Method Article

Floresan Mikroskopi ile Kesme Akışı Altında Tek Moleküllü Konformasyonel Değişikliklerin Karakterizasyonu

DOI:

10.3791/60784

⸱

January 25th, 2020

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Bioengineering, Lehigh University, 2Department of Materials Science and Engineering, Lehigh University, 3Department of Chemistry, Lehigh University, 4Department of Mechanical Engineering and Mechanics, Lehigh University

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tek makromoleküllerin mikroakışkan cihazlarda immobilize edilebisi ve konformasyonlarındaki değişiklikleri kesme akışı altında ölçen bir protokol sayılmısAk. Bu protokol, bir akış ortamında proteinler ve DNA gibi biyomoleküllerin biyomekanik ve fonksiyonel özelliklerini karakterize etmek için yararlıdır.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mekanik tedirginlik altında tek moleküllü davranış birçok biyolojik süreçleri anlamak için yaygın olarak karakterize edilmiştir. Ancak, atomik kuvvet mikroskobu gibi yöntemler insidansı sınırlı zamansal çözünürlüğe sahipken, Förster rezonans enerji transferi (FRET) sadece konformasyonların çıkarılsın. Floresan mikroskopi, diğer taraftan, çeşitli akış koşullarında tek moleküllerin yerinde görselleştirme gerçek zamanlı sağlar. Protokolümüz, floresan mikroskobu kullanarak farklı kesme akış ortamları altında tek biyomoleküllerin konformasyonel değişikliklerini yakalama adımlarını açıklamaktadır. Kesme akışı mikroakışkan kanallar içinde oluşturulur ve bir şırınga pompası tarafından kontrol edilir. Yöntemin gösterimleri olarak von Willebrand faktörü (VWF) ve lambda DNA'sı biotin ve florofor ile etiketlenir ve kanal yüzeyinde hareketsiz hale getirilmiştir. Konformasyonları toplam iç yansıma (TIRF) ve konfokal floresan mikroskopisi kullanılarak değişken kesme akışı altında sürekli olarak izlenir. VWF'nin geri dönüşümlü çözülme dinamikleri, işlevinin insan kanında nasıl düzenlendiğini anlamak için yararlıdır, lambda DNA'sının konformasyonu ise makromoleküllerin biyofiziği hakkında öngörüler sunar. Protokol aynı zamanda polimerlerin, özellikle de biyopolimerlerin, değişen akış koşullarındaki davranışlarını incelemek ve karmaşık sıvıların reolojisini araştırmak için de yaygın olarak uygulanabilir.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biyomoleküllerin çevresel uyaranlara nasıl tepki verecek mekanizmaları geniş ölçüde incelenmiştir. Özellikle bir akış ortamında, kesme ve uzama kuvvetleri konformasyonel değişiklikleri ve potansiyel olarak biyomoleküllerin işlevini düzenler. Tipik örnekler lambda DNA ve von Willebrand faktörü (VWF) kesme kaynaklı çözülme içerir. Lambda DNA bireysel, esnek polimer zincirleri ve polimer çözeltileri1,2,3,4reolojikonformasyon dinamikleri anlamak için bir araç olarak kullanılmıştır. VWF anormal kesme hızları ve akış desenleri ile kan damarlarının yara sitelerinde trombositler toplar doğal bir akış sensörüdür. VWF'nin çözülmesi, trombositlerin A1 etki alanına ve kollajenin A3 etki alanına bağlanmasını aktive etmek için gereklidir. Buna ek olarak, yüksek makas kaynaklı A2 etki alanı açılmak VWF dekolte sağlar, hangi dolaşımda moleküler ağırlık dağılımı nı düzenleyen5,6. Böylece, bu moleküllerin akış altında nasıl hareket ettiklerine doğrudan görselleştirme, biyomekanik ve işlevleri ne kadar temel anlayışlarımızı geliştirebilir, bu da yeni tanı ve tedavi uygulamaları sağlayabilir.

