Yöntem makalesi

Clostridioides difficile için Larva Zebrabalığı Enfeksiyon Modeli nin Geliştirilmesi

DOI:

10.3791/60793

⸱

14 Şubat 2020

 ,  ,  ,  , 
1Division of Cellular and Molecular Neurobiology, Zoological Institute, Technische Universität Braunschweig, 2Department of Molecular Biotechnology, Turkish-German University, 3Institut für Mikrobiologie, Technische Universität Braunschweig, 4Braunschweig Integrated Centre of Systems Biology, 5Helmholtz Centre for Infection Research

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada mikroenjeksiyon ve noninvaziv mikrogavaj ile floresan olarak etiketlenmiş anaerobik C. difficile ile zebra balığı larvaları enfekte etmek için güvenli ve etkili bir yöntemdir.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Clostridioides difficile enfeksiyonu (CDI) Amerika Birleşik Devletleri'nde en yaygın sağlık ilişkili gastrointestinal enfeksiyonlardan biri olarak kabul edilir. C. difficile karşı doğuştan gelen bağışıklık yanıtı tanımlanmıştır, ancak CDI nötrofiller ve makrofajlar tam rolleri daha az anlaşılmaktadır. Mevcut çalışmada, Danio rerio (zebrabalığı) larvaları in vivo bu doğuştan gelen bağışıklık hücrelerinin davranış ve işbirliği görüntüleme için bir C. difficile enfeksiyon modeli oluşturmak için kullanılır. C. difficileizlemek için, floresan boya kullanılarak bir etiketleme protokolü kurulmuştur. Lokalize enfeksiyon, zebra balığı nın bağırsak sisteminde aktif olarak yetişen ve CDI'deki intestinal epitel hasarı taklit eden C. difficile etiketli mikroenjeksiyon ile elde edilir. Ancak, bu doğrudan enfeksiyon protokolü invaziv ve deneysel sonuçları etkileyebilir mikroskobik yaralar, neden olur. Bu nedenle, daha noninvaziv bir mikrogavage protokolü burada açıklanmıştır. Yöntem açık ağız yoluyla entübasyon yoluyla doğrudan zebrabalığı larvaları bağırsak içine C. difficile hücrelerinin teslim içerir. Bu enfeksiyon yöntemi yakından C. difficiledoğal enfeksiyon rotasını taklit eder.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

C. difficile bir gram-pozitif, spor oluşturan, anaerobik, ve gastrointestinal sistemde ciddi enfeksiyonların önde gelen nedeni dir toksin üreten bacillus1. CDI tipik belirtileri ishal dahil, karın ağrısı, ve ölümcül psödomembranöz kolit, ve bazen ölüme yol açabilir1,2. Kanıtlar, konak immün yanıtların bu hastalığın hem ilerlemesinde hem de sonuçlarında kritik bir rol oynadığını göstermiştir3. Bağışıklık yanıtına ek olarak, yerli bağırsak mikrobiyota başlangıcı ve CDI patogenezi için çok önemlidir4. Son on yılda, c. difficile (BI/NAP1/027)5,6hipervirulent suşu ortaya çıkması nedeniyle olgu ların sayısı ve CDI mortalite oranı önemli ölçüde artmıştır. Altta yatan bağışıklık mekanizmaları ve CDI sırasında mikrobiyota rolünün daha iyi anlaşılması yeni terapötik gelişmelere ve gelişmelere yol açacaktır, Bu salgının daha iyi kontrol sağlayan.

Hamster ve fare gibi çeşitli hayvan modelleri, C. difficilekarşıbağışıklık savunma içine fikir sağlamak için geliştirilmiştir7 ,8. Ancak, doğuştan gelen bağışıklık hücrelerinin rolü hala kötü anlaşılmaktadır, özellikle doğuştan gelen bağışıklık hücresi davranışı ağırlıklı olarak histolojik analiz veya in vitro kültürlü hücrelerden türetilmiştir beri. Bu nedenle, canlı bir omurgalı organizmanın içinde C. difficile doğuştan gelen bağışıklık yanıtı ortaya çıkarmak için şeffaf bir zebrabalığı modeli kurulması bu tür çalışmaları kolaylaştıracaktır. Zebra balığı larvaları fonksiyonel doğuştan gelen bağışıklık sistemine sahiptir, ancak döllenmeden 4-6 hafta sonraya kadar adaptif bağışıklık sistemiyoktur. Bu benzersiz özellik zebra balığı larvaları CDI izole yanıt ve doğuştan gelen bağışıklık hücrelerinin fonksiyonu çalışma için mükemmel bir model yapar.

