Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

İnsan Organotipik Kardiyak Dilimlerinin Çift Voltaj ve Kalsiyum Optik Haritalaması ile Preklinik Kardiyak Elektrofizyoloji Değerlendirmesi

10.3K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/60781

⸱

16 Haziran 2020

 ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, The George Washington University

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Bu protokol, preklinik ilaç testi için insan kardiyak dilimlerinin kesilmesi ve kültüre edilmesi prosedürünü açıklar ve bu dilimlerden aynı anda transmembran voltajı ve hücre içi kalsiyum sinyallerini kaydetmek için optik haritalamanın kullanımını ayrıntılarıyla açıklar.

Özet

İnsan kardiyak dilim preparatları son zamanlarda hayvan ve klinik çalışmalar arasındaki boşluğu köprü için insan fizyolojisi çalışmaları ve tedavi testleri için bir platform olarak geliştirilmiştir. Çok sayıda hayvan ve hücre modelleri ilaçların etkilerini incelemek için kullanılmıştır, ancak bu tepkiler genellikle insanlarda farklıdır. İnsan kardiyak dilimleri doğrudan canlı insan kalplerinden türetilmiştir bu ilaç testi için bir avantaj sunuyoruz. Korunmuş çok hücreli yapılara sahip olmanın yanı sıra, hücre-hücre kaplini ve hücre dışı matriks ortamları, insan kardiyak doku dilimleri doğrudan yetişkin insan kardiyak fizyolojisi üzerinde sayısız ilaçların etkisini test etmek için kullanılabilir. Bu modeli tüm kalpler veya takozlar gibi diğer kalp preparatlarından ayıran şey, dilimlerin uzun vadeli kültüre maruz kalınmasıdır. Bu nedenle, kardiyak dilimleri ilaçların akut yanı sıra kronik etkileri incelenmesi için izin verir. Ayrıca, tek bir kalpten birkaç yüz bin dilim toplamak için yeteneği bu aynı anda diğer ilaçlar ile değişen konsantrasyonlarda ve kombinasyonları çeşitli ilaçlar test etmek için yüksek iş yapma modeli yapar. Dilimler kalbin herhangi bir bölgesinden hazırlanabilir. Bu protokolde, sol ventrikül serbest duvardan doku küpleri izole ve yüksek hassasiyetli titreşimli mikrotom kullanarak dilimler halinde kesitler halinde keserek sol ventrikül dilimleri hazırlanması nı açıklıyoruz. Bu dilimler daha sonra ya temel kardiyak elektrofizyolojik fonksiyonu ölçmek için akut deneylere tabi tutulabilir ya da kronik ilaç çalışmaları için kültürlü. Bu protokol aynı zamanda, araştırılan ilaçların etkilerini belirlemek için transmembran potansiyellerinin ve hücre içi kalsiyum dinamiğinin eşzamanlı kayıtları için kardiyak dilimlerin çift optik haritalamasını da açıklamaktadır.

Giriş

Hayvan modelleri insan fizyolojisi ve patofizyolojisi altta yatan mekanizmaları anlamak için kullanılan değerli bir araç olmuştur, hem de çeşitli hastalıkların tedavisinde tedavilerin ön test için bir platform1. Büyük adımlar bu hayvan çalışmaları 2 dayalı biyomedikal araştırma2alanında alınmıştır. Ancak, fareler, sıçanlar, kobaylar, tavşanlar, koyun, domuzlar ve köpekler3,4dahil olmak üzere insan ve hayvan fizyolojisi arasında önemli türler arası farklılıklar vardır. Sonuç olarak, çok sayıda ilaç olmuştur, gen, ve hayvan test aşamasında umut gösterdi hücre tedavileri ama klinik çalışmalarda sonuçlara kadar yaşamak için başarısızoldu 5. Bu boşluğu kapatmak için, izole kardiyak miyositler ve insan kaynaklı pluripotent kök hücreler (iPSCs) çeşitli ilaçlar ve hastalıklara insan fizyolojisi yanıtını test etmek için model olarak geliştirilmiştir6. Kök hücre kaynaklı kardiyomiyositler yaygın kalp bir vekil olarak organ-on-a-chip sistemlerinde kullanılmaktadır6,7,8. Ancak, iPSC kaynaklı kardiyomiyositlerin (iPSC-CMs) yararlılığı göreceli olarak olgunlaşmamış fenotipve kardiyomiyosit alt popülasyonunun temsil eksikliği ile engellenir; olgun miyokardiyum fibroblastlar, nöronlar, makrofajlar ve endotel hücreleri gibi birkaç birlikte hücre tiplerinden oluşan karmaşık bir yapıdır. Diğer taraftan, izole insan kardiyomiyositleri elektriksel olarak olgundur ve farklı kardiyomiyosit alt popülasyonları99. Yine de, bu miyositler genellikle hücre-hücre kaplin eksikliği nedeniyle değişmiş eylem potansiyeli morfolojileri sergilemek, hızlı de-farklılaşma, ve in vitro proaritmik davranış oluşumu10,11. Bazı sınırlamalar iPSC-CM'ler ve kardiyak miyositlerin 3D hücre kültürü modelleri ile ele alınmıştır. Küresel balıklar, hidrojel iskelesi kapsüllü 3D kültürler, mühendislik kalp dokuları (EHTs) ve kalp-on-a-chip sistemleri içeren bu modeller, kardiyomiyositler gibi birden fazla kardiyak hücre popülasyonları kullanın, fibroblastlar, ve endotel hücreleri. Ya kendi kendine monte ya da 3D yapılar oluşturmak için bir iskele boyunca monte, ve hatta bazı miyokardin karmaşık anizotropik doğasını çoğaltmak. Bu modellerin olgun fenotip, kontraktil özellikleri ve kardiyak dokuya benzer moleküler profillere sahip olduğu bildirilmiştir. Kalp-on-a-chip sistemi de ilaç testi ve hastalık modellerinde sistemik etkileri çalışma sağlar. Ancak, in vitro hücre tabanlı modeller yerli ekstrasellüler matris eksikliği ve bu nedenle doğru organ düzeyinde elektrofizyoloji taklit edemez. Buna karşılık, insan kardiyak dilimleri, bozulmamış bir hücre dışı matris ve yerli hücre-hücre temasları var, daha doğru insan miyokardiyum aritmiojenik özelliklerini incelemek için yararlı hale.