Tek moleküllü konformasyonları karakterize eden tipik metodolojiler arasında optik/manyetik cımbız, atomik kuvvet mikroskobu (AFM) ve tek moleküllü Förster rezonans enerji transferi (FRET)7sayılabilir. Tek moleküllü kuvvet spektroskopisi biyomoleküllerin konformasyonel değişiklikleri ile ilişkili kuvvet ve hareketi araştırmak için güçlü bir araçtır. Ancak, genel moleküler konformasyonlar8harita yeteneği yoksun. AFM yüksek uzamsal çözünürlükile görüntüleme yeteneğine sahiptir ancak zamansal çözünürlük9sınırlıdır ,10. Buna ek olarak, uç ve örnek arasındaki temas akış tarafından indüklenen yanıt ı bozabilir. FRET ve nanopore analitiği gibi diğer yöntemler, moleküler mesafe ve dışlanmış hacimlerin tespitine dayalı olarak tek moleküllü protein katlama ve açılma durumlarını belirler. Ancak, bu yöntemler hala emekleme döneminde ve tek moleküllü konformasyonlar onların doğrudan gözlem sınırlıdır11,12,13,14.

Öte yandan, floresan mikroskopisi altında yüksek zamansal ve mekansal çözünürlüğe sahip makromoleküllerin doğrudan gözlemlenmesi, birçok biyolojik süreçte tek moleküllü dinamikleri anlamamızı geliştirmiştir15,16. Örneğin, Fu ve ark. son zamanlarda ilk kez VWF uzama ve trombosit reseptör bağlama eşzamanlı görselleştirme elde etti. Çalışmalarında, VWF molekülleri biotin-streptavidin etkileşimleri yoluyla bir mikroakışkan kanalın yüzeyinde immobilize edildi ve değişen kesme akış ortamlarında toplam iç yansıma floresansı (TIRF) mikroskopi altında görüntülendi17. Fu's gibi benzer bir yöntem uygulayarak, burada VWF ve lambda DNA konformasyonları doğrudan TIRF ve konfokal floresan mikroskopi altında görülebilir göstermektedir. Şekil 1'degösterildiği gibi, mikroakışkan cihazlar kesme akışını oluşturmak ve kontrol etmek için kullanılır ve biyomoleküller kanal yüzeyinde hareketsiz hale getirilmiştir. Değişen kesme hızlarının uygulanması üzerine, aynı molekülün konformasyonları, Şekil 1'dede gösterilen uzatma uzunluğunu ölçmek için kaydedilir. Yöntem, hem reolojik hem de biyolojik çalışmalar için karmaşık akış ortamları altında diğer polimer davranışlarını araştırmak için yaygın olarak uygulanabilir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. VWF Hazırlama