Bu rapor, makrofajlar ve nötrofiller gibi C. difficile ve doğuştan gelen bağışıklık hücreleri arasındaki etkileşimleri incelemek için zebra balığı larvaları kullanarak yeni yöntemler açıklamaktadır. İlk olarak, C. difficile inokül ve boyama içeren lokalize bir mikroenjeksiyon protokolü sunulmuştur. İn vivo konfokal zaman atlamalı görüntüleme kullanılarak nötrofillerin ve makrofajların enfeksiyon bölgesine tepkisi kaydedilir ve nötrofiller ve makrofajlar tarafından bakterilerin fagositozisi gözlenir. Ancak, enjeksiyon kendisi doku hasarına neden olduğu bildirilmiştir ve bakteri bağımsız lökosit işe yol açar10. Bu nedenle, zebrabalığı larvalarının bağırsağı içine C. difficile teslim etmek için noninvaziv bir mikrogavaj protokolü daha sonra açıklanmıştır. Önceki çalışmalar yerli gastrointestinal mikrobiyota C. difficile11kolonizasyonuna karşı bir konak korumak göstermiştir. Bu nedenle, gnotobiyotik zebra balığı larvaları da enfekte zebra balığı yatkınlık için kullanılır 12. Daha sonra, bağırsak diseksiyonu uygun C. difficile kurtarmak ve zebrabalığı bağırsak larında varlığının süresini doğrulamak için yapılır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada açıklanan tüm hayvan işleri yasal düzenlemelere uygun olarak gerçekleştirilmiştir (AB Direktifi 2010/63, lisans AZ 325.1.53/56.1-TUBS ve lisans AZ 33.9-42502-04-14/1418).

1. Düşük Eritme Agarose, Jel Levha ve Mikroenjeksiyon/Mikrogavaj İğnelerinin Hazırlanması

  1. 0.08 g düşük eriyen agarose(Malzeme Tablosu, agarose A2576) 10 mL danieau'nun orta (0.12 mM MgSO4, 0.18 mM Ca [NO3]2), 0.21 mM KCl, 1,5 mM HEPES (pH = 7,2) ve 17,4 mM NaCl, oda sıcaklığında (RT) %0,8 çözelti elde etmek için depolanır.
    NOT: Agarose'un daha yüksek veya daha düşük konsantrasyonları kullanılabilir. Ancak, katılaşmak için gerekli zaman agarose farklı markalar için değişir, aynı konsantrasyonda bile.
  2. Cam kılcal damarlardan mikroenjeksiyon ve mikrogavaj iğneleri hazırlayın(Malzeme Tablosu).
    1. Aşağıdaki ayarlara sahip bir mikropipet çekmecesi kullanın (birimlerin burada kullanılan çekmeceye özel olduğunu unutmayın; bkz. Malzeme Tablosu):mikroenjeksiyon iğneleri (hava basıncı = 500; ısı = 400; pull = 125; hız = 75; zaman = 150); ve mikrogavaj iğneleri (hava basıncı = 500; ısı = 400; çekme = 100; hız = 75; zaman = 150). Çekilen iğneye 3 μL nükleaz içermeyen H2O yüklemek için mikroyükleyici ucu kullanın.
    2. İğneyi enjektöre tanıtın ve düzgün bir şekilde bağlayın. İğneyi enjeksiyon için uygun bir açıya ayarlayın. Mikroenjeksiyon iğnesi için 600-900 hPa, gavaj iğnesi için 200-300 hPa arasında enjeksiyon basıncını ayarlayın.
    3. Kalibrasyon kaydırağının siyah halkasının üzerine bir damla mineral yağ yerleştirin. İğnenin ucunu kesmek için ince terpler kullanın. Damlacık boyutunu ölçmek için mineral yağ içine bir damla enjekte.
    4. Mikroenjeksiyon için enjeksiyon süresini 0,10-0,12 mm çapında, 0,5-1,0 nL hacmine eşit olan bir damlacık elde etmek için ayarlayın. Mikrogavaj için, çapı 0,18-0,20 mm olan ve 3-5 nL hacmine eşit olan bir damlacık elde edin.
  3. Mikrogavaj kalıp olarak plastik bir kalıp kullanarak% 30 Danieau's orta 10 cm Petri çanak agarose(Malzeme Tablosu, 8050) ile% 1.5 agarose plaka hazırlayın. İhtiyaç duyulana kadar kurumasını önlemek için 4 °C'de saklayın. Deneyden önce RT veya 28 °C'ye sıcak.

