Agrobacterium-Rekalsitrant Mısır Inbred Hatları Morfojenik Genler Kullanarak Aracılı Olgunlaşmamış Embriyo Dönüşümü

Dönüşüm, mısırda yabancı gen ekspresyonunu değerlendirmek ve hem araştırma hem de ticari amaçlar için genetiği değiştirilmiş mısır hatları üretmek için temel bir araçtır. Yüksek iş dönüşümlerine erişim, mısır moleküler ve hücresel biyoloji çalışmaları için artan ihtiyacı kolaylaştırabilir^1. Mahsul türlerini genetik olarak dönüştürme yeteneği hem kamu hem de özel laboratuvarlar için hayati önem taşımaktadır. Bu, gen düzenleme mekanizmalarının temel olarak anlaşılmasına ve sürekli büyüyen bir nüfusu desteklemek için küresel ölçekte mahsul gelişimine olanak sağlar.

Mısırdan olgunlaşmamış embriyoların regenerable nasır üretimi için kullanılabileceğinin keşfi 1975²yılında ortaya çıkmıştır. Bu vahiy bu yana, en ölçeklenebilir mısır dönüşüm protokolleri rejenerasyon önce nasır oluşumu ve seçimi gerekli³. Genetik dönüşüm sürecinde, Agrobacterium-enfekte veya biyolistik-bombardımanlı olgunlaşmamış embriyolar embriyojenik nasır indüksiyon için medya kültürlü. İndüklenen calli daha sonra seçici medyada kültürlenir (örneğin, herbisit içeren) böylece sadece dönüştürülmüş nasır parçaları hayatta kalabilir. Bu herbisit dirençli putatif transgenik calli kadar toplu ve bitkiler halinde rejenere edilir. Bu yöntem etkili olmakla birlikte, süreç uzun ve emek yoğun, ve 4^tamamlamakiçin 3 ay yukarı sürebilir. Daha da önemlisi, konvansiyonel mısır dönüşüm protokolleri çok daha büyük bir sınırlama sahip, yani, mısır genotipleri sadece sınırlı sayıda^{dönüştürülebilir 5,6}.

Lowe ve ark.^7,8 daha önce sadece büyük ölçüde dönüşüm sürecinin süresini azalttı ama aynı zamanda dönüştürülebilir genotipler listesini genişletti bir "QuickCorn" dönüşüm yöntemi bildirdi. QuickCorn yöntemi mısır orthologs kullanır(Zm-Bbm ve Zm-Wus2) Arabidopsis transkripsiyon faktörleri BABY BOOM (BBM)⁹ ve WUSCHEL (WUS)¹⁰. Dönüşüm vektör sistemine dahil edildiğinde, bu genler sinerjik olarak embriyojenik büyümeyi uyarmak için çalışır^7.

Bu çalışmada açıklanan QuickCorn protokolü Jones ve ark¹¹protokolüne dayanıyordu , hangi lowe ve ark tarafından bildirilen yöntemin bir daha iyileştirilmesi oldu^7,8. Bu çalışmada, php81430 (Şekil 1) ve aksesuar plazmid PHP71539¹² ikili vektör yapısına yataklık eden bir Agrobacterium strain LBA4404(Thy-) dönüşüm için kullanılmaktadır. PHP81430'un T-DNA'sı aşağıdaki moleküler bileşenleri içerir. (1) Transformasyon selektif marker gen Hra ekspresyon kaseti. Mısır Hra (Zm-Hra) geni, sülfonilüreler ve imidazolinones^13,14gibi ALS inhibe herbisitlere toleranslı modifiye asetonaktaz (ALS) genidir. Zm-Hra geni sorgum ALS promotörü⁸ ve patates proteinaz inhibitörü II(pinII) terminatör¹⁵tarafından düzenlenir. T-DNA da içerir (2) dönüşüm ekranlı marker gen ZsGreensahip bir ifade kaseti . Zoanthus sp. resif mercan¹⁶ bu yeşil floresan protein geni ZsGreen bir sorgum ubiquitin organizatörü / intron ve pirinç ubiquitin sonlandırıcı tarafından düzenlenir.