  1. Etiketleme reaksiyonları için hazırlamak için insan plazmavwf yeniden. 1 mg/mL VWF stok çözeltisi oluşturmak için 100 μL deiyonize (DI) suyu 100 μg lyophilized VWF ekleyin.
  2. Aşırı glisini gidermek için VWF stok çözeltisini diyalize çevirin, bu nedenle biyotin ve florofor etiketleme verimliliğini artırın.
    1. VWF stok çözeltisinin 50 μL'sini 10.000 moleküler ağırlık kesme ve kapaklı mühürleme ile 0,1 mL diyaliz ünitesine aktarın. Kalan stok çözeltisini -20 °C'de saklayın. VWF stoku -20 °C'de 1 yıla kadar stabil olacaktır.
    2. Diyalizi 500 mL 1x steril fosfat tamponlu salin (PBS) (0,01 M disodyum fosfat, 0,0018 monopotasyum fosfat, 0,0027 M potasyum klorür, 0,137 M sodyum klorür, pH 7,4 at 25 °C) 4 °C'de 1 saat yavaş karıştırarak çalıştırın. 500 mL taze PBS kullanarak diyalizi bir saat daha tekrarlayın.
  3. Biotin etiketleme reaksiyonuna başlayın. Reaksiyondan hemen önce DI suyundaki katı eriterek 2 mM'lik NHS-PEG4-biotin çözeltisi hazırlayın. NHS-PEG4-biotin'in uzun süre suda kalmasına izin vermek, NHS-ester grubunun hidrolize etmesine neden olur ve böylece etiketleme verimliliğini azaltır.
    1. VWF stok çözeltisini içeren diyaliz ünitesine 2,5 mM NHS-PEG4-biotin ekleyin. Bu VWF monomerler ile karşılaştırıldığında biotin 20 kat molar fazlalığı neden olacaktır. VWF'nin birincil aminleri NHS-ester gruplarıile reaksiyona girecek ve bu nedenle anamid bağlantıları yoluyla PEG4-biotin gruplarına kovalent olarak bağlanır.
    2. Diyaliz ünitesini 1,5 mL mikrosantrifüj tüpün içine yerleştirin. Diyaliz ünitesini ilgili kapağı ile kapatın. Tüp diyaliz tertibatını Parafilm ile sabitle. Dik tutun ve 40 dakika oda sıcaklığında bırakın.
  4. Florofor etiketleme reaksiyonu başlatın. Alexa 488 tetraflorofenil ester (TFP-ester) floresan boya (uyarmamax = 498 nm, emisyonmax = 519 nm) 2.8 mM çözeltisi hazırlayın DI suda florofor katı eriterek. TFP-ester grubunun hidrolize etmesini önlemek için reaksiyondan hemen önce bunu yapın.
    1. Diyaliz ünitesine 2,8 mM 488 florofor 2,9 μL ekleyin. Bu vwf monomerler ile karşılaştırıldığında florofor 34 kat molar aşırı neden olacaktır. VWF kalan birincil aminler TFP-ester grupları ile reaksiyona girecek, bu nedenle kovalent amid bağlantıları yoluyla floroforlar için bağlayıcı.
    2. Diyaliz ünitesine 2,0 μL 1 M sodyum bikarbonat (DI suda çözünmüş) ekleyin. Bu, reaksiyonun pH'ını 8.0'a yakın ayarlar, bu da TFP-ester ve primer amin reaksiyonunun verimliliğini artırır.
    3. 1.3.2 adımda olduğu gibi diyaliz ünitesini mikrosantrifüj tüpünde sabitle. Fotobeyaztma önlemek için karanlıkta saklayın ve 1 saat ve 30 dakika oda sıcaklığında bırakın.
  5. Diyaliz ünitesini 900 mL 1x steril PBS'ye yerleştirin ve gece boyunca 4 °C'de diyalize sürün. Bu, 0,71 mg/mL veya 2,84 μM (monomer konsantrasyonu) konsantrasyonunda yaklaşık 70 μL etiketli VWF sağlayacaktır.
  6. VWF etiketli bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Boruyu alüminyum folyo ile kaplayın ve ışıktan koruyun. 4 °C'de saklayın. Uzun süreli depolama için, %0,02 (w/v) son konsantrasyonuna anti-mikrobiyal ajan sodyum azit ekleyin.
    NOT: Protokol burada duraklatılabilir.

