Chromagnon Kullanarak Süper Çözünürlüklü Biyolojik Görüntüleme Çağında 3D Kromatik Değişimlerin Yüksek Doğrulukdüzeltmesi

Özet

Üç boyutlu (3D) çok renkli floresan mikroskopi görüntülerinde kromatik kaymaların düzeltilmesi nicel veri analizleri için çok önemlidir. Bu protokol, uygun referans görüntülerin edinimi ve açık kaynak yazılım, Chromagnonile işleme yoluyla biyolojik numunelerde kromatik kaymaları ölçmek ve düzeltmek için geliştirilmiştir.

Özet

Kantitatif çok renkli floresan mikroskopisi, farklı dalga boylarında elde edilen renk kanallarının dikkatli uzamsal eşleşmesine dayanır. Renk sapması ve kameraların kusurlu hizalanması nedeniyle, her kanalda edinilen görüntüler kaydırılabilir ve büyütülebilir ve üç boyuttan herhangi birinde birbirlerine göre döndürülebilir. Klasik kalibrasyon yöntemi ile, kromatik kaymalar bir coverslip yüzeyine bağlı çok renkli boncuklar ile ölçülür ve bu tür kalibrasyon örnekleri renk kaymaları ölçmek için bir dizi yazılım mevcuttur. Ancak, renk sapması derinlik, gözlem koşulları ile değişim ve biyolojik örnek kendisi tarafından indüklenen, böylece ilgi örnek ve hacim boyunca renk kayması gerçek miktarının belirlenmesini engelleyen değişebilir. Daha yüksek doğrulukta kromatik kaymaların düzeltilmesi, özellikle sadece hafif renk kaymalarının nicel analizleri etkileyebileceği ve çok renkli görüntülerin yorumlanmasını değiştirebileceği süper çözünürlüklü mikroskopi için önemlidir. Biyolojik numunelerde 3Boyutlu kromatik kaymaları ölçmek ve düzeltmek için bir açık kaynak yazılımı Chromagnon ve beraberindeki yöntemler geliştirdik. Burada, biyolojik ilgi örneklerindeki kromatik kaymaları ölçmek için numune hazırlama, veri toplama ve yazılım işleme için özel gereksinimler içeren ayrıntılı bir uygulama protokolü salıyoruz.

Giriş

Çok renkli görüntüleme, farklı molekül veya yapıların mekansal ilişkisinin büyük ilgi gördüğü durumlarda biyolojik floresan mikroskopinin temel yönlerinden biridir. Renk sapması, dağılım nedeniyle polikromatik ışığın optik sapması, ilgi renkli nesnelerin görünür konumunu değiştirir. Benzer şekilde, her rengi elde etmeye adanmış birden fazla kamera ile donatılmış mikroskoplar, optik elemanfarklılıkları ve kanallar arasındaki kusurlu hizalama nedeniyle daha karmaşık renk kaymalarına sahiptir. Bu nedenle, bu tür renk değişimleri, kullanıcı tarafından açıkça düzeltilmediği sürece yanlış bir sonuca yol açabilir. Kromatik kaymalar, mikroskopinin çözümü klasik çözünürlük sınırı ile sınırlı olduğu sürece önemli bir sorun olmasa da, süper çözünürlüklü mikroskopi^1'in son zamanlarda kiremit kaymalarının daha doğru düzeltilmesi gereğini ortaya koymuştur.