Ayrıca, T-DNA içerir (3) morfojenik gen Bbm ekspresyon kaset. Bbm embriyo^gelişimi9^,17ile ilişkili bir transkripsiyon faktörüdür. Bbm mısır fosfolipid transferaz proteini tarafından düzenlenir (Pltp) organizatörü⁸ ve pirinç T28 terminatör¹⁸. Zm-Pltp embriyo scutellar epitel güçlü ekspresyon ile bir gendir, ipek kıllar, ve yaprak yan hücreleri (koruyucu hücreleri yan), üreme organlarında düşük ekspresyon, ve kökleri hiçbir ifade⁸. Ayrıca (4) morfojenik gen Wus2 ekspresyon kaset içerir. Wus2 apikal meristem¹⁹bakımı ile ilişkili başka bir transkripsiyon faktörüdür. Zm-Wus2 bir mısır auxin-indüklemez organizatörü kontrolü altındadır (Zm-Axig1)²⁰ ve mısır In2-1 terminatör²¹. Son olarak, T-DNA içerir (5) cre-loxP rekombinasyon sistemi. Cre rekombinaz gen²² mısır ısı şok protein 17.7(Hsp17.7)²³ promotör ve patates pinII terminatör kontrolü altındadır. İki loxP siteleri (aynı yönde) ZsGreendahil olmak üzere²⁴ kanat dört gen ekspresyonu kasetleri , cre, Bbm ve Wus2.

Morfojenik genlerin varlığı bitki olgunluğu ve sonraki soyundan için istenmediği için, Normal nasır yenilenmesi ve bitki gelişimine olanak sağlamak için mısır genomundaki morfojenik genleri çıkarmak için T-DNA'ya ısıya bağlı kre-loks rekombinasyon sistemi inşa edilmiştir. Isıl işlem den sonra, CRE proteininin ekspresyonu Hra seçim geni hariç tüm transgenleri ortadan kaldırır. Başarılı dönüştürücüler herbisit dirençli ama ZsGreen-negatif olmalıdır. Dönüşüm sıklığını daha da artırmak için, Agrobacterium zorlanma da ek bir aksesuar plazmid barındırır (PHP71539) Agrobacterium virrulence ekstra kopyaları vardır (vir) genler¹².

QuickCorn yöntemi geleneksel mısır dönüşüm protokollerinden farklıdır, çünkü dönüşüm sırasında nasırlı indüksiyon adımı içermez. Agrobacteriumile enfeksiyon dan sonra ilk hafta boyunca , somatik embriyolar enfekte olgunlaşmamış embriyoların scutellar epitel üzerinde geliştirmek. Embriyolar daha sonra embriyo olgunlaşma ve çekim oluşumunu teşvik hormonlar ile bir ortama aktarılır. Somatik embriyoların olgunlaşma/sürgün oluşumuna hızla aktarılması, daha önce mısır dönüşümünde kullanılan geleneksel nasır evresini atlar ve T0 bitkilerinin doğrudan üretimine izin verir^8. Daha önce yayınlanan mısır dönüşüm yöntemleri⁶ile karşılaştırıldığında, QuickCorn yöntemi daha hızlı, daha verimli ve daha az genotip bağımlı. Bu yöntemi kullanarak, köklü bitkiler genellikle sadece 5-7 hafta içinde toprağa aktarmak için hazır, yerine üç veya daha fazla ay geleneksel protokoller tarafından gerekli. Bu makalenin amacı, genellikle çoğu akademik kurumda bulunan bir laboratuvar ortamında daha kolay çoğaltılmasını sağlayan, yöntemin derinlemesine bir açıklamasını ve gösterisini sağlamaktır.

