Method Article

Floresan Mikroskopi ile Kesme Akışı Altında Tek Moleküllü Konformasyonel Değişikliklerin Karakterizasyonu

DOI:

10.3791/60784

⸱

January 25th, 2020

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Bioengineering, Lehigh University, 2Department of Materials Science and Engineering, Lehigh University, 3Department of Chemistry, Lehigh University, 4Department of Mechanical Engineering and Mechanics, Lehigh University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tek makromoleküllerin mikroakışkan cihazlarda immobilize edilebisi ve konformasyonlarındaki değişiklikleri kesme akışı altında ölçen bir protokol sayılmısAk. Bu protokol, bir akış ortamında proteinler ve DNA gibi biyomoleküllerin biyomekanik ve fonksiyonel özelliklerini karakterize etmek için yararlıdır.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mekanik tedirginlik altında tek moleküllü davranış birçok biyolojik süreçleri anlamak için yaygın olarak karakterize edilmiştir. Ancak, atomik kuvvet mikroskobu gibi yöntemler insidansı sınırlı zamansal çözünürlüğe sahipken, Förster rezonans enerji transferi (FRET) sadece konformasyonların çıkarılsın. Floresan mikroskopi, diğer taraftan, çeşitli akış koşullarında tek moleküllerin yerinde görselleştirme gerçek zamanlı sağlar. Protokolümüz, floresan mikroskobu kullanarak farklı kesme akış ortamları altında tek biyomoleküllerin konformasyonel değişikliklerini yakalama adımlarını açıklamaktadır. Kesme akışı mikroakışkan kanallar içinde oluşturulur ve bir şırınga pompası tarafından kontrol edilir. Yöntemin gösterimleri olarak von Willebrand faktörü (VWF) ve lambda DNA'sı biotin ve florofor ile etiketlenir ve kanal yüzeyinde hareketsiz hale getirilmiştir. Konformasyonları toplam iç yansıma (TIRF) ve konfokal floresan mikroskopisi kullanılarak değişken kesme akışı altında sürekli olarak izlenir. VWF'nin geri dönüşümlü çözülme dinamikleri, işlevinin insan kanında nasıl düzenlendiğini anlamak için yararlıdır, lambda DNA'sının konformasyonu ise makromoleküllerin biyofiziği hakkında öngörüler sunar. Protokol aynı zamanda polimerlerin, özellikle de biyopolimerlerin, değişen akış koşullarındaki davranışlarını incelemek ve karmaşık sıvıların reolojisini araştırmak için de yaygın olarak uygulanabilir.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biyomoleküllerin çevresel uyaranlara nasıl tepki verecek mekanizmaları geniş ölçüde incelenmiştir. Özellikle bir akış ortamında, kesme ve uzama kuvvetleri konformasyonel değişiklikleri ve potansiyel olarak biyomoleküllerin işlevini düzenler. Tipik örnekler lambda DNA ve von Willebrand faktörü (VWF) kesme kaynaklı çözülme içerir. Lambda DNA bireysel, esnek polimer zincirleri ve polimer çözeltileri1,2,3,4reolojikonformasyon dinamikleri anlamak için bir araç olarak kullanılmıştır. VWF anormal kesme hızları ve akış desenleri ile kan damarlarının....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. VWF Hazırlama

  1. Etiketleme reaksiyonları için hazırlamak için insan plazmavwf yeniden. 1 mg/mL VWF stok çözeltisi oluşturmak için 100 μL deiyonize (DI) suyu 100 μg lyophilized VWF ekleyin.
  2. Aşırı glisini gidermek için VWF stok çözeltisini diyalize çevirin, bu nedenle biyotin ve florofor etiketleme verimliliğini artırın.
    1. VWF stok çözeltisinin 50 μL'sini 10.000 moleküler ağırlık kesme ve kapaklı mühürleme ile 0,1 mL diyaliz ünitesine aktarın. Kalan stok çözeltisini -20 °C'de saklayın. VWF stoku -20 °C'de 1 yıla kadar stabil olacaktır.
    2. Diyalizi 500 mL 1x steril fosfat tamponlu salin (PBS) (0,01 M disodyum fosfat, 0,0018 monopotasyum....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