Araştırmacılar akut ve kronik ilaç testi için fizyolojik bir preklinik platform olarak insan kardiyak organotipik dilimler geliştirdik ve kardiyak elektrofizyoloji ve kalp hastalığı ilerlemesi12çalışma,13,14,15,16,17,18,19. iPSC türetilmiş kardiyomiyositler ile karşılaştırıldığında, insan kardiyak dilimleri daha sadakatle olgun bir kardiyomiyosit fenotip ile yetişkin insan kardiyak elektrofizyoloji çoğaltmak. İzole insan kardiyomiyositleri ile karşılaştırıldığında, kardiyak dilimler iyi korunmuş hücre-hücre kaplini ve doğal hücre içi ve hücre dışı ortamların içsel varlığı nedeniyle fizyolojik etki potansiyel süreleri sergilerler.

Bu protokol, tüm donör kalplerden insan kardiyak dilimleri üretme, optik haritalama yoluyla kardiyak elektrofizyoloji parametrelerini test etmek için akut (yani, saatler süren) ve kronik (yani günler boyu) çalışmalar yapma sürecini tanımlar. Bu protokol sadece sol ventrikül (LV) dokusunun kullanımını açıklarken, başarıyla kalbin diğer bölgelerinyanı sıra fareler, sıçanlar, kobay gibi diğer türler için uygulanmıştır ve domuz14,20,21,22. Laboratuvarımız son 5 yıldır transplantasyon için reddedilen tüm insan donör kalplerini kullanmektedir, ancak dokular küpler halinde kesitlenme yeteneğine sahip olduğu sürece, alternatif yollarla elde edilen herhangi bir donör kalp örnek dokuları (örneğin, sol ventriküler yardımcı cihaz [LVAD] implantasyonları, biyopsiler, miektomies) üzerinde aynı işlemlerin yapılması mümkündür. Optik haritalama, yüksek uzamsal (100 x 100 piksel) ve zamansal (>1.000 kare/s) çözünürlüğe sahip optik eylem potansiyellerini ve kalsiyum geçicilerini eş zamanlı olarak haritalama kapasitesi nedeniyle bu çalışmada analiz için kullanılmaktadır. Çoklu elektrot dizileri (MEA) veya mikroelektrotlar gibi alternatif yöntemler de kullanılabilir, ancak bu teknikler nispeten düşük uzamsal çözünürlükleri ile sınırlıdır. Ayrıca, MEAs hücre kültürleri ile kullanılmak üzere tasarlanmıştır, ve keskin mikroelektrotlar daha kolay tüm kalpleri veya büyük doku takozları ile kullanılmak üzere yönetilir.

Makalenin amacı, daha fazla araştırmacının kardiyak elektrofizyoloji çalışmaları için insan kalp dokularını kullanmasını sağlamaktır. Bu makalede açıklanan teknoloji nispeten basit ve kısa vadeli çalışmalar için yararlı olduğu unutulmamalıdır (gün birkaç saat sırayla). Uzun vadeli çalışmalar için daha fizyolojik biyomimetik kültür (hafta sırasına göre) tartışıldı ve diğer çalışmaların bir dizi tarafından açıklanan12,18,23. Elektriksel stimülasyon, mekanik yükleme ve doku germe in vitro doku remodelling başlangıcını sınırlamak yardımcı olabilir avantajlı klima mekanizmalarıvardır 12,18,23.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Açıklanan tüm yöntemler, insan refahı için tüm kurumsal, ulusal ve uluslararası kurallara uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Araştırma, George Washington Üniversitesi'ndeki Kurum İnceleme Kurulu (IRB) tarafından onaylandı.

NOT: Donör insan kalpleri George Washington Üniversitesi IRB onayı ile deidentified atılmış doku olarak Washington Bölgesel Transplant Topluluk elde edilmiştir. Ekrende kalpler kalp buz gibi kardiyopleji çözeltisi ile kalp kızartılarak kardiyetik olarak tutuklanur (bu süreçte kan kalpten temizlenir) ve standart organ nakli koşulları altında laboratuvara aktarılır.