2. Floresan Boya ile C. difficile ve Sporların Hazırlanması ve Etiketlemesi

  1. Floresan boyanın 1 mM stok çözeltisi(Malzeme Tablosu)hazırlayın. Boya 50 μg toz halinde satıldığı için, 1 mM stok konsantrasyonu elde etmek için şişeye 69 μL DMSO ekleyin.
  2. Floresan boyanın 100 μM çalışma çözeltisini, 18 μL DMSO'ya santrifüj tüpüne 2 μL'lik 1 mM stok çözeltisi ekleyerek hazırlayın ve iyice karıştırın.
  3. Kültür C. difficile (R20291, bir riboztip 027 zorlanma) bir gecede sallayarak olmadan bir anaerobik başlık bir plaka iki ila üç kolonileri ile BHIS sıvı orta 10 mL aşılayarak. BHIS BHI ile desteklenmektedir 0.5% (w / v) maya ekstresi ve 0.1% (w / v) L-sistein. 1 g L-sistein 10 mL ddH2O ve filtrasyon ile sterilize 1 g çözün, sonra otoklavlama önce orta 15 g / L agar-agar ekleyerek hazırlanan 1 g / L. Plakalar son konsantrasyon elde etmek için otoklavlı ortama ekleyin. C. difficile seçici culturing kromID C. difficile plakaları kullanılarak yapılır (Malzeme Tablosu).
  4. Floresan boya ile Boyama C. difficile
    1. Hasat C. difficile 1.0-1.2 bir OD600 ve 1 x 1x 1x PBS (5.000 x g RT 3 dakika için) ile yıkayın. 1 x PBS 1 mL resuspend.
    2. Floresan boyanın 3 μL'lik çalışma solüsyonu1 mL bakteri süspansiyonuna ekleyin. Karanlıkta RT'de 15 dakika boyunca numuneyi kuluçkaya yatırın. Lekeli C. difficile'ı 1 mL PBS ile yıkayın ve 1x PBS'de 1.0'ın OD600'üne geri alın (1.0 OD600 yaklaşık 108 cfu/mL'ye eşdeğerdir).

3. Boyalı C. Enjeksiyon zebrabalığı Larvaları içine difficile

  1. Döllenme sonrası 5 gün 20-30 zebra balığı larvasını (burada 5 dpf olarak anılacaktır) %0,02-0,04 triain (trikotin tozu çift distile suda çözülür ve pH = 7'ye 1 M Tris-HCL çözeltisi ile ayarlanır) %30 Danieau'nun orta ~10 dk önce Enjeksiyon. Anestezili larvaları taze 10 cm Petri kabına aktarın ve danieau'nun orta sını %30'dan çıkarın.
  2. Kapsayacak şekilde zebrabalığı larvaları üzerine% 0.8 düşük erime agarose bir damla yerleştirin. Larvaları yanal konuma hafifçe ayarlayın. Petri kabını 30-60 s'lik buz üzerine yerleştirin ve düşük eriyen agarose'un katılaşmasını bekleyin. Agarose kapsayacak şekilde% 0.02-0.04% tricaine içeren% 30 Danieau's orta ekleyin.
  3. Enjeksiyon çözeltisini hazırlayın. Enjeksiyon işlemini görselleştirmek için PBS çözeltisine %0,5 fenol kırmızısı ilave edin.
  4. Bir microloader kullanarak enjeksiyon çözeltisi ile kalibre edilmiş bir mikroenjeksiyon iğnesi yükleyin. Yüklü iğneyi bir mikromanipülatöre monte edin ve stereomikroskop altında yerleştirin.
  5. Enjeksiyon basıncını 600-900 hPa arasında ayarlayın. 0.5-1.0 nL elde etmek için enjeksiyon süresini 0.1-0.3'e ayarlayın. İğneyi mikromanipülatöre gömülü larvaları gösteren ~45° açıyla ayarlayın.
  6. İğne ucunu ürogenital gözeneğe yakın gastrointestinal sistem üzerine yerleştirin. Pierce agarose ile sonra iğne ucu ile kas, sonra bağırsak lümen içine takın ve C. difficile0.5-1.0 nL enjekte . Enjekte edilen larvaları izlemek ve konfokal görüntüleme için düzgün enjekte edilen larvaları almak için floresan mikroskobu kullanın.