1. Büyüme ortamı hazırlığı

1. Bu protokol için tam büyüme orta tarifleri için, Tablo 1bakın.
2. Ortam 1 L hazırlamak için, bir karıştırma plakası üzerine 2 L beher yerleştirin ve içine bir karıştırma çubuğu yerleştirin.
3. 900 mL distile su ile beher doldurun ve karıştırma plakası açın. Karıştırma çubuğu orta hızda dönmeli.
4. Tüm toz maddeleri tartın ve bir kabın içinde çözünür.
5. Varsa tüm sıvı maddeleri ölçün ve kabına ekleyin.
6. Distile su kullanarak son hacmi 1 L'ye getirin.
7. pH'ı ölçün ve tarif özelliklerine göre ayarlayın.
8. Bir sıvı büyüme ortamı formüle edilirse, hiçbir agar eklenir. Bir vakum pompası bir filtre sterilizatör takın ve filtre ile sıvı büyüme ortamı dökün. Pompayı açın ve tüm sıvı çekilene kadar bekleyin. Kapsayıcıya bir kapak yerleştirin ve bir etiket takın.
9. Katı bir büyüme ortamı formüle ediyorsanız, pH ayarlandıktan sonra, doğrudan bir şişe veya şişe içine agar ekleyin.
10. 1 L likit büyüme ortamını 2 L Erlenmeyer şişesine dökün veya iki adet 1 L otoklavlanabilir şişeye (her biri 500 mL) bölün. İki şişe kullanılırsa, agar bölün ve doğrudan şişe ekleyin.
11. Buharın kaçabilmesi için iki kat alüminyum folyo gibi nefes alabilen bir kapakla şişeyi kapatın. Şişe kullanıyorsanız, vida kapağını üstteki kapağı gevşek bir şekilde kapatın.
12. Otoklav 121 °C'de 25 dk.
13. Otoklavlamadan sonra, büyüme ortamını otoklavdan çıkarın ve 55-60 °C'ye kadar serinleyin (55 °C'ye ayarlanmış bir su banyosu bunu kolaylaştırabilir). Plakaları dökmek için uygun olana kadar birkaç saat için sıvı bir durumda büyüme orta tutun.
14. Soğuduktan sonra, tüm sterilizasyon sonrası katkı maddelerini ekleyin (Bkz. Tablo 1)ve iyice karıştırın.
15. Tüm malzemeler eklendikten sonra, bir laminar akış kaputunda tercih edilen kap içine belirlenen hacmi dökün.
16. Büyüme ortamı istenilen Petri kaplarına manuel olarak veya sıvı dağıtım cihazı kullanılarak dökülebilir. Elle dökülürken, kullanım kolaylığı için büyük hacimli otoklavlı ortamın daha küçük bir steril kabına (500 mL) aktarılması tavsiye edilir.
17. Büyüme ortamının soğumasına ve katılaşmasına izin verin.
18. Büyüme ortamı bir kez katı hale kullanıma sunulacak ve en iyi kapaklı plaka yığınları olarak steril bir akış kaputunda biraz gece kuruduktan sonra ertesi gün kullanılır. Bir gecede kuruduktan sonra, plastik kollu içine plakalar aktarın, gevşek ucunda katlayın, ve bant küçük bir bit ile yerinde bu tutmak. Bu aşırı kuruma önler. Orta kadar 1 ay boyunca serin, karanlık ve temiz bir ortamda (4-16 °C) saklanabilir.

2. Büyüyen donör bitkiler ve olgunlaşmamış kulaklar hasat

1. 1,5 galon (5,9 L) topraksız bir substrat içeren bir serada kamuya açık mısır inbred (yani, B73, Mo17 veya W22) büyütün. Gün içinde ortalama 25,5 °C, gece ise 20 °C sıcaklıkla 16/8 (gündüz/gece) fotoğraf çekimi kullanın.
2. Bitkiler gerektiği gibi sulanır ve toprak karışımına dahil edilebilen veya dikimden sonra yüzeye ekilebilen kontrollü bir salınım gübresi (15-9-12'nin N-P-K'si) ile döllenir.
3. Genellikle kulakların ortaya çıkması için tohum çimlenme sonra yaklaşık 70-90 gün sürer. Kulak sürgünleri ortaya çıktıkça, kontrolsüz tozlaşmanın oluşmasını önlemek için bir çekim çantası ile kaplayın.
4. İpekler ortaya çıktıktan yaklaşık 2-3 gün sonra polen mevcut olacaksa ertesi gün, %70 etanolle sterilize edilmiş makas kullanarak ipekleri kesin. İpekleri ve kabuğu nu, ipeklerin çıktığı kabuk yapraklarının ucuna yaklaşık 2,5 cm aşağıda kesin. Tozlaşma ertesi gün yapılabilir. Her kulak arasında makas yeniden sterilize emin olun.
5. Bir kez anthers bir püskül ortaya, bir püskül çanta ve sap etrafında çantanın tabanında olmayan kızak ataş ile püskül kapağı.
6. Ertesi sabah, yavaşça bitki üzerinde viraj ve polen serbest bırakılması için teşvik etmek için torba dokunun.
7. Püskül lüzmunu çıkarın ve polenlerin kaçmasını önlemek için torbanın üst kısmını katlayın. Genellikle püskül çanta için en iyi 1 gün önce kullanılacak (ölü polen birikmesi önlemek ve anthers döken). Taze polen püsküllerden yaklaşık 3-5 gün toplanabilir. Püskültabanında iç florets ortaya çıktığında, püskül muhtemelen ertesi gün uygun polen üretmek olmaz.
8. Polenleri aynı bitkiden (selfing) veya aynı inbred (sibbing) başka bir bitkiden kullanın.
9. Kulak torbasını çıkarın veya ipekleri ortaya çıkarmak için torbanın ucunu kesin, sonra püsküllü torbadan polenleri ipeklerin üzerine hızla dökün.
10. Hemen püskül lüzmuyla kulağı kapatın ve torbanın tabanını emniyete almak için sapın etrafına zımbalayın. Çapraz tozlaşmayı önlemeye yardımcı olmak için tozlaşma sırasında bitkiyi farklı genotiplerden fiziksel olarak izole etmek yararlı olabilir. Olgunlaşmamış kulak hasat hazır olana kadar püskül torbasını kulağın üzerinde bırakın.
11. Tozlaşmadan 9-12 gün sonra embriyo boyutu için ekran kulakları. Kulak ortaya çıkarmak için sap yukarı tozlaşma torbası kaydırın. Yavaşça kulak çevresinin yaklaşık üçte biri ila dörtte biri ve kulak aşağı mesafenin yaklaşık üçte biri üzerinde çekirdekleri ortaya çıkarmak için kabuğu aşağı çekin. Ucuna yakın çekirdekler ortalama embriyo boyutunu temsil olmayacaktır.
12. Neşter kullanarak, boyut ve renk olarak diğer çekirdeklerin çoğunluğuna benzer görünen tek bir çekirdeğin kapağını dilimleyin.
13. Adım 4.6'da açıklandığı gibi embriyoyu çıkarmak için bir spatula (cetvelli) kullanın. Spatula veya dijital kaliper üzerinde yerleşik bir cetvel kullanarak embriyonun uzunluğunu ölçün. Embriyo 1.5-2.0 mm arasında ise, kulak hasat. ~ 1.3 mm ise, kulak günün ilerleyen saatlerinde hasat için hazır olabilir ve yaklaşık 7-8 saat tekrar kontrol edilebilir.