1. Çözümlerin hazırlanması

  1. Her kalp için 4 L kardiyoplegic solüsyon yapın (110 mM NaCl, 16 mM KCl, 16 mM MgCl2, 10 mM NaHCO3, 1,2 mM CaCl2;pH = 7.4). 4 °C'de 3 L, -20 °C'de kalan 1 L'yi saklayın.
    NOT: Bu çözüm birkaç gün önceden yapılabilir.
  2. Tyrode'un dilimleme çözeltisinin her biri için taze olarak 1 L hazırlayın (140 mM NaCl, 6 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1,8 mM CaCl2, 10 mM glukoz, 10 mM HEPES, 10 mM 2,3-butanedione monoxime [BDM]; pH = 7.4) ve Tyrode kurtarma çözeltisi (140 mM NaCl, 4.5 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1.8 mM CaCl2, 10 mM glikoz, 10 mM BDM; pH = 7.4).
    NOT: Hem dilimleme hem de geri kazanım çözeltileri deney günü yapılmalı ve 4 °C'de saklanmalıdır.
  3. Floresan boyaların stok çözümlerini hazırlayın. Voltaj duyarlı boya RH237'yi 1,25 mg/mL'de dimetil sülfoksitte (DMSO) yeniden kurun ve 4 °C'de 30 μL aliquots'ta saklayın. DMSO'da 1 mg/mL'de Rhod-2AM kalsiyum indikatörü yeniden oluşturul. -20 °C'de 30 μL aliquots'ta saklayın.
    NOT: Di-4-ANEPPS (DMSO'da 1.25 mg/mL stok çözeltisi) sadece transmembran potansiyelinin tek kameralı görüntülemesi için deneylerde kullanılabilir.
    1. Deney başlamadan önce, en az 10 dakika ultrason sonicator kullanarak boyalar sonicate ve kurtarma çözeltisi 1 mL floresan boyalar her aliquot seyreltmek. Kurtarma çözeltisinde seyreltmeden önce 1:1 oranında Rhod-2AM'a Pluronik F-127(Malzeme Tablosu)ekleyin.
  4. DMSO'da 2 mg/mL çözeltide uyarma-kontraksiyon uncoupler blebbistatin bir stok çözeltisi hazırlayın. -20 °C'de aliquots'ta saklayın. Optik haritalama deneyleri sırasında, bibbistatin stok çözeltisini Tyrode'un kurtarma çözeltisinde 5−10 μM'lik bir çalışma konsantrasyonuna seyreltin.
  5. Orta 199'u %2 penisilin-streptomisin, 1x insülin-transferrin-selenyum (ITS) sıvı ortam takviyesi ve 10 mM BDM ile tamamlayarak taze kültür ortamı yaratın. Ortamı 0,2 μm steril filtre kullanarak filtreleyin.
    NOT: Farmakolojik pertürbasyon çalışmaları için ilaçlar doğrudan kültür ortamına eklenebilir. Kültür ortamı 37 °C'de saklanabilir.
  6. Distile suda düşük erime noktası agarose eriterek ve tamamen çözülene kadar bir mikrodalga karışımı ısıtma tarafından doku montaj için% 4 agarose jel olun. Agarose'u petri kabında 5 mm kalınlığında tedavi edin ve 4 °C'de saklayın.

2. Ekipman kurulumu

  1. Titreşimli mikrotom kurulumu
    1. Her deneyden önce titreşen mikrotomu kalibre edin.
      1. Yüksek hassasiyetli titreşimli titreşimli mikrotomu(Malzeme Tablosu)kullanarak, seramik kesme bıçağını tutucuya yükleyin ve titreşimli mikrotomla sağlanan kalibrasyon cihazını takın. Menüden bıçak ayarlama seçeneğini seçin ve bıçak türü için seramik seçin.
      2. Titreşim seçeneğini seçin, Z ekseni değerini kontrol edin. Bu değer <1 μm ise kalibrasyon menüsünden çıkın. Değilse, titreşimli başlığın üst kısmına bağlı kalibrasyon vidasını hassas bir şekilde ayarlayın ve titreşim seçeneğini seçin. Z eksenini <1 μm olarak ayarlamak için gereken süreyi tekrarlayın.
    2. Vibratom ayarlarını 400 μm kesme kalınlığına, atriyal doku için 0,02 mm/s ileri hıza ve ventriküler doku için 0,04 mm/s ileri hıza, 2 mm yatay titreşim genliğine ve 80 Hz titreşim frekansına ayarlayın.
      NOT: Dilimin kesme yüzeylerinde hücre hasarını telafi etmek için önerilen kalınlık 400 m iken, daha ince dilimler de hazırlanabilir. Oksijen difüzyon sınırının 150 μm civarında olduğu düşünülürse, 300 μm civarındaki dilimler genellikle 14 ,17,,1817,24olarak kullanılır.
    3. Titreşimli mikrotomun banyosunu 4 °C'de dilimleme çözeltisi ile doldurun ve banyonun dışını buzla çevreleyerek sıcaklığı koruyun, dilimleme protokolü boyunca gerektiği gibi doldurulun. Dilimleme sırasında %100 oksijen köpürterek banyodaki dilimleme çözeltisini sürekli olarak oksijenlendirin.
    4. Gerektiğinde 100 μm'lik naylon kafes hücresüzler ve kafesli yıkayıçlarla ikinci bir çanak ayarlayın (dilim başına bir hücresüzsüz). Bu kabı geri kazanım çözeltisi ile doldurun ve oda sıcaklığında %100 oksijen (RT) ile köpürerek oksijenverin.
      NOT: Bu çözüm deneme sırasında RT'de tutulur.
  2. Optik haritalama kurulumu
    NOT: Optik haritalama sisteminin daha ayrıntılı bir açıklaması önceki yayınlarda16,25,26olarak verilmektedir.
    1. Bir perfüzyon sistemine altında polidimethylsiloxane (PDMS) jel tabakası ile bir doku banyosu takın (dilimleri pinlemek için). 37 °C'de geri kazanım çözeltisinin 1 L'sini dağıtın ve perfüzyon sistemi üzerinden %100 oksijen verin, sıcaklık ve berrak banyo perfusat birikimini koruyacak kadar hızlı bir akış hızında.
    2. İki CMOS kameranın(Malzeme Tablosu)odak noktasını ve hizalanmasını bir hedef kullanarak ayarlayın.
      NOT: Hizalama hakkında daha fazla bilgi önceki çalışmalarda bulunabilir26.
    3. Voltaj duyarlı ve kalsiyum gösterge boyaları aynı anda heyecanlandırmak için dalga boyu 520 ± 5 nm olan yeşil led ışık kaynağı kullanın.
      NOT: Uyarma ışık kaynağı optik haritalama sisteminin uyarma filtre küpüne takılır ve episentrik aydınlatma için 550 nm dikroik aynadan yansıtılır. Yayılan ışık 1x lens tarafından toplanır ve sırasıyla 690 ± 50 nm ve 590 ± 33 nm filtreler tarafından süzülmeden önce gerilim ve kalsiyum bileşenlerine 630 nm'de ikinci bir dikroik ayna ile bölünür ve iki kamera tarafından kaydedilir.