2. Lambda DNA'sının Hazırlanması

  1. Biyotinylate lineer lambda DNA uyumlu uç siteleri doldurarak (cos sites) biotin-14-dCTP nükleotitler standart protokollere göre, burada adım 2.118tekrarlanır . Cos sitelerinin geri kalanını dATP, dTTP ve dGTP nükleotidleri ile doldurun.
    1. 10x reaksiyon tamponunda (500 mM sodyum klorür, 100 mM Tris hidroklorür, 100 mM magnezyum klorür, 10 mM dithiothreitol, pH 7.9 25 °C) dATP, dTTP, dGTP ve biotin-14-dCTP 1 mM çözeltisi hazırlayın.
    2. 48 μL 500 ng/μL lambda DNA'sını bir PCR tüpüne yerleştirin ve 65 °C'de 5 dakika ısılayın. Dairesel lambda DNA'sının cos bölgeleri ısı altında ayrılacak, molekülü doğrusallaştıracak ve tek iplikçikli çıkıntıları biyotinylasyona hazır hale getirecek. Hemen sonra, yeniden annealing cos siteleri önlemek için buz üzerine yerleştirin.
    3. Lambda DNA'sına 1 mM dATP, dTTP ve dGTP'nin 5 μL'sini ve 1 mM biotin-14-dCTP'nin 4 μL'sini ekleyin. Ayrıca DNA sentezini katalize etmek için 5 U/μL Klenow Fragment (3'à5' exo-) 2,5 μL ekleyin.
    4. Reaksiyon karışımını 37 °C'de 1 saat kuluçkaya yatırın.
    5. 0,5 M EDTA 1,2 μL ekleyin. Daha sonra reaksiyon karışımını 70 °C'de 5 dk ısıtın. Bu Klenow Parçası ve biyotinylation reaksiyon devre dışı bırakacaktır.
  2. 10-70 μL tutabilen ve 6.000 moleküler ağırlık kesme ye sahip bir spin sütunu kullanarak lambda DNA'sından fazla nükleotitleri çıkarın.
    1. Kolon2 mL mikrosantrifüj tüp içine yerleştirin. 2 dk. 1000 x g'daki kolon ve tüpü santrifüj edin.
    2. Sütun arabelleği adım 2.1.1 aynı reaksiyon arabellek 1x çözüm ile değiştirin. Bunu, sütuna 500 μL 1x arabellek ekleyerek yapın. 1000 x gde 1 dakika santrifüj . Akıştan kurtulun. Bu 2 kez daha tekrarlayın, böylece sütuna toplam 1500 μL eklendi.
    3. Kolonu 1,5 mL mikrosantrifüj tüpe yerleştirin. 2.1.5 adımından sütunun üst katmanına çözümü dikkatlice ekleyin. 1000 x g4 dk için santrifüj .
    4. Mikrocentrifuge tüpünden akış (40-70 μL) toplayın ve pcr tüpüne yerleştirin. Bu saflaştırılmış, biyotinylated lambda DNA içerir.
  3. Etiket lambda DNA floresan YOYO-1 boya ile (uyarmamax = 490 nm, emisyonmax = 509 nm) standart protokollere göre, burada adım 2.3.120tekrarlanır .
    1. YOYO-1 boya ve lambda DNA'sının 1:10'luk temel çifti molar oranına boya ile çözeltihazırlayın. Lambda DNA'sının baz çifti konsantrasyonunun hesaplanması için arınma adımında DNA kaybolmadığını varsayalım. Tam uzunlukta lambda DNA 48.502 baz çifti vardır.
      NOT: Örneğin, adım 2.2.4'ten 50 μL çözelti kurtarıldıysa, 500 μM YOYO-1 boyanın 7,4 μL'sini ekleyin.
    2. Reaksiyonu tamamlamak için çözeltiyi karanlıkta 50 °C'de 2 saat ısıtın.
    3. Boruyu alüminyum folyo ile kaplayın ve ışıktan koruyun. 4 °C'de saklayın. Çözüm artık mikroakışkan cihazlara enjekte edilmeye hazırdır.
      NOT: Protokol burada duraklatılabilir.

3. Silikon gofret mikroakışkan kanal kalıpları oluşturma

  1. Standartprotokolleregöre ana silikon gofret üzerinde uygun boyutlarda mikroakışkan kanallar oluşturmak için fotolitografiyi kullanın (Şekil 2).

4. Polidimethylsiloxane (PDMS) mikroakışkan cihazın hazırlanması

  1. Bir tartma teknede 1 parça kür ajan (kütle ye göre) için 5 parça silikon elastomer tabanı ekleyin. Önceden tedavi edilmiş PDMS çözümü oluşturmak için içindekileri 1 dakika boyunca iyice karıştırın.
  2. Plastik bir Petri kabına ana silikon gofret yerleştirin. 5 mm'lik bir katman oluşturmak için PDMS çözümünü gofretin üzerine dökün. Çanak kapağı ve hava kabarcıkları kaldırmak için 1 saat vakum altında bir kurutucu bırakın.
  3. İnkübasyon, PDMS'yi esnek bir katıya dönüştürmek için bir gecede 60 °C'de Petri kabını kapladı. Kürleme, PDMS-gofret arabiriminde PDMS'ye kalıplanmış mikroakışkan kanallara neden olur.
  4. Bir jilet kullanarak, her mikroakışkan kanalın etrafında, PDMS içine 20 x 10 mm dikdörtgenler kesin. Dikdörtgen PDMS bloklarını cımbızla kaldırın.
  5. Kanalın bir ucunda0,5 mm çapında bir delik delmek için keskinleştirilmiş kenarları olan 25 G künt uç iğnesi kullanın, deliğin PDMS bloğundan tamamen geçtiğinden emin olun(Şekil 2). DELikten PDMS dışarı yumruk için ince bir iğne kullanın. Bunu kanalın diğer ucunda tekrarlayın. Bu kanal üzerinden akış için bir giriş ve çıkış yaratacaktır.
  6. PDMS bloğunun yüzeyini vinil temiz oda bandı ile temizleyin. Enkaz kaldırmak için bir No 1 1/2, 22 x 50 mm coverslip üzerinde sıkıştırılmış azot gazı darbe.
  7. PDMS bloğunu kanal tarafı yukarı ve kapak kapağını plazma yapıştırma makinesinin odasına yerleştirin. Tedaviye başla.
  8. Tedavi tamamlandığında, PDMS bloğunu hızlı bir şekilde bir kapak kaymasına yerleştirin, böylece kanal kaymayla temas halindedir. Bloğun kenarlarıboyunca basınç uygulayın. Coverslip-PDMS tertibatını 115 °C'de 15 dk sıcak bir tabağa yerleştirin ve kalıcı bağı güçlendirin.
  9. PDMS bloğunun üst kısmındaki çıkış deliğine 10 cm uzunluğunda, 0,25 mm iç çaplı boru yerleştirin. Bu, sıvının kanaldan kolayca akmasını sağlar. Cihaz artık tamamlandı.