4. Gnotobiyotik Zebrabalığı Larvalarının Üretimi

  1. Gnotobiyotik zebra balığı embriyoları oluşturmak için köklü doğal üreme yöntemini kullanın, dahil: in vitro fertilizasyon, antibiyotik içeren orta ile yıkama (1 μg/mL amphotericin B, 10 μg/mL kanamisin, ve 20 μg/mL ampisilin), %0.1 wt/vol polivinil piroliyodone-iyot (PVP-I) çözeltisi ile yıkama ve hücre kaputkültüründe embriyoların kuluçka12.
  2. 5 dpf kadar veya gavaj hemen öncesine kadar gnotobiyotik koşullar altında tüm gnotobiyotik zebra balığı larvaları koruyun. Gavajdan sonra, zebra balığı larvaları standart bir kuluçka makinesine aktarılacak ama steril %30 Danieau'nun orta sı.

5. Zebrabalığı Larvalarının Gavajı

  1. Adım 1.2'de açıklandığı gibi mikrogavaj iğnesini kalibre edin.
  2. İğneyi bir damla mineral yağla kalibrasyon kaydırağının üzerine yerleştirerek iğnenin ucunun çapını ölçün. Ucun 30-40 μm çapında, künt ve pürüzsüz olduğundan emin olun. Keskin veya pürüzlü iğneleri atın.
    NOT: İğnelerin keskin kenarları hızlı alev alınarak köreltilebilir.
  3. 3.3. adımda açıklandığı gibi gavaj çözeltisini hazırlayın.
  4. 3.4 adımda açıklandığı gibi iğneyi bir mikromanipülatöre yükleyin ve monte edin. İğneyi 45° açıyla konumlandıracak şekilde mikromanipülörü ayarlayın.
  5. Adım 3.1'de bahsedilen zebra balığı larvalarını anestezi edin. Larvalar hareket etmeyi bıraktığında, pasteur pipeti kullanarak onları bir mikrogavaj kalıbının oluğuna aktarın.
  6. Kapsayacak şekilde zebrabalığı larvaları üzerine% 0.8 düşük erime agarose bir damla yerleştirin. Larvaları, olukta 45° açılarda dik bakacak şekilde larvaları ve kuyrukları oluğun duvarına doğru yavaşça ayarlayın. Kafaların açılarının yaklaşık olarak aynı olduğundan emin olun, böylece gavaj iğnelerinin açısıyla hizalanırlar. Mikrogavaj kalıbını 30-60 s'lik buzüzerine yerleştirin ve larvaların pozisyonlarını dengelemek için düşük eriyen agarose'un katılamasını bekleyin.
  7. Enjeksiyon basıncını 200-300 hPa arasında ayarlayın. Enjeksiyon süresini 0.1-0.3 s olarak ayarlın ve 3-5 nL C. difficile enjeksiyon hacmi elde edin.
  8. İğneyi agarose'dan sonra da yemek borusundan zebra balığı larvalarının ağzına doğru yavaşça çalıştırın. İğneucu ön bağırsak ampul içinde bir kez, bakteri serbest bırakmak için enjeksiyon pedalına basın. Verilen hacim ile bağırsak lümendoldurun. Yemek borusundan veya cloaca'dan taşmasına izin vermeyin. İğneyi zebra balığının ağzından yavaşça çekin.
  9. Gavaj'ı takiben, enfekte zebra balığı larvalarını önce agarose'u keserek sonra larvaları kaldırarak esnek bir mikroloader ucu yla agarose'dan kurtarın. Bu larvaları steril %30 Danieau'nun orta sına aktarın. Larvaları steril ortamda iki kez durula. Larvaları 10 cm'lik taze petri kabına aktarın. Larvalar 11 dpf'ye kadar muhafaza edilecektir.