3. Dilimleme protokolü

  1. Doku diseksiyonu ve deneyiçin hazır olduğunuzda, dondurulmuş ve sıvı kardiyopleji karıştırarak buz gibi kardiyopleji bir banyo hazırlamak. Dilimleme için doku toplama kadar kardiyopleji banyosunda kalp batık tutun (Şekil 1A).
  2. Tutkal vibratom metal doku tutucuları arkasına premade agarose jel.
  3. Sol ventrikül serbest duvar belirleyin ve soğuk kardiyoplejik çözelti doku 1 cm3 küp kesti. Daha sonra, hızlı bir şekilde endokardiyal yüzeyler yukarı bakacak şekilde metal doku tutucuları üzerine doku blokları monte ve topikal deri yapıştırıcı kullanarak agarose jel onları takın(Şekil 1B).
    NOT: Seçili doku bölgesi, dilimlerde delikleri önlemek için büyük kan damarlarından uzak olmalıdır. Kesit düzlemi endokardiyal tabakadaki(Şekil 1E)lif oryantasyonuna yaklaşık olarak paraleldir ve kesit düzlemi LV duvarının daha derin bir katmanındaki dönme aisotropi nedeniyle hafif bir açıda olabilir. İş bünyesini artırmak için, aynı tutucuya yan yana iki doku bloğu monte edilebilir.
  4. Metal tutucuları buz gibi oksijenli dilimleme çözeltisi ile dolu vibratom banyosuna aktarın. Doku küplerinin tamamen batırılmış olduğundan emin olun.
  5. Bıçağı dokunun ön kenarına taşıyın ve önceden ayarlanmış parametrelerle dilimleme başlamak için vibratom açın. Bıçak pürüzsüz endokardiyal doku içine trabeculae ötesine ulaşana kadar ilk birkaç dilim atın.
  6. Her dilim kesildikten sonra, dilimi dikkatlice Tyrode'un RT'deki iyileşme solüsyonunun oksijenli(%100O2)banyosuna aktarın. Dilimleri en az 20 dakika kurtarma çözümünde saklayın.
    NOT: Dilimler bu koşullar altında, zararlı elektrofizyolojik etkiler olmaksızın 3−4 saate kadar banyoda tutulabilir.

4. Statik koşullarda dilim leme

NOT: Kontaminasyon olasılığını en aza indirmek için, her transfer adımından önce bir boncuk sterilizatörü kullanarak büşnatları sterilize edin.

  1. Kültüre hazır olduğunuzda, her dilimi steril fosfat tamponlu salin (PBS) ile dolu 6 kuyulu bir plakanın ayrı kuyularına dikkatlice aktarın. Yavaşça kurtarma çözeltisi dilimleri durulamak için iyi plaka kaya.
    NOT: Bu noktadan itibaren, dilimler sadece Bir BSL2 laminar akış kültür başlık maruz olmalı ve steril çalgılar doku işlemek için kullanılmalıdır.
  2. Dilimleri taze PBS kuyularına aktarın ve dilimleri iyice durulayın ve kültür için sterilize edin. Bu yıkama adım 3x dilimleri kurtarma çözeltisi tam kaldırılmasını sağlamak için gerçekleştirin.
  3. Dilimleri, önceden ısıtılmış (37 °C) kültür ortamının 3 mL'si (uyuşturuculu veya uyuşturucusuz, Şekil 1D)ile dolu 6 kuyulu bir plakanın tek tek kuyularına aktarın. Plakaları 20 rpm'de nemlendirilmiş bir kuluçka makinesinde 37 °C'de %30 O2 ve %5 CO2ile orbital shaker üzerine yerleştirin. Aspire ve kültür ortamı her 48 saat değiştirin.

