferret auditory cortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (14), 5925-5930 (2009).
  38. Warr, W. B., Boche, J. B., Neely, S. T. Efferent innervation of the inner hair cell region: origins and terminations of two lateral olivocochlear systems. Hearing Research. 108 (1-2), 89-111 (1997).
  39. Hu, B. H., Zheng, G. L. Membrane disruption: an early event of hair cell apoptosis induced by exposure to intense noise. Brain Research. 1239, 107-118 (2008).
  40. Zheng, G., Hu, B. H. Cell-cell junctions: a target of acoustic overstimulation in the sensory epithelium of the cochlea. BMC Neuroscience. 13, 71(2012).
  41. Beurg, M., Nam, J. H., Chen, Q., Fettiplace, R. Calcium balance and mechanotransduction in rat cochlear hair cells. Journal of Neurophysiology. 104 (1), 18-34 (2010).
  42. Johnson, S. L., Beurg, M., Marcotti, W., Fettiplace, R. Prestin-driven cochlear amplification is not limited by the outer hair cell membrane time constant. Neuron. 70 (6), 1143-1154 (2011).
  43. Korobchevskaya, K., Lagerholm, B. C., Colin-York, H., Fritzsche, M. Exploring the Potential of Airyscan Microscopy for Live Cell Imaging. Photonics. 4 (3), (2017).
  44. Gil-Loyzaga, P., Brownell, W. E. Wheat germ agglutinin and Helix pomatia agglutinin lectin binding on cochlear hair cells. Hearing Research. 34 (2), 149-155 (1988).
  45. Santi, P. A., Anderson, C. B. Alcian blue staining of cochlear hair cell stereocilia and other cochlear tissues. Hearing Research. 23 (2), 153-160 (1986).
  46. Slepecky, N., Chamberlain, S. C. The cell coat of inner ear sensory and supporting cells as demonstrated by ruthenium red. Hearing Research. 17 (3), 281-288 (1985).
  47. Rusch, A., Kros, C. J., Richardson, G. P. Block by amiloride and its derivatives of mechano-electrical transduction in outer hair cells of mouse cochlear cultures. The Journal of Physiology. 474 (1), 75-86 (1994).
  48. Zhao, Y., Yamoah, E. N., Gillespie, P. G. Regeneration of broken tip links and restoration of mechanical transduction in hair cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (26), 15469-15474 (1996).
  49. Indzhykulian, A. A., et al. Molecular remodeling of tip links underlies mechanosensory regeneration in auditory hair cells. PLoS Biol. 11 (6), 1001583(2013).
  50. Koivusalo, M., et al. Amiloride inhibits macropinocytosis by lowering submembranous pH and preventing Rac1 and Cdc42 signaling. Journal of Cell Biology. 188 (4), 547-563 (2010).
  51. West, M. A., Bretscher, M. S., Watts, C. Distinct endocytotic pathways in epidermal growth factor-stimulated human carcinoma A431 cells. Journal of Cell Biology. 109 (6), Pt 1 2731-2739 (1989).
  52. Park, S., et al. tmie Is required for gentamicin uptake by the hair cells of mice. Comp Med. 63 (2), 136-142 (2013).
  53. Meyers, J. R., et al. Lighting up the senses: FM1-43 loading of sensory cells through nonselective ion channels. The Journal of Neuroscience. 23 (10), 4054-4065 (2003).
  54. Waguespack, J., Salles, F. T., Kachar, B., Ricci, A. J. Stepwise morphological and functional maturation of mechanotransduction in rat outer hair cells. The Journal of Neuroscience. 27 (50), 13890-13902 (2007).
  55. Beurg, M., et al. Variable number of TMC1-dependent mechanotransducer channels underlie tonotopic conductance gradients in the cochlea. Nature Communications. 9 (1), 2185(2018).
  56. Montgomery, S. C., Cox, B. C. Whole Mount Dissection and Immunofluorescence of the Adult Mouse Cochlea. Journal of Visualized Experiments. (107), e53561(2016).
  57. Landegger, L. D., Dilwali, S., Stankovic, K. M. Neonatal Murine Cochlear Explant Technique as an In Vitro Screening Tool in Hearing Research. Journal of Visualized Experiments. (124), e55704(2017).
  58. May-Simera, H. Evaluation of Planar-Cell-Polarity Phenotypes in Ciliopathy Mouse Mutant Cochlea. Journal of Visualized Experiments. (108), e53559(2016).
  59. Ogier, J. M., Burt, R. A., Drury, H. R., Lim, R., Nayagam, B. A. Organotypic Culture of Neonatal Murine Inner Ear Explants. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 170(2019).
  60. Granath, K. A. Solution properties of branched dextrans. Journal of Colloid Science. 13 (4), 20(1958).
  61. Molecular Probes, I.D.T. Product information on Dextran Conjugates. , (2006).
  62. Korobchevskaya, K., Lagerholm, B. C., Colin-York, H., Fritzsche, M. Exploring the Potential of Airyscan Microscopy for Live Cell Imaging. Photonics. 4 (3), 41(2017).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

K l H cre Al mMekanotransd ksiyon KanalTexas Red DekstranCorti OrganKonfokal MikroskopiFloresan DekstranStereosilya EtiketlemeEndositoz Yolu

İlgili makaleler