6. Enjekte Edilen Zebrabalığı Larvalarının Konfokal Mikroskopi Analizi

  1. Anestezi zebra balığı larvaları adım 3.1'e atıfta bulundu. Görüntüleme odası olarak adlandırılan deliğe bağlı bir cam slayt ile 35 mm Petri kabının altında bir delik yapın. Embriyoları görüntüleme odasının altına %30 Danieau'nun orta aracı ile aktarın.
  2. Anestezili larvaları kapsayacak şekilde %1 düşük erime agarose'un 200-300 μL'sini ekleyin. Ters konfokal mikroskop kullanıldığından, larvaların enfekte bölgesini mümkün olduğunca yakından cam kaydırağından yakınlaştırın.
  3. Agarose 30-60 s.% 30 Danieau's içeren% 0.02-0.04% tricaine ile agarose batırmak için buz üzerinde katılaşmak sağlar.
  4. Bir konfokal lazer tarama mikroskobu ile larvagörüntü (Malzeme Tablosu).

7. Canlı C. difficile kurtarmak için Larva Zebrabalığı Bağırsak Diseksiyon

  1. Bakteriyel yükü analiz etmek için larvalardan gastrointestinal yolları izole edin. Zebra balığı larvalarını %0,4 tricaine ile ötenazi yaparak başlayın.
  2. Zebra balığını steril 1x PBS ile kısa bir süre durulayın ve taze bir agarose plakaya aktarın.
  3. Zebra balığının diseksiyonu
    1. Zebra balığı hareketsizleştirmek için kafaya yakın zebrabalık larvalarının sırt gövdesine bir iğne yerleştirin. Bir mızrak ile solungaçları arkasındaki baş çıkarın.
    2. İkinci iğneyi sırt gövdesinin ortasına takın. Zebra balığının karnına üçüncü iğneyi yerleştirin ve bağırsakları vücut boşluğundan çekin.
      NOT: Bozulmamış bağırsağın izole edilmesi için aşırı özen gerekir. Bunu yapmak zor ise, kalan iç organlardan bağırsak geri kalanı ayırmak için ek çeker gerçekleştirin.
    3. 10-15 bağırsağı 1x PBS'nin 200 μL steril içeren 1,5 mL'lik tüpüne aktarmak için mikroenjeksiyon iğnesi kullanın.
    4. Dokuyu bozmak ve homojenleri hazırlamak için bağırsakları bir zararlı ile homojenize edin. Tüm bağırsakları tamamen bozmak için haşere tüp altına ulaştığından emin olun.
  4. Anaerobik odada taurokolat (TCA, C. difficile sporların bir germinant) ile veya olmadan, D-sikloserin ve sefüsitin içeren C. difficile yetiştirme orta sındaki homojenatları kuluçkaya yatırın.
  5. Plakayı 37 °C'de 48 saat boyunca anaerobik olarak kuluçkaya yatırın.
  6. 16S rRNA-PCR için bakteri kültürünü kullanın.
    1. Bir koloniyi 50 μL H2O'da yeniden askıya alın ve 95 °C'de 15 dakika kaynatın. Pelet santrifüj tarafından lysed enkaz (14.000 rt RT için 2 dakika için) ve C. difficileözgü primerler kullanarak PCR-reaksiyon 25 l şablon olarak supernatant 2 μL kullanın (Cdiff16Sfw: 5'GTG AGG CAG TAC AGG 3'; Cdiff16Srev: 5' TTA AGG AGA TGT CAT TGG 3').
    2. Sıvı kültürden bakteriler kullanıldığında, 1 mL kültür hasat ve 1 mL PBS (RT 2 dakika için 14.000 rpm) ile bir kez yıkayın. Peleti 100 μL H2Odd'de yeniden askıya alın ve yukarıda olduğu gibi tedavi edin. Daha fazla bakteri kolonileri karakterize etmek için, bir BHIS üzerinde çizgi- veya kromid plakası(Malzeme Tablosu).