5. Fonksiyonel karakterizasyon―optik haritalama

  1. Dilimlemeden hemen sonra veya kültürden sonra yapılan optik haritalama çalışmaları için, tyrode'un kurtarma çözümünde %100 O2 ile 37 °C'de ilgi dilimini perfüzyon sisteminin doku banyosuna dikkatlice aktarın ve en az streç uygularken dört köşeyi PDMS jel katmanına sabitleyin (yani dilimin akış koşullarında kolayca hareket etmesini engellemeye yetecek kadar). Yaklaşık 10 dakika boyunca dolaşan kurtarma çözeltisi ile bu banyoda dilimleri dinlenmek için izin verin.
  2. Redüpara çözeltisini içeren rezervuara seyreltilmiş blebbistatin 0,3−0,5 mL ekleyin. Yaklaşık 10 dakika blebbistatin ile dilim kuluçkaya bırakın.
  3. 37 °C'de 1 mL geri kazanım çözeltisi içinde stok gerilimine duyarlı boya RH237'nin 30 μL'sini yeniden oluşturun. Pompaları kapatın ve 30 s'lik bir süre boyunca dilimin yüzeyine 0,2−0,3 mL'lik boyama çözeltisini yavaşça yükleyin. Dilimin 90 s'ye kadar bir süre boyunca boyayla boyanın içinde kuluçkaya yatmasını bekleyin, sonra fazla boyanın yıkanmasını sağlamak için pompaları tekrar açın.
    NOT: Boyayı dilimin her yerine eşit olarak uygulamak için dikkatli olunmalıdır. Ayrıca, çok yavaş boya uygulaması dilim den uzağa yüzen boya önlemek için çok önemlidir.
  4. Stok kalsiyum göstergesi Rhod-2AM'yi yeniden oluşturmak ve dilime yüklemek için adım 5.3'ü tekrarlayın.
  5. Dilimin lensten uzaklığı ayarlayarak kameraları dilimin üzerine odakla.
  6. Ucu dilimin ortasıyla temas halinde olacak şekilde iki kutuplu platin-iridyum pacing elektrodu yerleştirin ve elektriksel bir tepki çıkarmak için gereken minimum pacing eşiğini belirlemek için genliği artıran pacing uyaranları uygulayın. Önceden belirlenmiş tempo eşiğinin genliğini 1,5 kat 2 ms darbe genişliği süresiyle 1 Hz hızında hızlandırın. Doku diliminin üzerine bir kapak kaydırın.
  7. 520 ± 5 nm LED uyarma ışık kaynağı kullanarak dilimi aydınlatın. Yayılan voltaj ve kalsiyum sinyallerini iki CMOS kamerayla 1.000 kare/s'ye kaydedin.
  8. İyi sinyal kalitesi ve bastırılmış hareket yapıları için kaydı kontrol edin (Şekil 1F). Hareket artık optik sinyallerde eserler üretene kadar 0,1 mL adımda rezervuara daha fazla blebbistatin ekleyin. Sinyal kalitesini artırmak için gerekirse daha fazla boya ekleyin.
    NOT: İyi sinyal kalitesi, kaydedilen optik sinyallerdeki nitel olarak değerlendirilmiş büyük sinyal genliği ve düşük arka plan gürültüsü anlamına gelir.

6. RHYTHM1.2 ile veri işleme

NOT: RHYTHM1.2, tek veya çift kameralı optik haritalama sistemleri tarafından elde edilen optik haritalama verilerini görüntülemek, duruma getirmek ve analiz etmek için kullanılan MATLAB tabanlı bir kullanıcı arabirimidir(Şekil 3). Görüntüleme sistemi ile birlikte kullanılır.