5. Mikroakışkan cihazın yüzeyinin tedavisi

  1. Enjekte <10 μL 10 μg/mL biyotinylated sığır serum albumin (BSA-biotin) VWF deneyleri için mikroakışkan cihaz girişine steril 1x PBS içinde çözünmüş. Lambda DNA deneyleri için 1 mg/mL BSA-biotin injeks <10 μL. Enjeksiyondan sonra pipet ucunda birkaç mikrolitre BSA-biotin tutun ve ucun girişte gömülü kalmasını bekleyin.
    1. Her zaman ucu etrafında DI su damlacıkları tutun. Bu, hava kabarcıklarının kanala girmesini önler. Kanala her yeni bir çözüm enjekte edişişsinde bu tekniği uygulayın.
    2. BSA-biotin'in cihazda 2 saat kuluçkaya yatmasını bekleyin. BSA özellikle kapak yüzeyine bağlanır (Şekil 3A).
  2. Pipet ucunu çıkarın. Kanala <10 μL kazein engelleme çözeltisi enjekte edin ve 30 dakika kuluçkaya yatmasını bekleyin. Kazein herhangi bir serbest alanı bloke eder ve biyomoleküllerin yüzeye spesifik olmayan bağlanmasını azaltır (Şekil 3B).
  3. VWF deneyleri için kanala steril 1x PBS'de çözünmüş 10 μg/mL streptavidinin ucunu çıkarın ve enjekte edin.lt;10 μL. Lambda DNA deneyleri için 100 μg/mL streptavidin kullanın. 10 dakika kuluçka. Streptavidin BSA-biotin biyotin gruplarına bağlanır (Şekil 3C).
  4. Fazla streptavidini temizlemek için ucunu çıkarın ve 1x deterjan çözeltisinin <10 μL'sini (%0,05 PBS'de %0,05 Ara 20) kanala enjekte edin.
  5. Kazein çözeltisinde seyreltilmiş 28,4 nM VWF'nin veya lambda DNA'sının 2.3.3 adımdan ucunu çıkarın ve enjekte edin.lt;10 μL. 3 dk. Incubate lambda DNA için 3 dk. 45 dk (Şekil 3D) için TÜPLÜ VWF .
  6. Kazein çözeltisinde seyreltilmiş 5 mM içermeyen biotinin ucunu çıkarın ve 10 μL enjekte edin. Serbest biotin kanal yüzeyinde aşırı streptavidin bağlayıcı siteleri engelleyecektir (Şekil 3E).