3. Enfeksiyon için Agrobacterium süspansiyon kültürünün hazırlanması

NOT: PHP81430 (Şekil 1) ve PHP71539¹² içeren Agrobacterium strain LBA4404(Thy-) -80 °C'de gliserol stoku olarak saklanır. Bu malzemeler Corteva Agriscience'dan Malzeme Transfer Anlaşması ile temin edilebilir. LBA4404(Thy-) büyüme medyasında sağlanan timidin ihtiyacı olan bir yardımcıotrofik suşudur. Auxotroph Agro suşubirincil yararı biyo-kapsama amaçlıdır. Bu Agro büyüme azaltmanın ek yararı vardır. Yardımcı timidin olmadan yardımcı agro zorlanma büyümez. Yine de, timidin (muhtemelen) kültürde ölmekte olan bitki dokusu tarafından sağlanabilir. Bu nedenle, hala tamamen yardımcı agro kontrol etmek için orta bir antibiyotik sağlamak için bir ihtiyaç vardır. Ancak, timidin yokluğunda yardımcı trofik zorlanma tehlikeye büyüme nedeniyle kontrol etmek daha kolay olacaktır.

1. Enfeksiyon tarihinden dört gün önce gliserol stoğundan 50 mg/L timinin, 50 mg/L gentamisin ve 50 mg/L spektinomisin içeren bir YP plakası üzerinde bakteri serilenerek bir "anne" plakası başlatın(Tablo 1). "Anne" plakasını 20 °C'lik bir kuluçka makinesinde 3 gün kuluçkaya yatırın.
2. Enfeksiyon deneyinden bir gün önce, "anne" plakasından bir ila beş koloni seçerek ve bakterileri "anne" plakasından yeni bir YP plakasına (timinin, gentamisin ve spektinomisin ile) doğrulayarak bir "çalışma" plakası hazırlayın; Tablo 1).
3. Sıralı quadrants günlük "çalışma" plaka çizgi ve seri seyreltilmiş olan quadrants oluşturmak için tekrarlayarak, ardışık çeyreğine sadece çizgili alan üzerinden döngü 1x çalıştırın. "Çalışan" plakayı bir gecede 27 °C'lik bir kuluçka makinesinde kuluçkaya yatırın.
4. Embriyo diseksiyonu tamamladıktan sonra (adım 4.8), bakteri büyüme kolonilerin ince çizgiler olarak görülebilir "çalışma" plaka bir bölgeden Agrobacterium toplamak için bir döngü veya benzer bir araç kullanın.
   NOT: Bakteri üreme yoğun bir çim ile plaka alanları kaçının. Agrobacterium büyüme büyük olasılıkla zaten yoğun alanlarda azalmaya başladı, görünür koloniler ile alanlarda bakteri enfeksiyon için uygun büyüme aşamasında iken.
5. Toplanan bakterileri 10 mL 700A sıvı ortam içeren 50 mL'lik bir tüpte askıya alın(Tablo 1). Girdap bakteri kültürünü tamamen askıya almak için.
6. Optik yoğunluğu 550 nm dalga boyunda ölçün. OD 0,35-0,45 arasında olana kadar, 0,4 en uygun değer olana kadar hacmi ayarlayın.
   NOT: OD 0,45'ten yüksekse, daha fazla 700A sıvı ortam ekleyin. OD 0.35'ten düşükse, süspansiyon kültüründe daha fazla Agro kolonisini aşılamak.