  1. Veri dosyalarını yükleme
    1. Ekrandaki dört ekran penceresinden herhangi birini seçerek ve Dizin seç ve Yükle düğmelerini kullanarak veri dosyalarını RHYTHM1.2'ye yükleyin.
    2. Program çift voltaj ve kalsiyum kayıtları için Kamera 1 veya Kamera 2 verileri seçmek için kullanıcı ister. Voltaj sinyali için Kamera 1'i seçin.
    3. Kalsiyum sinyalini (Kamera 2) bitişik ekran pencerelerinden birine yüklemek için işlemi tekrarlayın.
    4. İki veri kümesi dilimdeki aynı bölgeden kaydedildiğından, iki ekran penceresini bağlamak için seçili iki ekran penceresi arasındaki Çift Veri Bağlantısı onay kutusunu seçin.
      NOT: Alternatif olarak, aynı görüş alanı korunursa, bu fonksiyon araştırılan ilacın elektrofizyolojisinde zaman tepkisini görmek için ayrı zaman noktalarında elde edilen iki görüntüyü birbirine bağlamak için kullanılabilir. Herhangi bir ekran penceresine çift tıklayarak, analiz kolaylığı sağlamak için bir pencerenin en üst düzeye çıkarılabilmesini sağlar.
  2. Sinyal koşullandırma
    1. Veri Analizi seçin | Durum Parametreleri daha fazla analiz öncesinde voltaj ve kalsiyum optik haritalama verileri koşullandırmak için.
    2. Floresan yoğunluk eşiğine (arka plan [BG] eşiği) ve piksel kümeleme derecesine (uyarma [EX] eşiği) dayalı herhangi bir sinyal içermeyen pikselleri kaldırmak için "Arka Planı Kaldır" işlevini kullanın.
    3. Sinyal kalitesini artırmak için "Bin" işlevini kullanarak optik haritalama verilerinin mekansal ortalamasını gerçekleştirin.
    4. "Filter" işleviile bant geçiş filtresi kullanarak optik haritalama verilerini filtreleyin.
    5. Optik haritalama sinyalindeki taban çizgisi sürüklenmesini kaldırmak için "Drift" işlevini kullanın.
    6. "Normalize et" işlevini kullanarak, her pikselden gelen optik haritalama verilerini normalleştirin ve maksimal genlik 1'e sahip olur.
    7. Daha fazla analiz için kalsiyum izlerini tersine çevirmek için "Ters Sinyal" işlevini kullanın.
    8. Görüntü penceresindeki herhangi bir noktadan koşullandırılmış izlemeyi seçmek ve Dalga Formu penceresinde çizmek için Görüntü Lekesi'ni tıklatın. Optimum etki potansiyeli ve kalsiyum geçici izlerini elde etmek için sinyal koşullandırma parametrelerini ayarlayın.
  3. İletim hızı (CV) hesaplama
    NOT: Aktivasyon süresi optik sinyalin maksimum türevi (dF/dtmax)zamanı olarak tanımlanır.
    1. Veri Analizi seçin | Etkinleştirme Haritası ve izleme tek bir eylem potansiyelini kapsayacak şekilde bir Başlangıç Saati ve Bitiş Saati girin. Seçilen bölgenin aktivasyon haritasını(Şekil 1G)görüntülemek için İlgi Bölgesini (YG) hesapla ve seçin.
    2. Veri Analizi seçin | CV Haritası ve benzer şekilde Başlangıç Saati ve Bitiş Saatini seçin. Kuruluma göre pikseller arası çözünürlük değerlerini girin.
      NOT: 1x büyütme sistemleri için pikseller arası çözünürlük X ve Y yönünde 0,1 mm'dir.
    3. Oluştur Vec tuşuna basın. Bir YG seçmek ve o bölgedeki CV vektörlerini görüntülemek için harita düğmesi. Analizde yer alan vektörlerin ortalaması, ortancası, standart sapması ve sayısı ile seçilen bölgedeki CV vektörlerinin ortalama yayılma açısı hesaplanır ve İstatistik bölümünde görüntülenir.
    4. Belirli bir yayılma yönü boyunca bir çizgi çizmek için Çizgi Çiz düğmesini tıklatın. Bu yöndeki tüm CV vektörleri seçilecektir. İstatistikler bölümünde görüntülenecek istatistikleri hesaplamak için yalnızca seçili CV vektörlerini kullanmak için CV Hesapla'yı tıklatın.
  4. Eylem potansiyeli süresi (APD) ve kalsiyum geçici süresi (CaTD) hesaplaması
    NOT: APD kardiyak elektrofizyolojinin bir diğer temel parametresi. APD eşlemleri, etkinleştirme arasındaki saat farkı ile her optik eylem potansiyelinin belirli bir yüzdesi arasında belirlenerek oluşturulabilir. Aritmi duyarlılığını tahmin etmek için APD heterojenite veya APD uzaması ve kısaltılması kullanılabilir.
    1. RHYTHM1.2'de APD hesaplamak için Veri Analizi | APD/CaT Haritası.
    2. Tam bir eylem potansiyelini kapsayacak şekilde Başlangıç Saati ve Bitiş Saatini seçin. Herhangi bir aykırılığı (örneğin, sırasıyla 0 ve 1.000 ms) kaldırmak için APD/CaTD'nin minimum ve maksimum değerini ayarlayın. APD'yi belirleyecek yüzde repolarizasyonunu girin, örneğin APD 80 /CaTD80 için 0,8 veya APD50/CaTD50için 0,5.50
    3. YG seçmek ve APD eşlemi oluşturmak için Bölgesel APD Calc'yi tıklatın. Analizde yer alan piksellerin ortalaması, ortancası, standart sapması ve sayısı İstatistikler bölümünde görüntülenir.
  5. Yükselme süresi
    NOT: Yükselme süresi, gerilim ve kalsiyum geçici izlerinin optik sinyallerinden ölçülebilen başka bir elektrofizyolojik parametredir. Bir eylem potansiyelini tetiklemek için depolarize iyon kanalları için ne kadar sürer, ya da sarcoplasmic retikulum gelen sitoplazma içine salınan kalsiyum için ne kadar sürer için bir tahmin sağlar. Optik yükselme süresi mikroelektrotlarla ölçülen yükselme süreleri için mükemmel bir alternatif değildir ve depolarizasyondaki değişikliklere karşı hassas olmayabilir, çünkü optik etki potansiyelleri birçok hücrenin transmembran potansiyelinin ortalamasıdır. Sistemin mekansal ve zamansal çözünürlüğü optik yükselme süresi değerlerini de etkileyebilir. Ancak, yine depolarizasyon27büyük değişiklikleri tahmin etmek için kullanılabilir.
    1. Artış süresini belirlemek için Veri Analizi | Yükselme Zamanı.
    2. Tek bir eylem potansiyelinin veya kalsiyum geçicinin yukarı vuruşunu seçmek için Başlangıç Zamanı ve Bitiş Saati'ni seçin. Başlat ve Bitiş% değerlerini girin (genellikle gürültülü olmayan sinyaller için %10-90 önerilir), bu da kullanıcının gürültülü sinyaller de dahil olmadan sinyalin yalnızca bölümlerini seçmesine olanak tanır.
    3. YG'yi seçmek ve artış zamanının analizinde yer alan piksellerin ortalamasını, ortancasını, standart sapmasını ve sayısını belirlemek için Hesapla'yı tıklatın.
  6. Kalsiyum bozunumu
    NOT: Kalsiyum izlerinde, kalsiyum geçici çürümesinin zaman sabiti belirlenebilir. Bu sitoplazmadan kalsiyum iyonlarının sitoplazmadan sr geri kaldırılması değişikliklerin analizi için izin verir.
    1. Veri Analizi seçin | Kalsiyum Bozunması ve tek bir kalsiyum geçici sinyalin tüm çürüme kısmını kapsayacak şekilde başlangıç ve bitiş saati girin.
    2. Yatırım Getirisi'ni seçmek ve kalsiyum bozunma süresi sabitinin analizinde yer alan piksellerin ortalamasını, ortancasını, standart sapmasını ve sayısını belirlemek için Tau'yu Hesapla'yı tıklatın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

