İntravital mikroskopiden yararlanan burada sunulan yöntem, canlı hayvanlarda bağırsak epitel hücresi dökülmesinin gerçek zamanlı olarak görüntülenmesidir. Bu nedenle anestezili farelerin topikal lekeli bağırsak mukozası (acriflavine ve rhodamineB-dextran) konfokal mikroskopi kullanılarak tek hücreçözünürlüğe kadar görüntülenir.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
İntravital Mikroskopi Tabanlı Bir Yaklaşım Bağırsak Geçirgenliği ve Epitel Hücre Dökülme Performansını Değerlendirmek için
* These authors contributed equally
Bu makalede
Özet
Özet
Konfokal görüntüleme ile bağırsağın intravital mikroskobu, canlı hayvanlarda epitel hücre dökülmesi ve bariyer kaçağının gerçek zamanlı olarak gözlemlenmesine olanak sağlar. Bu nedenle, anestezik farelerin bağırsak mukozası topikal olarak spesifik olmayan boyama (acriflavine) ve floresan izleyici (rhodamine-B dextran), tuzlu çözelti-durulanmış plaka üzerine monte ve doğrudan bir konfokal mikroskop kullanılarak görüntülenmiştir. Bu teknik, ağızdan uygulanan izleyicilerin transmukozal geçişi gibi bağırsak geçirgenliğinin sızıntısını belirlemek için diğer non-invaziv teknikleri tamamlayabilir. Bunun yanı sıra, burada sunulan yaklaşım gerçek zamanlı olarak hücre dökülme olayları doğrudan gözlem sağlar. Uygun floresan muhabir fareler ile birlikte, bu yaklaşım hücresel ve moleküler mekanizmalar bağırsak epitel hücre ekstrüzyon kontrol içine ışık dökülmesi için uygundur, yanı sıra diğer biyolojik süreçler. Son yıllarda, intravital mikroskopi kullanarak ilginç çalışmalar endotel geçirgenliği hakkında bilgi katkıda bulunmuştur, bağışıklık hücresi bağırsak homing, bağışıklık-epitel iletişim ve luminal bileşenlerin invazyonu, diğerleri arasında. Burada sunulan protokol, sadece epitel hücre ekstrüzyonunu kontrol eden mekanizmaların anlaşılmasına yardımcı olmakla kalmıyor, aynı zamanda diğer dokularda bile diğer son derece dinamik hücresel süreci görselleştirmek için araç olarak kullanılacak diğer yaklaşımların gelişimsel temelini de oluşturacaktır. Teknik sınırlamalar arasında, belirli dokunun optik özelliklerinin yanı sıra seçilen görüntüleme teknolojisi ve mikroskop yapılandırması da görüntüleme çalışma mesafesini ve edinilmiş görüntülerin çözünürlüğünü belirleyecektir.
Giriş
Bağırsak, çatışan süreçleri sağlayan sıkı bir şekilde düzenlenmiş bir işlevi olan son derece uzmanlaşmış bir organdır, yani beslenme ve zararlı luminal maddelere karşı koruma. Insan vücudu ve çevre arasında astar, bağırsak epitel fiziksel ve immünolojik bariyer olarak davranır ve bağırsakta mukozal homeostaz bakımına katkıda bulunur1,2. Epitel bütünlüğü kaybı ve artan sıkı kavşak geçirgenliği iyi Inflamatuar Barsak Hastalığı ile ilişkili olduğu bilinmektedir (IBD)3,4,5,6. Epitel deği....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Aşağıdaki protokol Erlangen'deki ilgili yerel makamlar tarafından onaylanmıştır (Regierung von Unterfranken, Würzburg, Almanya). Fareler belirli patojeniçermeyen koşullar altında barındırıldı.
NOT: IEC'lerde GGTase aracılı prenilasyonin inhibisyonu Pggt1biΔIEC farelerde bağırsak geçirgenliğinin ciddi bir değişimine neden olur24. Bu nedenle, bu fare modeli protokolün bağırsak bariyeri defektlerini incelemek için nasıl yararlı olabileceğini göstermek için kullanılmıştır. Ancak, bu protokol başka bir fare satırının çalışması için kullanılabilir.
1. Cerrahi hazırlık ve fare b....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Burada sunulan protokol, bağırsak epitel kaçağı görselleştirmek ve gerçek zamanlı olarak bağırsakta hücre dökülme performansını gözlemlemek için intravital mikroskopi tabanlı bir yaklaşım açıklar. Kısaca, fareler anestezi ve ince bağırsak mukoza yüzeyini ortaya çıkarmak için cerrahi hazırlık teslim edilir. IEC'ler daha sonra acriflavine topikal uygulama ile boyanır; luminal rhodamine B-dextran lümenden alt epitel uzaya transmukozal geçişi tespit etmek için izleyici olarak kullanılırken. B.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Teknik olarak zorlu olsa da, intravital mikroskopi tabanlı metodoloji, hücre dökülme performansı gibi son derece dinamik hücresel süreci gerçek zamanlı olarak görselleştirmek için benzersiz bir deneysel yaklaşımı temsil eder. Şimdiye kadar hücre ekstrüzyonunu in vivo görselleştirmek için alternatif bir deneysel yaklaşım yoktur. Bu protokolün bağırsak homeostazının korunmasında rol oynayan çeşitli hücresel süreçlerin tanımlanmasına katkıda bulunabileceğine inanıyoruz.
İntravital mikroskopiden y.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Teşekkürler
Bu sonuçlara yol açan araştırma, Avrupa Birliği'nin Yedinci Çerçeve Programı'nın (FP7/2007-2013) 302170 sayılı REA hibe anlaşması kapsamında İnsan Programı'ndan (Marie Curie Eylemleri) fon almıştır; Erlangen-Nürnberg Üniversitesi Disiplinlerarası Klinik Araştırma Merkezi (İZKF); Ortak Araştırma Merkezi TRR241 ve Alman Araştırma Konseyi'nin (DFG) KFO257 Klinik Araştırma Grubu; ve DFG.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Akriflavin hidroklorür | Sigma Aldrich | A8251 | içinde 1 mg / mL çözelti |
| BrainTree | B-DP-PAD-Gemini | ||
| Koter Sistemi | BrainTree | B-GEM-5917-Ketamin | |
| WDT | 9089.01.00 | ||
| LAS X | Leica | - | |
| LSM mikroskobu SP8 | Leica | - | |
| PBS | Biochrom | L182 | |
| Rhodamine B dekstran | Invitrogen | D1824 | 10.000 kDa MW; 2 mg / mL çözelti |
| Standart forseps (Dumont SS) | Güzel Bilim Araçları | 11203-23-Düz | |
| ince makas | Güzel Bilim Araçları | 14060-10-Tamoksifen | |
| Sigma Aldrich | T5648 | 50 mg / mL içinde etanol | |
| Ksilazin | Bayer | 1320422 |
Kaynaklar
- Buhner, S., et al. Genetic basis for increased intestinal permeability in families with Crohn's disease: role of CARD15 3020insC mutation? Gut. 55 (3), 342-347 (2006).
- Pastorelli, L., De Salvo, C., Mercado, J. R., Vecchi, M., Pizarro, T. T.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