4. Embriyo diseksiyonu, enfeksiyon ve birlikte yetiştirme

1. Dönüşüm deneyleri için uygun kulakları seçin; bu iyi bir tohum seti ve 1.5-2.0 mm boyutu arasında değişen embriyolar olmalıdır. Genellikle tozlaşmadan sonra 9-12 gün arasında hasat edilir. Hasat edilen kulaklar 4 °C'de 1-4 gün taze olarak kullanılabilir veya saklanabilir, ancak yanıt kalitesi büyük olasılıkla ilk günden sonra uzun süreli depolama ile kademeli olarak bozulacaktır.
2. Kabukları ve ipekleri çıkarın. Taban veya kulağın üst içine bir tutamaç takın. Kolu forceps, tornavida, vb bir çift olabilir.
3. Kulakları büyük bir kapta yerleştirin (örn. 2 L kabı, sapı yukarı doğru, kabı dezenfeksiyon çözeltisi ile doldurun. Dezenfeksiyon çözeltisi 1.8 L 20% ticari çamaşır suyu (%1.65 sodyum hipoklorit) ve sürfaktan Tween 20 damla bir çift.
4. Bir laminar akış tezgah içinde kulakları sterilize. 20 dakika sonra, çamaşır suyu çözeltisini boşaltın ve steril distile su cömert bir miktar kullanarak kulakları 3x (5 dk her) durulayın. Suyu çıkarın ve kulakların birkaç dakika kurumasını bekleyin.
   NOT: Kulakların 20 dakika boyunca çamaşır suyu çözeltisine tamamen batırılması önemlidir. Hava kabarcıklarını çıkarmak için zaman zaman çamaşır suyu çözeltisinde kulakları dikkatlice hareket ettirin.
5. 700A sıvı ortam ile doldurulmuş 2 mL mikrosantrifüj tüp hazırlayın. Bu tüp olgunlaşmamış embriyoları toplamak için kullanılacak.
6. Kulak alın ve steril bir neşter kullanarak, endosperm ortaya çıkarmak için çekirdek kron üst 1-2 mm çıkarın. Olgunlaşmamış zigotik embriyoyu (IZE) çıkarmak için mikro spatula kullanın. IZE çekirdek içinde, kulağın ucuna bakan tarafta ve cob eki yakınında yer alacak. Spatula kullanarak, embriyo uzak pericarp endosperm içine yerleştirin, sonra yavaşça endosperm çıkarmak için yukarı büküm ve embriyo çıkarılması için izin(Şekil 2).
7. Spatula kullanarak, 700A sıvı orta içeren tüp içine embriyo aktarın. 100 embriyo toplanana kadar bunu yapmaya devam edin. Bir sonraki adıma geçmeden önce birden fazla tüp (~100 embriyo/tüp) doldurulabilir. Bu noktada, Agrobacterium süspansiyon (adım 3.5 bakınız) hazırlanmalıdır.
8. 700A sıvı ortamı 1 mL pipetle embriyo tüpünden çıkarın. Embriyoları yıkamak için taze 700A orta ekleyin, sonra da bu medya kaldırın.
9. Karıştırmak için 30 s veya invert tüp 12x-15x için düşük bir ayar (3/10) üzerinde Agrobacterium süspansiyon ve girdap 1 mL ekleyin. Bu tüpün 5 dakika boyunca yedek kulübesinde yatay olarak dinlenmesine izin verin.
10. 5 dakika sonra, 562V co-ekim ortamı(Tablo 1)bir plaka üzerine embriyo ve Agrobacterium süspansiyon tüm tüp transfer . Bu, plakayı tezgaha koyarak ve tüp içeriğini hızlı bir şekilde tabağa dökerek elde edilebilir. Yavaşça embriyoları dağıtmak ve 1 mL pipet kullanarak Agrobacterium süspansiyon kaldırmak için plaka girdap.
11. Embriyoların scutellum (yuvarlak) tarafı yukarı bakacak şekilde yerleştirildiğinden emin olun. Gerekirse büyüteç veya diseksiyon kapsamı kullanın. Plakaları plastik kutulara (19 cm x 28 cm x 5,1 cm) yerleştirin ve plakaları karanlıkta 21 °C'de bir gecede 16-18 saat kuluçkaya yatırın. Parafin film veya havalandırma bandı kullanılarak tek tek plaka sarma gerekli değildir.
12. Gece birlikte ekimi sonra, enfekte embriyolar taşımak, scutellum yan yukarı, dinlenme orta 605T üzerine (Tablo 1). Plaka başına yaklaşık 30 embriyo yerleştirin. Plakaları karanlıkta 26-28 °C'de kuluçkaya yatırın.
13. 4-10 gün (7 gün tercih edilir) kuluçka. Şu anda, somatik embriyoların gelişimi zigotik scutellum yüzeyinde görülebilir (Şekil 3).