İnsan organotipik dilimleri yukarıda ayrıntılı ve resimli protokole göre bir donör insan kalbinin sol ventrikül toplanmıştırŞekil 1. Böyle bir çift kamera optik haritalama sistemiŞekil 2dilimleme protokolünün tamamlanmasından sonra yaklaşık 1 saat voltaj ve kalsiyumeşzamanlı optik haritalama gerçekleştirmek için dik görüntüleme yapılandırmasında kullanılmıştır. Veriler RHYTHM1.2 kullanılarak analiz edildi (Şekil 3), daha önce labora...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Burada, kardiyoplegically tutuklanmış insan kalplerinden canlı kardiyak dilimler elde etmek ve transmembran potansiyeli ve hücre içi kalsiyumun çift optik haritalamasını kullanarak dilimleri işlevsel olarak karakterize etmek için adım adım yöntemler salıyoruz. Korunmuş hücre dışı ortam ve yerli hücre-hücre kaplini ile, insan kardiyak dilimleri temel bilimsel keşif ve farmakolojik ajanlar ve gen tedavileri etkinliği ve kardiyotoksisite testi için insan kalbinin doğru bir model olarak kullanılabilir. Teknoloji aynı zamanda...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Teşekkürler

LEDUCQ vakfı (rhythm projesi) ve Amerikan Kalp Derneği Doktora Sonrası Bursu (19POST343370122) tarafından NIH (r21 EB023106, R44 HL139248 ve R01 HL126802 hibe) tarafından finanse edilmektedir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
1 mL BD ŞırıngaThomas Scientific309597
2,3-bütandion monoksimSigma-AldrichB0753
6 kuyulu kültür plakalarıCorning3516
Biyogüvenlik kabiniThermoFisher Scientific1377
BlebbistatinCayman13186
Kabarcık TuzağıRadnoti
Kalsiyum klorürSigma-AldrichC1016
Corning Hücre SüzgeçleriFisher Scientific07-201-432
DMSO DMSOSigma-AldrichD2650'de
1.25 mg / mL'deDi-4-ANEPPSBiotium
Dumont #3c ForsepsGüzel Bilim Araçları11231-20
Emisyon dikroik aynaChromaT630LPXR-UF1
Emisyon filtresi (RH237)ChromaET690/50m
Emisyon Filtresi (Rhod2AM)ChromaET590/33m
Uyarma dikroik aynaChromaT550LPXR-UF1
UyarmaFiltresi ChromaET500/40x
Falcon 50mL Konik Santrifüj TüpleriFisher Scientific14-959-49A
GlikozSigma-AldrichG8270
Isı eşanjörüRadnoti 158821
HEPESSigma-AldrichH3375
İnkübatörThermoFisher Scientific50145502
İnsülin Transferrin Selenyum (ITS)Sigma-AldrichI3146
LED uyarma ışık kaynağıPrizmatixUHP-Mic-LED-520
Magnessium klorür hekzahidratSigma-AldrichM9272
Orta 199ThermoFisher Scientific11150059
Micam Ultima L tipi CMOS kameraScimediaN/A
MinutienPimleri Güzel Bilim Araçları26002-10
Pennisilin-StreptomisinSigma-AldrichP4333
Peristaltik PompaCole ParmerEW-07522-20
Platin pacing teliAlfa Aesar43275
Pluronic F127ThermoFisher ScientificP6867noniyonik, yüzey aktif madde poliol
Potasyum klorürSigma-AldrichP3911
Powerlab verileri satın alma ve stimülatörAD InstrumentsPowerlab 4/26
RH237Biotium61018
Rhod2AMThermoFisher ScientificR1245MP
Rhod-2AMInvitrogen, Carlsbad, CA
Sodyum bikarbonatSigma-AldrichS6014
Sodyum klorürSigma-AldrichS9625
Sterilizatör, kuru boncukSigma-AldrichZ378550
Taş Oksijen DifüzörüWaterwoodB00O0NUVM0
TissueSeal - Histoakril Topikal Cilt YapıştırıcısıgobiomedAESCULAP
UltraPure Düşük Erime Noktalı AgarozThermo Fisher Bilimsel16520100
Ultrason sonikatörüBranson 1800
VibratomCampden Aletleri7000 smz
130149 stok çözeltisi