   

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

C. difficile kesinlikle anaerobik, ancak floresan proteinlerin kromofor genellikle olgun oksijen gerektirir. Bu sorunu aşmak için, bir floresan boya aktif olarak büyüyen canlı C. difficile hücreleri leke kullanılmıştır (R20291, bir ribotype 027 suş; Şekil 1A). Gal4/UAS sistemi kullanılarak, canlı görüntüleme için kararlı transgenik zebra balığı hatları oluşturuldu ve mpeg1.1 veya lyZ organizatörleri EGFP floresan proteininin makrofajlarda ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sunulan yöntemler değiştirmek ve hem enjeksiyon ve mikrogavage 10 ,14gerçekleştirerek zebra balığı larvaları enfekte mevcut bir yaklaşım genişletmek. Ayrıca zebrabalığı larvaları22ile anaerobik patojenleri incelemek için bir yaklaşım göstermektedir. Buna ek olarak, protokol CDI üzerine in vivo doğuştan gelen bağışıklık hücresi yanıtlarının analizini kolaylaştırır ve zebra balıklarında C. difficile kolonizasyonu üzerine. Yöntem tek...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biz mükemmel hayvan bakımı için Timo Fritsch için müteşekkiriz. Köster ve Steinert laboratuvarları üyelerine destek ve yararlı tartışmalar için teşekkür ederiz. Dr. Dandan Han'a el yazını eleştirel okuduğu için teşekkür ederiz. Biz minnetle Aşağı Saksonya Federal Devlet, Niedersächsisches Vorab (VWZN2889) tarafından fon kabul ediyoruz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
AgaroseSigma-AldrichA2576Ultra düşük jelleşmeli agaroz
Agaroz düşük erime noktalı (LM)Pronadisa8050Agaroz plakalarında kullanılır
BacLight Kırmızı Bakteri LekesiThermo Fisher ScientificB35001Floresan boya
Beyin-Kalp İnfüzyon SuyuCarl Roth GmbHX916.1
Pirinç (vahşi tip)melanin sentezinde eksik, kararlı transgenik hatlar oluşturmak için kullanılır
Kalsiyum nitrat (Ca(NO3)2)Sigma-AldrichC1396
Kılcal CamHarvard Aparatı30-0019Enjeksiyon iğneleri
Clostridioides difficileR20291,, bir ribotip 027 suşu, TcdA+/TcdB+/CDT+ üretimi
DMSOCarl Roth GmbHA994
FIJIaçık kaynak platformuGörüntü işleme
HEPESCarl Roth GmbH6763
Yatay iğne çektirmeSutter enstrümanı IncP-87
L-sisteinSigma-Aldrich168149
Leica Application Suite X (LAS X)LeicaGörüntü işleme
Magnezyum sülfat (MgSO4)Carl Roth GmbHP026
Mikro enjektöreppendorf5253000017
Mikroenjeksiyon kalıplarıUyarlanabilir Bilim AraçlarıTU1
Leica SP8 konfokal mikroskopLeica
Phenol RedSigma-AldrichP0290
Potasyum klorür (KCl)Carl Roth GmbH5346
Sodyum klorür (NaCl)Carl Roth GmbH9265
TaurocholateCarl Roth GmbH8149
Tg(lyZ: KalTA4)bz17/Tg(4xUAS-E1b:EGFP)hzm3lyZ promotörlerinin nötrofillerde EGFP floresan proteininin ekspresyonunu yönlendirdiği kararlı transgenik hat
Tg(mpeg1.1: KalTA4)bz16/Tg(4xUAS-E1b:EGFP)hzm3mpeg1.1'in makrofajlarda EGFP floresan proteininin ekspresyonunu yönlendirdiği kararlı transgenik hat
TrikainSigma-AldrichE10521
Maya özüBD Bacto212750