5. Seçim, ısıl işlem ve rejenerasyon

1. Dinlenme döneminden sonra, ısı şok embriyolar. Embriyo plakalarını içeren kutuyu 45 °C'lik bir kuluçka makinesine yerleştirin ve %70 bağıl nem oranı2 saat. Daha sonra kutuyu 45 °C'lik kuluçka makinesinden çıkarın ve 26-28 °C koyu kuvöze 1-2 saat yerleştirin.
   NOT: Bir kuvözde %70 neme ulaşamıyorsa, plaka kutusunun altına çift kat otoklavlı kağıt havlu ekleyin ve kutunun içindeki nemi korumak için otoklavlı suyla ıslatın. Plakaları kağıt havluların üzerindeki kutuya geri döndürün ve 45 °C'ye yerleştirmeden önce kapağı kapatın. Sıcaklığı ve nemi izlemek için küçük bir dijital higrometre/termometre kullanın.
2. Isıl işlem görmüş İzLer'i istirahat lı ortamdan 0.05 mg/L imazapyr içeren sürgün oluşum ortamına (13329A) selektif ajan olarak aktarın(Tablo 1). Transfer ederken, varsa, ince uçlu forceps veya cerrahi makas kullanarak, coleoptiles çıkarın.
3. Aşırı kalabalıktan kaçınmak için plaka başına 10-15 embriyo yerleştirin. Embriyoları 26 °C koyu kuvözde 2 hafta boyunca bu ortamda tutun.
4. Embriyoların köklenme ortamına aktarılması (13158; Tablo 1) 1-2 hafta boyunca. 27 °C'de bir ışık odası veya ışık odasında (16 gün/8 gece, 20-150 μmol/m²/s) plaka başına sekiz adet ve kuluçka yeri.
5. Plantetler geliştikçe, hem sürgünler hem de güçlü kökler içeren daha güçlü plantletleri yeni kökleme ortamı plakalarına yerleştirin, her tabak başına bir bitki yerleştirin. Bu daha güçlü plantlet büyüme sağlayacaktır. Başka bir 7-14 gün için ışık odası veya ışık odasında plakaları yerleştirin.
   NOT: Özenle orta ile iyi temas sağlamak için plantlet ile ilgili herhangi bir nasır parçaları çıkarın.
6. Bitki daha güçlü hale geldikçe, orta kökleme bitki kaldırmak ve agar kaldırmak için musluk suyu ile kökleri durulayın.
7. Ayrı bitkileri önceden ıslak topraksız bir substrat içeren^2'de 3 (~19 cm²⁾kaplara nakledin. Tencereleri drenaj delikleri olan bir tepsiye (27 cm x 54 cm) yerleştirin ve düzlüğü plastik bir nem kubbesi ile kaplayın. Bu alışma adımı, yukarıdaki bölüm 2 'de (adım 2.1) açıklanan büyüme koşulları ile büyüme odasında veya serada elde edilebilir.