6. VWF ve Lambda DNA'sını floresan mikroskopi altında görselleştirme

  1. 2,2 mM protocatechuic asit ve 37 nM protocatechuate-3,4-dioxygenase (fotobeyazrlamayı en aza indirmek için) ile 1 mL kazein engelleme çözeltisi hazırlayın. Bir şırınga içine yük ve bir şırınga pompası güvenli. 30 cm uzunluğunda, 0,25 mm iç çaplı boru alın ve bir ucunu şırınga iğnesine takın. Hava kabarcıkları kaldırmak için çözelti akışı. Tüpün diğer ucunu mikroakışkan cihazın girişine takın. Bu adım 5.6 sonra 3 dakika bunu yapmak için tavsiye edilir.
  2. Toplam iç yansımanın (TIRF) veya konfokal floresan mikroskobunun en yüksek büyütme hedefini (örn. 60-100X) seçin. Gerekirse amacına bir damla daldırma yağı ekleyin. Mikroakışkan cihazı mikroskop aşamasına yerleştirin, böylece kapak kayması hedefe doğru sifonu çeksin.
  3. Brightfield mikroskobu başla. Odak noktasını, enkaz ve kabarcıklar gibi tüm özelliklerin görünür olması için ayarlayın. Daha sonra mikroakışkan kanalın kenarı görünene ve çerçeveyi ikiye bölene kadar X ve Y yönünde sahneyi ayarlayın.
  4. 488 kanala (FITC) geçin. Bireysel yeşil, küresel moleküller ayırt edilebilir kadar gerektiği gibi Z seviyesi ve TIRF açısı ayarlayın. Bunlar ya VWF ya da lambda DNA molekülleridir.
  5. Floresan molekülleri çok hızlı bir şekilde fotobeyazlama yapmadan görselleştirmek için pozlama süresini ve lazer yoğunluğunu ayarlayın. Molekülleri daha net görselleştirmek için kontrastı ayarlayın.
  6. Şırınga pompasından akış başlatın, böylece kazein engelleme çözeltisi kanala ve prizin dışına akar. Bunu adım 5.6'dan tam olarak 5 dakika sonra yapın. Moleküllerin konformasyonundaki değişiklikleri gözlemlemek için akışı durdurun ve başlatın. Akış uygulanırken, 5.000 ile 30.000 μL/sa arasındaki kullanım oranları. Durdurma ve başlangıç akışı birden fazla döngü üzerinde genişletmek ve dinlenmek molekülleri bulmak için bu süreci devam edin.
  7. Moleküllerin maksimum uzantıya ulaşmasının ve globüllerin içine tamamen gevşemenin ne kadar sürdüğünü unutmayın. Kesme akışı altındaki moleküllerin sürekli davranışlarının videolarını kaydedin, en iyi pozlama süresini, pozlama sıklığını ve tüm uzantılarını yakalayacak ve fotobeyaztlatma işlemini en aza indirecek video süresini seçin.
  8. Videoları ' olarak kaydet. Bir ölçek çubuğu ile AVI dosyaları.
    NOT: Protokol burada duraklatılabilir.

7. Konformasyonel değişikliklerin görüntü analizi

  1. Dikdörtgen mikroakışkan kanalınfigure-protocol-1akış hızı (Q) ve yüksekliği(h)ve genişlik(w)kullanılarak makromoleküllere uygulanan duvar kesme hızını hesaplayın. Bunu yapmak için aşağıdaki denklemi kullanın:
    figure-protocol-2
  2. Özelleştirilmiş bir MATLAB kodu kullanarak çeşitli kesme oranları altında herhangi bir biyomolekülün uzunluğunu belirleyin (Bkz. Ek Dosyalar). Aşağıdaki MATLAB kodlarını içeren video analizi başlıklı bir klasör oluşturun: main.m, save_each_frame.m, get_length.m ve get_length.fig. Video analizi başlıklı videolar içinde bir alt klasör oluşturun ve ekleyin. AVI dosyaları içine analiz edilecek.
  3. MATLAB 2019a kullanarak main.m'yi açın ve kodu çalıştırın. Komut penceresinde çözümlenecek video dosyasının adını yazın Lütfen analiz etmek için veri dosyasını girdin:.
  4. Açılan grafik kullanıcı arabiriminde (GUI), eşiği (pencerenin sağ üst kısmındaki kutudaki metin) 20'ye ayarlayın ve onaylamak için Ayarla eşiğini tıklatın.
  5. Ölçek çubuğunda herhangi bir yerde bir piksel seçmek için pencerenin üst araç çubuğunda veri imleci kullanın. Pencerenin sağındaki Ölçek çubuğu bölümünde Başlangıç noktasını tıklatın. Seçilen pikselin (x,y) konumu düğmenin sağında görünür. Piksel boyutu (μm) düğmesine tıklayın. Piksel boyutu her videoda yalnızca bir kez ölçülebilir.
  6. İlgi molekülündeki herhangi bir pikseli seçin. VWF bölümündeki Başlangıç noktasına tıklayın. Seçilen pikselin konumu sağdaki metin kutusunda göründükten sonra, görüntüdeki moleküler uzunluğu elde etmek için Sol uç, Sağ uç ve String uzunluğunu tıklatın.
    NOT: Bu adım, kodun VWFadlı belirli bir bölümü olmasına rağmen, herhangi bir biyomolekülün konformasyonel değişikliklerini analiz etmek için kullanılabilir.
  7. Molekülün sol ve sağ ucunu iki kez kontrol edin. Yakınlaştırın ve ilgi alanının piksel konumunu kontrol etmek için veri imlecini kullanın. Pikseli el ile son olarak seçin ve gerektiğinde uzunluğu (piksel olarak) yeniden hesaplayın.
  8. Piksel boyutunu μm ve dize uzunluğu yla piksel sayısı olarak bir Excel sayfasına kaydedin ve dize uzunluğunu μm olarak hesaplayın.
  9. Her görüntü için yukarıdaki adımları tekrarlayın. Gui'nin sağ alt köşesindeki Son, Sonraki düğmesini kullanarak aynı video dosyasındaki görüntüler arasında geçiş yapın. GUI penceresini kapatmak için Kapat'ı tıklatın.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