Kaynaklar

  1. Ericsson, A. C., Crim, M. J., Franklin, C. L. A brief history of animal modeling. Missouri Medicine. 110 (3), 201-205 (2013).
  2. Choudhary, A., Ibdah, J. A. Animal models in today's translational medicine world. Missouri Medicine. 110 (3), 220-222 (2013).
  3. Perlman, R. L. Mouse models of human disease: An evolutionary perspective. Evolution, Medicine, and Public Health. 2016 (1), 170-176 (2016).
  4. Milani-Nejad, N., Janssen, P. M. L. Small and large animal models in cardiac contraction research: advantages and disadvantages. Pharmacology & Therapeutics. 141 (3), 235-249 (2014).
  5. Green, A. R. Why do neuroprotective drugs that are so promising in animals fail in the clinic? An industry perspective. Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology. 29 (11), 1030-1034 (2002).
  6. Shinnawi, R., Gepstein, L. iPCS cell modeling of inherited cardiac arrhythmias. Current Treatment Options in Cardiovascular Medicine. 16 (9), 331(2014).
  7. Morimoto, Y., Mori, S., Sakai, F., Takeuchi, S. Human induced pluripotent stem cell-derived fiber-shaped cardiac tissue on a chip. Lab on a Chip. 16 (12), 2295-2301 (2016).
  8. Wang, G., et al. Modeling the mitochondrial cardiomyopathy of Barth syndrome with induced pluripotent stem cell and heart-on-chip technologies. Nature Medicine. 20 (6), 616-623 (2014).
  9. Ben-Ari, M., et al. Developmental changes in electrophysiological characteristics of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Heart Rhythm. 13 (12), 2379-2387 (2016).
  10. Goversen, B., van der Heyden, M. A. G., van Veen, T. A. B., de Boer, T. P. The immature electrophysiological phenotype of iPSC-CMs still hampers in vitro drug screening: Special focus on IK1. Pharmacology & Therapeutics. 183, 127-136 (2018).
  11. Zhang, Y., et al. Dedifferentiation and proliferation of mammalian cardiomyocytes. PloS One. 5 (9), 12559(2010).
  12. Watson, S. A., et al. Biomimetic electromechanical stimulation to maintain adult myocardial slices in vitro. Nature Communications. 10, 2168(2019).
  13. Fischer, C., et al. Long-term functional and structural preservation of precision-cut human myocardium under continuous electromechanical stimulation in vitro. Nature Communications. 10, 117(2019).
  14. Ou, Q., et al. Physiological Biomimetic Culture System for Pig and Human Heart Slices. Circulation Research. 125 (6), 628-642 (2019).
  15. Qiao, Y., et al. Multiparametric slice culture platform for the investigation of human cardiac tissue physiology. Progress in Biophysics and Molecular Biology 2. 144, 139-150 (2019).
  16. Kang, C., et al. Human Organotypic Cultured Cardiac Slices: New Platform For High Throughput Preclinical Human Trials. Scientific Reports. 6, 28798(2016).
  17. Camelliti, P., et al. Adult human heart slices are a multicellular system suitable for electrophysiological and pharmacological studies. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 51 (3), 390-398 (2011).
  18. Brandenburger, M., et al. Organotypic slice culture from human adult ventricular myocardium. Cardiovascular Research. 93 (1), 50-59 (2012).
  19. Watson, S. A., et al. Preparation of viable adult ventricular myocardial slices from large and small mammals. Nature Protocols. 12 (12), 2623-2639 (2017).
  20. Halbach, M., et al. Ventricular slices of adult mouse hearts - A new multicellular in vitro model for electrophysiological studies. Cellular Physiology and Biochemistry. 18 (1-3), 1-8 (2006).
  21. Wang, K., et al. Cardiac tissue slices: preparation, handling, and successful optical mapping. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 308 (9), 1112-1125 (2015).
  22. Bussek, A., et al. Cardiac tissue slices with prolonged survival for in vitro drug safety screening. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 66 (2), 145-151 (2012).
  23. Watson, S. A., Terracciano, C. M., Perbellini, F. Myocardial Slices: an Intermediate Complexity Platform for Translational Cardiovascular Research. Cardiovascular Drugs and Therapy. 33 (2), 239-244 (2019).
  24. Rouwkema, J., Koopman, B. F. J. M., Blitterswijk, C. A. V., Dhert, W. J. A., Malda, J. Supply of nutrients to cells in engineered tissues. Biotechnology and Genetic Engineering Reviews. 26 (1), 163-178 (2009).
  25. Lang, D., Sulkin, M., Lou, Q., Efimov, I. R. Optical mapping of action potentials and calcium transients in the mouse heart. Journal of Visualized Experiments. (55), e3275(2011).
  26. Brianna, C., et al. Open-Source Multiparametric Optocardiography. Scientific Reports. 9, 721(2019).
  27. George, S. A., et al. Modulating cardiac conduction during metabolic ischemia with perfusate sodium and calcium in guinea pig hearts. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 316 (4), 849-861 (2019).
  28. Kawara, T., et al. Activation delay after premature stimulation in chronically diseased human myocardium relates to the architecture of interstitial fibrosis. Circulation. 104 (25), 3069-3075 (2001).
  29. Qu, Y., et al. Action potential recording and pro-arrhythmia risk analysis in human ventricular trabeculae. Frontiers in Physiology. 5 (8), 1109(2018).
  30. Franz, M. R., Swerdlow, C. D., Liem, L. B., Schaefer, J. Cycle length dependence of human action potential duration in vivo. Effects of single extrastimuli, sudden sustained rate acceleration and deceleration, and different steady-state frequencies. Journal of Clinical Investigation. 82 (3), 972-979 (1988).
  31. Lou, Q., et al. Transmural heterogeneity and remodeling of ventricular excitation- contraction coupling in human heart failure. Circulation. 123 (17), 1881-1890 (2011).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Daha fazla makale keşfet

İnsan Kardiyak DilimleriVoltaj Kalsiyum GörüntülemeDoku Dilimi HazırlamaElektrofizyolojik Değerlendirmeİlaç Test Modeliİletim Hızı AnaliziAksiyon Potansiyeli SüresiKalsiyum Geçişi GörüntülemeSol Ventrikül Dokusu
İnsan Organotipik Kardiyak Dilimlerinin Çift Voltaj ve Kalsiyum Optik Haritalaması ile Preklinik Kardiyak Elektrofizyoloji Değerlendirmesi
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.