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Rupnik, M., Wilcox, M. H., Gerding, D. N. Clostridium difficile infection: new developments in epidemiology and pathogenesis. Nature Reviews Microbiology. 7, 526-536 (2009).
  2. Yang, Z., et al. Mechanisms of protection against Clostridium difficile infection by the monoclonal antitoxin antibodies actoxumab and bezlotoxumab. Infection and Immunity. 83, 822-831 (2015).
  3. Kelly, C. P., Kyne, L. The host immune response to Clostridium difficile. Journal of Medical Microbiology. 60, 1070-1079 (2011).
  4. Britton, R. A., Young, V. B. Interaction between the intestinal microbiota and host in Clostridium difficile colonization resistance. Trends in Microbiology. 20, 313-319 (2012).
  5. Goorhuis, A., et al. Emergence of Clostridium difficile Infection Due to a New Hypervirulent Strain, Polymerase Chain Reaction Ribotype 078. Clinical Infectious Diseases. 47, 1162-1170 (2008).
  6. Pépin, J., et al. Emergence of fluoroquinolones as the predominant risk factor for Clostridium difficile-associated diarrhea: a cohort study during an epidemic in Quebec. Clinical Infectious Diseases. 41, 1254-1260 (2005).
  7. Merrigan, M. M., Sambol, S. P., Johnson, S., Gerding, D. N. Prevention of Fatal Clostridium difficile -Associated Disease during Continuous Administration of Clindamycin in Hamsters. The Journal of Infectious Diseases. 188, 1922-1927 (2003).
  8. Chen, X., et al. A Mouse Model of Clostridium difficile-Associated Disease. Gastroenterology. 135, 1984-1992 (2008).
  9. Page, D. M., et al. An evolutionarily conserved program of B-cell development and activation in zebrafish. Blood. 122, 1-12 (2014).
  10. Benard, E. L., et al. Infection of Zebrafish Embryos with Intracellular Bacterial Pathogens. Journal of Visualized Experiments. (61), e3781(2012).
  11. Theriot, C. M., Young, V. B. Interactions Between the Gastrointestinal Microbiome and Clostridium difficile. Annual Review of Microbiology. 69, 445-461 (2015).
  12. Pham, L. N., Kanther, M., Semova, I., Rawls, J. F. Methods for generating and colonizing gnotobiotic zebrafish. Nature Protocols. 3, 1862-1875 (2008).
  13. Ransom, E. M., Ellermeier, C. D., Weiss, D. S. Use of mCherry red fluorescent protein for studies of protein localization and gene expression in Clostridium difficile. Applied and Environmental Microbiology. 81 (5), 1652-1660 (2015).
  14. Cocchiaro, J. L., Rawls, J. F. Microgavage of Zebrafish Larvae. Journal of Visualized Experiments. (72), e4434(2013).
  15. Chen, X., et al. A Mouse Model of Clostridium difficile-Associated Disease. Gastroenterology. 135 (6), 1984-1992 (2008).
  16. Hutton, M. L., Mackin, K. E., Chakravorty, A., Lyras, D. Small animal models for the study of Clostridium difficile disease pathogenesis. FEMS Microbiology Letters. 352, 140-149 (2014).
  17. Brugman, S. The zebrafish as a model to study intestinal inflammation. Developmental & Comparative Immunology. 64, 82-92 (2016).
  18. Goulding, D., et al. Distinctive profiles of infection and pathology in hamsters infected with Clostridium difficile strains 630 and B1. Infection and Immunity. 77, 5478-5485 (2009).
  19. Toh, M. C., et al. Colonizing the Embryonic Zebrafish Gut with Anaerobic Bacteria Derived from the Human Gastrointestinal Tract. Zebrafish. 10, 194-198 (2013).
  20. Bloemberg, G. V., et al. Comparison of static immersion and intravenous injection systems for exposure of zebrafish embryos to the natural pathogen Edwardsiella tarda. BMC Immunology. 12, 58(2011).
  21. Díaz-Pascual, F., Ortíz-Severín, J., Varas, M. A., Allende, M. L., Chávez, F. P. In vivo host-pathogen interaction as revealed by global proteomic profiling of zebrafish larvae. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 1-11 (2017).
  22. Valenzuela, M. J., et al. Evaluating the capacity of human gut microorganisms to colonize the zebrafish larvae (Danio rerio). Frontiers in Microbiology. 9, (2018).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Zebrafish LarvalarC Difficile EnfeksiyonuMikrogavage ProtokolFloresan EtiketlemeKonfokal G r nt lemeDo al Ba kl k Yan tAnaerobik Bakteri K lt rBa rsak KolonizasyonuMakrofaj FagositozuN trofil G

İlgili makaleler