VWF ve lambda DNA gibi biyomoleküllerin dinamik davranışlarını gözlemlemek cihaz yüzeyine bağlanmalarını optimize etmeye son derece bağlıdır. Mikroakışkan cihazda önerilen süreler için yüzey tedavileri inkübasyon birkaç ankraj noktaları ile bağlayıcı elde etmek için çok önemlidir, böylece moleküller serbestçe genişletmek ve akış değişen üzerine dinlenmek. Proteinler veya DNA birden fazla bağlantı ile çok güçlü bir şekilde bağlı ise, ya sınırlı uzunluklara kadar uzatır ya da hiç uzatmak değil. Bu, özellikle VWF ile cihaz ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu yöntemde açıklandığı gibi floresan mikroskobu kullanılarak tek moleküllü konformasyonel değişikliklerin yüksek kaliteli veri elde etmek için, molekülü uygun süre için kuluçkaya yatırmak, yüzeyle nonspesifik etkileşimlerini en aza indirmek çok önemlidir. ve fotobeyaztlamayı azaltan mikroskop ayarlarını kurun. Molekülün konformasyonu serbestçe değiştirebilme yeteneği, molekül ile yüzey arasında oluşan biyotin-streptavidin etkileşimlerinin sayısı ile ilgilidir. Daha önce de belirtildiği gibi, bu zaman uygun miktarda akış...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar hiçbir rakip çıkarları beyan.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma kısmen Ulusal Bilim Vakfı hibe DMS-1463234, Ulusal Sağlık Enstitüleri HL082808 ve AI133634 hibe ve Lehigh Üniversitesi iç finansman tarafından desteklenmiştir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Alexa Fluor 488 Etiketleme KitiInvitrogenA30006
Bio-Spin P-6 Jel SütunlarBio-Rad7326221
BiotinSigma-AldrichB4501Adım 5.6'da serbest biyotin olarak kullanın
Biotin-14-dCTPAAT Bioquest17019
BSA-BiotinSigma-AldrichA8549
LamellerVWR48393-195No. 1 ½, 22 x 50 mm
dNTP MiniInvitrogen
Şamandıra ŞamandıralarıThermo Scientific69588
Klenow Parçası (3'→ 5' exo-)New England BioLabsM0212SAdım 2.1.1'de 10X reaksiyon tamponu ve Adım 2.2.2'de 1X reaksiyon tamponu için kullanın
Lambda DNANew England BioLabsN3011S
Mini Diyaliz CihazıThermo Scientific6957010K MWCO, 0.1 mL hacim
NEBuffer 4New England BioLabsB7004S
NHS-PEG4-BiotinThermo Scientific21330
Protocatechuate 3,4-DioksijenazSigma-AldrichP8279
Protocatechuic asitSanta Cruz Biyoteknolojisc-205818
PDMS İmalatı için Silikon Elastomer KitiDow Chemical Company4019862
StreptavidinSigma-Aldrich85878
Engelleme ÇözümüCANDOR Bioscience110 050Protokol boyunca kazein bloke edici çözelti olarak kullanın
Vinil Temiz Oda BandıFisher Scientific19-120-3217
von Willebrand Faktörü, İnsan PlazmaMillipore Sigma681300
YOYO-1 BoyaAAT Bioquest17580
0.25 mm İç Çap BoruCole-ParmerEW-06419-00
25 Ölçer İğneThomas BilimselJG2505X
Diyaliz Cihazı için 10297018