6. Seraya nakli ve T1 tohumu üretimi

1. Günde 2x bitkileri kontrol edin. Gerektiği gibi su. Bitkilerin ne kuruduğunu ne de aşırı sulandırıldığından emin olun. Biraz kuru bir substrat bakımı kök büyümesini teşvik eder.
   NOT: Nem kubbesi nakilden 4-7 gün sonra çıkarılabilir. Bitkiler bu küçük kaplarda toprağa nakil stresinden gözle görülür bir şekilde iyileşene kadar yetiştirilmelidir. Bu yaklaşık 9-14 gün sürer.
2. Tüm topraksız fişi ve ekini 1,5 gal (5,9 L) bir tencereye nakledin. Toprak dokunmak için kuru hissettiğinde sera ve su koruyun.
3. Tencereye 15-9-12 n-p-k kontrollü bir serbest gübre ekleyin, bu gübre ya substrat karışımına dahil edilebilir ya da yüzeye uygulanabilir.
4. Kulak sürgünleri bitkiden çıkmaya başladığında, kulak sürgünlerini örtmek için bir çekim torbası kullanın. Ortaya çıkan ipek torba çıkarmadan görülebilir, böylece yarı saydam bir çanta kullandığınızdan emin olun. Sürgün çantası kontrollü tozlaşmanın oluşmasını sağlar. Her zaman transgenik püskülleri poşetlemek önemlidir.
5. İpekler ortaya çıktıktan sonra (1-2 gün), ortaya çıkan ipekleri tek düze bir uzunluğa kadar kırpın. Bu kabuk yapraklarının üst yaklaşık 2,5 cm altında olacaktır. % 70 etanol sterilize edilmiş temiz makas bir çift kullanın. İpekleri keserek, tozlaşmanın meydana gelmesi için ertesi gün tek tip bir tuft gelişir.
6. Mısır genotiplerinin çoğunluğu için, tozlaşma için en uygun zaman püskül veya ipek ortaya çıktıktan 2-3 gün sonradır.
7. Polenleri aynı bitkiden (kendi kendine tozlaşmışsa) veya aynı aşılı vahşi tipten (dışa veya ingeçte) toplayın.
8. Bir püskül torbaiçinde polen toplamak ve T0 bitkinin ipek tuft uygulayın. Polen bir yabani tip (non-transgenik) bitki ise, düz kahverengi püskül lüle içinde polen yerleştirin. Polen bir transgenik bitki ise, polen transgenik olduğunu belirtmek için yeşil çizgili bir torbaya polen yerleştirin.
9. Tozlaşma ayrıntıları için 2.5-2.10 adımlarını izleyin.
10. Tozlaşmadan yaklaşık 2 hafta sonra, kulaklardan püskül torbalarını çıkarın ve kurumaya başlayabın. Kurumaya yardımcı olmak için, tozlaşmadan 21-25 gün sonra bitkisulama durdurmak. Ayrıca tohum ortaya çıkarmak için kabuk yaprakları geri çekebilirsiniz. Bu uygulama aynı zamanda küf önlemeye yardımcı olur.
11. Tozlaşmadan yaklaşık 45 gün sonra tohumları hasat edin ve 4-12 °C'de soğuk hava deposunda saklayın.

Burada gösterilmiştir Agrobacteriumiçin bir adım-adım protokol-üç kamu mısır inbred hatları (B73, Mo17 ve W22) bu mısır genetiği alanında önemli olmuştur genetik dönüşüm aracılı. Konvansiyonel mısır dönüşüm protokolleri5kullanılarak üç bred hattının dönüşümü sağlanamadı. Şekil 1 ve Şekil 2, sırasıyla burada kullanılan yapı ve başlangıç malzemelerini göstermektedir. Kulaklar genellikle tozlaşmadan 9-12 gün sonra hasat edilir. Uzunlukları 1,5-2,0 mm arasında değişen İzLer, bu protokol için dönüşüm için en iyi ekstesilerdir (Şekil 2).

Enfeksiyondan sekiz gün sonra, ZsGreen-ifade somatik embriyolar bir floresan mikroskop GFP kanalı altında görselleştirilmiş(Şekil 3). Enfekte İzBS enfeksiyondan 8 gün sonra ısıl tedaviye tabi tutuldu (5.1 ve 5.2. adım). Bu tedavi BBmexcised CRE rekombinaz ekspresyonu indüklenen , Wus2, cre, ve ZsGreen ifade kasetleri iki loxP siteleri arasında kuşatılmış(Şekil 1). Isıl işlem görmüş dokular daha sonra morfojenik gen çıkarılmasından sonra dönüştürülmüş doku seçimi için herbisit imazapyr içeren ateş oluşum ortamı kültürlü edildi.