VWF ve lambda DNA gibi biyomoleküllerin dinamik davranışlarını gözlemlemek cihaz yüzeyine bağlanmalarını optimize etmeye son derece bağlıdır. Mikroakışkan cihazda önerilen süreler için yüzey tedavileri inkübasyon birkaç ankraj noktaları ile bağlayıcı elde etmek için çok önemlidir, böylece moleküller serbestçe genişletmek ve akış değişen üzerine dinlenmek. Proteinler veya DNA birden fazla bağlantı ile çok güçlü bir şekilde bağlı ise, ya sınırlı uzunluklara kadar uzatır ya da hiç uzatmak değil. Bu, özellikle VWF ile cihaz .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu yöntemde açıklandığı gibi floresan mikroskobu kullanılarak tek moleküllü konformasyonel değişikliklerin yüksek kaliteli veri elde etmek için, molekülü uygun süre için kuluçkaya yatırmak, yüzeyle nonspesifik etkileşimlerini en aza indirmek çok önemlidir. ve fotobeyaztlamayı azaltan mikroskop ayarlarını kurun. Molekülün konformasyonu serbestçe değiştirebilme yeteneği, molekül ile yüzey arasında oluşan biyotin-streptavidin etkileşimlerinin sayısı ile ilgilidir. Daha önce de belirtildiği gibi, bu zaman uygun miktarda akış.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar hiçbir rakip çıkarları beyan.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma kısmen Ulusal Bilim Vakfı hibe DMS-1463234, Ulusal Sağlık Enstitüleri HL082808 ve AI133634 hibe ve Lehigh Üniversitesi iç finansman tarafından desteklenmiştir.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Alexa Fluor 488 Etiketleme KitiInvitrogenA30006
Bio-Spin P-6 Jel SütunlarBio-Rad7326221
BiotinSigma-AldrichB4501Adım 5.6'da serbest biyotin olarak kullanın
Biotin-14-dCTPAAT Bioquest17019
BSA-BiotinSigma-AldrichA8549
LamellerVWR48393-195No. 1 ½, 22 x 50 mm
dNTP MiniInvitrogen
Şamandıra ŞamandıralarıThermo Scientific69588
Klenow Parçası (3'→ 5' exo-)New England BioLabsM0212SAdım 2.1.1'de 10X reaksiyon tamponu ve Adım 2.2.2'de 1X reaksiyon tamponu için kullanın
Lambda DNANew England BioLabsN3011S
Mini Diyaliz CihazıThermo Scientific6957010K MWCO, 0.1 mL hacim
NEBuffer 4New England BioLabsB7004S
NHS-PEG4-BiotinThermo Scientific21330
Protocatechuate 3,4-DioksijenazSigma-AldrichP8279
Protocatechuic asitSanta Cruz Biyoteknolojisc-205818
PDMS İmalatı için Silikon Elastomer KitiDow Chemical Company4019862
StreptavidinSigma-Aldrich85878
Engelleme ÇözümüCANDOR Bioscience110 050Protokol boyunca kazein bloke edici çözelti olarak kullanın
Vinil Temiz Oda BandıFisher Scientific19-120-3217
von Willebrand Faktörü, İnsan PlazmaMillipore Sigma681300
YOYO-1 BoyaAAT Bioquest17580
0.25 mm İç Çap BoruCole-ParmerEW-06419-00
25 Ölçer İğneThomas BilimselJG2505X
Diyaliz Cihazı için 10297018

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Shaqfeh, E. S. The dynamics of single-molecule DNA in flow. Journal of Non-Newtonian Fluid Mechanics. 130 (1), 1-28 (2005).
  2. Smith, D. E., Babcock, H. P., Chu, S. Single-polymer dynamics in steady shear flow. Science. 283 (5408), 1724-1727 (1999).
  3. LeDuc, P., Haber, C.,....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Fluorescence MicroscopyShear FlowSingle MoleculeMicrofluidic ChannelsTotal Internal ReflectionConfocal MicroscopyVon Willebrand FactorLambda DNABiotin StreptavidinSyringe Pump

Related Articles