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Shaqfeh, E. S. The dynamics of single-molecule DNA in flow. Journal of Non-Newtonian Fluid Mechanics. 130 (1), 1-28 (2005).
  2. Smith, D. E., Babcock, H. P., Chu, S. Single-polymer dynamics in steady shear flow. Science. 283 (5408), 1724-1727 (1999).
  3. LeDuc, P., Haber, C., Bao, G., Writz, D. Dynamics of individual flexible polymers in a shear flow. Nature. 399 (6736), 564-566 (1999).
  4. Huber, B., Harasim, M., Wunderlich, B., Kröger, M., Bausch, A. R. Microscopic Origin of the Non-Newtonian Viscosity of Semiflexible Polymer Solutions in the Semidilute Regime. ACS Macro Letters. 3 (2), 136-140 (2014).
  5. Springer, T. A. Biology and physics of von Willebrand factor concatamers. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 9, 130-143 (2011).
  6. Springer, T. A. von Willebrand factor, Jedi knight of the bloodstream. Blood. 124 (9), 1412-1425 (2014).
  7. Merchant, K. A., Best, R. B., Louis, J. M., Gopich, I. V., Eaton, W. A. Characterizing the unfolded states of proteins using single-molecule FRET spectroscopy and molecular simulations. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (5), 1528-1533 (2007).
  8. Neuman, K. C., Nagy, A. Single-molecule force spectroscopy: optical tweezers, magnetic tweezers and atomic force microscopy. Nature Methods. 5 (6), 491-505 (2008).
  9. Siedlecki, C. A., et al. Shear-dependent changes in the three-dimensional structure of human von Willebrand factor. Blood. 88 (8), 2939-2950 (1996).
  10. Roiter, Y., Minko, S. AFM single molecule experiments at the solid-liquid interface: In situ conformation of adsorbed flexible polyelectrolyte chains. Journal of the American Chemical Society. 127 (45), 15688-15689 (2005).
  11. Aznauryan, M., et al. Comprehensive structural and dynamical view of an unfolded protein from the combination of single-molecule FRET, NMR, and SAXS. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (37), 5389-5398 (2016).
  12. Schuler, B., Eaton, W. A. Protein folding studied by single-molecule FRET. Current Opinion in Structural Biology. 18 (1), 16-26 (2008).
  13. Howorka, S., Siwy, Z. Nanopore analytics: sensing of single molecules. Chemical Society Reviews. 38 (8), 2360-2384 (2008).
  14. Talaga, D. S., Li, J. Single-molecule protein unfolding in solid state nanopores. Journal of the American Chemical Society. 131 (26), 9287-9297 (2009).
  15. Moerner, W. E., Fromm, D. P. Methods of single-molecule fluorescence spectroscopy and microscopy. Review of Scientific Instruments. 74 (8), 3597-3619 (2003).
  16. Xia, T., Li, N., Fang, X. H. Single-Molecule Fluorescence Imaging in Living Cells. Annual Review of Physical Chemistry. 64, 459-480 (2013).
  17. Fu, H., et al. Flow-induced elongation of von Willebrand factor precedes tension-dependent activation. Nature Communications. 8 (324), 1-12 (2017).
  18. Smith, S. B., Cui, Y., Bustamante, C. Overstretching B-DNA: The Elastic Response of Individual Double-Stranded and Single-Stranded DNA Molecules. Science. 271 (5250), 795-799 (1996).
  19. Wang, Y., et al. Shear-Induced Extensional Response Behaviors of Tethered von Willebrand Factor. Biophysical Journal. 116 (11), 29092(2019).
  20. Carlsson, C., Johnsson, M., Åkerman, B. Double bands in DNA gel electrophoresis caused by bis-intercalating dyes. Nucleic Acids Research. 23 (13), 2413-2420 (1995).
  21. Collins, B. E., Ye, L. F., Duzdevich, D., Greene, E. C. DNA curtains: Novel tools for imaging protein–nucleic acid interactions at the single-molecule level. Methods in Cell Biology. 123, 217-234 (2014).
  22. Green, E. C., Wind, S., Fazio, T., Gorman, J., Visnapuu, L. DNA Curtains for High-Throughput Single-Molecule Optical Imaging. Methods in Enzymology. 472, 293-315 (2010).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Fluorescence MicroscopyShear FlowSingle MoleculeMicrofluidic ChannelsTotal Internal ReflectionConfocal MicroscopyVon Willebrand FactorLambda DNABiotin StreptavidinSyringe Pump

Related Articles