Olgunlaşma embriyoları veya imazapyr dirençli ateş tomurcukları ile çoğalan dokular enfeksiyondan yaklaşık 3-4 hafta sonra gözlenmiştir(Şekil 4). Bazı imazapyr dirençli dokular ZsGreen için negatif, cre-aracılıeksizyon büyük olasılıkla bu dokularda meydana geldiğini düşündürmektedir(Şekil 4). Dokular köklendirme orta ve hafif kuluçkaya taşındıktan sonra sürgünler gelişmeye başladı (Şekil 5). Sağlıklı ve güçlü büyüyen sürgünler gelişmiş kökleri ile hasat edildi(Şekil 5). Bazı dokularda birden fazla sürgün olduğu ortaya çıkmıştır(Şekil 5E,F,G). "Çimenli" regenerant Bu tür aynı transgen entegrasyon desenleri olan klonal bitkiler nedeniyle olabilir. Bu bitkileri genotiplemek için moleküler biyolojik analiz gereklidir.

Her üç kamu inbred hatları iyi bu protokol yanı sıra bu çalışmada kullanılan yapı kullanarak yanıt verdi. W22 yaklaşık % 14 (100 enfekte olgunlaşmamış embriyo başına yaklaşık 14 transgenik sürgünler) bir frekans ile, imazapyr dirençli sürgünler en yüksek frekans üretti. Hem B73 hem de Mo17 yaklaşık %4 transgenik sürgün ler üretti. Bu frekanslar, hem morfojenik genleri taşıyan bitkiler hem de CRE aracılı eksizyon tarafından çıkarılan morfojenik geni olan bitkiler de dahil olmak üzere tüm transgenik sürgünleri göstermektedir.

Şekil 1: İkili plazmid PHP81430 T-DNA bölgesinin şematik gösterimi. RB = sağ T-DNA sınırı; loxP = CRE rekombinaz hedef bölgesi; Axig1pro:Wus2 = mısır auxin-indükleyici (Zm-Axig1) + Zm-Wus2 + mısır In2-1 terminatör; Pltppro:Zm-Bbm = mısır fosfolipid transferaz proteini (Zm-Pltp) promotör + Zm-Bbm + rice T28 terminatör (Os-T28); Hsppro:cre = mısır ısı şok proteini 17.7 promotör (Zm-Hsp17.7) + cre rekombinaz geni + patates proteinaz inhibitörü II (pinII) terminatör; Ubipro:ZsGreen = sorgum ubiquitin promotör / intron (Sb-Ubi) + yeşil floresan protein ZsGreen gen + pirinç ubiquitin terminatör (Os-Ubi); Hra kaset = sorgum asetokaktaz synthase (Sb-Als) promotör + mısır Hra (Zm-Hra) gen + pinII terminatör; LB = Sol T-DNA sınırı; colE1, plazmid ColE125çoğaltma kökeni ; SpecR = bakteri seçimi için Tn21'den spectinomisin dirençli gen aadA1 26; Rep A,B,C = Agrobacterium rhizogenes27pRiA4 gelen çoğaltma kökeni . Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Başlangıç malzemeleri. B73 kulakları 12 gün post-pollinasyon hasat (A). B73(B), Mo17 (C) ve W22(D)embriyolarının olgunlaşmamış embriyoları. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Dinlendirme de doku gelişimi 1 hafta sonrası enfeksiyon. Mo17(A) ve W22(B)somatik embriyoları ifade GFP gösteren bir floresan mikroskobu (GFP filtresi) altında embriyolar (8 gün sonrası enfeksiyon) Parlak alan(C)ve GFP filtresi(D)altında doku (B73) geliştirme. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: Olgunlaşma ortamı nda doku gelişimi seçimi ile. Bir W22 olgunlaşma plakası (A). Parlak alan(B)ve GFP filtresi(C)altında gelişen doku (Mo17, enfeksiyon sonrası 15 gün). Parlak alan(D)ve GFP filtresi(E)altında gelişen doku (Mo17, enfeksiyon sonrası 28 gün). Oklar GFP ekspresyonu eksik dokuların rejenerasyon işaret, ısı kaynaklı CRE protein aktivitesi sonra loxP siteleri arasında ZsGreen genin eksizyonu düşündüren. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 5: Kökleme ortamında doku gelişimi. W22(A), B73 (B) ve Mo17(C,D)sürgünleri. B73(E)ve W22(F,G)birden fazla sürgün (çimenli regenerants) ile olay. B73 (H) ve W22(I)kökleri ile sürgünler. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 1: Mısır dönüşümü için ortam kompozisyonları. Bu tabloyu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın (İndirmek için sağ tıklayın).

Alicia Masters, William Gordon-Kamm ve Todd Jones, bu makalede kullanılan B73, Mo17 ve W22'nin protokolünü ve mısır kulaklarını sağlayan Corteva Agriscience çalışanlarıdır. Yazarlar Minjeong Kang, Morgan McCaw, Jacob Zobrist ve Kan Wang açıklayacak bir şey yok.