Çok renkli boncuk kalibrasyon slayt²kullanarak mikroskop sistemlerinin kromatik kaymaları ölçmek için yaygın bir uygulama olmuştur. Boncuk bazlı kalibrasyon yöntemi, mikroskobun tüm optiklerinden coverslip²yüzeyine doğru renk kaymalarını ölçmek için uygundur. Ancak bu yöntem, biyolojik ilgi örneklerindeki kromatik kaymaları ölçemez. Birçok biyolojik örneğin üç boyutlu (3D) olduğunu ve bu tür örneklerin kromatik kaymalarının kapak kaymasıyüzeyindekinden farklı olduğunu belirtmek önemlidir. Ayrıca, renk kaymaları görüntüleme koşulları ile değiştirmek^2,3. Biz 3D biyolojik örneklerde kromatik kaymaları ölçülen ve renk kaymaları belirsizlik genellikle kadar 350 nm klasik çok renkli boncuk kalibrasyon yöntemi³olduğunu bulduk . Bu nedenle, renk kaymaları biyolojik numunelerde ilgi derinliğinde ve kullanılan görüntüleme koşullarında ölçülmalıdır.

Burada, biyolojik numunelerde kromatik kaymaları ölçmek ve yazılımımız Chromagnon^3'ukullanarak bu vardiyaları düzeltmek için prosedürleri tanımlıyoruz. Biyolojik numunelerde kromatik kaymaları ölçmek için, yöntemimiz iki tür veri kümesi, bir "hedef" görüntü ve bir "referans" görüntü kullanır. "Hedef" görüntü ilgi çok renkli bir görüntü, örneğin, DNA, nükleer zarf ve mikrotübüller için boyanmış görüntüler. Genellikle böyle bir görüntüde renk kaymalarını ölçmek mümkün değildir. Bu nedenle, örnekteki renk kaymalarını ölçmek için adanmış bir "referans" görüntüye ihtiyacımız vardır. "Başvuru" görüntüsünün tek tanımı, aynı nesnenin çok renkli görüntüsüdür. Bu anlamda, çok renkli boncukgörüntü de referans görüntü türüdür. Burada, biyolojik numunelerde renk kaymalarını ölçmek için kullanılan üç farklı referans görüntü türünü tanımlıyoruz: "çapraz konuşma referans görüntüleri", "parlak alan referans görüntüleri" ve "biyolojik kalibrasyon referans görüntüleri". Referans görüntünün türü, kullanılan mikroskobun türüne veya Tablo 1'deözetlendiği gibi gerekli düzeltme doğruluğuna bağlıdır.

	Karışma	Parlak alan	Biyolojik kalibrasyon (farklı bir slaytta)	Biyolojik kalibrasyon (aynı slaytta)
Doğruluka	+++	+	++b	+++
Sade -lik	++	+++	++	++
Uygulanabilir mikroskopi	Geniş alan	Geniş alan	Tüm	Tüm
Yerel hizalamanın kullanılabilirliği	+	+	-c	-c
a: "+" sayısı artan derecelendirmeyi gösterir. Tek artı yaklaşık 50 nm ve üç artı 3D yaklaşık 15 nm olduğunu. b: Doğruluk değişken görüntüleme koşullarının ne kadar sabit tutulduğuna bağlıdır. c: Çok renkli boncuk örnekleri ile ölçülen yerel kalibrasyon protokol bölüm 4'te açıklandığı şekilde kombine edilebilir.

Tablo 1: Referans görüntülerinin türünü seçerken parametreler.

"Crosstalk referans görüntüleri" en yüksek düzeltme doğruluğuna sahiptir ve^3,4 (Tablo 1)gerçekleştirmek için nispeten basittir. Bunun dezavantajı, uyarma yollarındaki kromatik kaymaları ölçemememelerinden dolayı mikroskopi uygulamalarındaki sınırlamadır. Ayrıca, bu tür görüntüleri elde etmek için, mikroskop çok bantlı dikroik aynalar ve uyarma filtreleri veya ışık kaynaklarından bağımsız olarak kontrol edilen emisyon filtreleri ile donatılmış olmalıdır. Uygun mikroskopi konvansiyonel geniş alan mikroskobu, tek molekül lokalizasyon mikroskobu (SMLM) gibi foto-aktive lokalizasyon mikroskobu / stokstik optik rekonstrüksiyon mikroskopi (PALM / STORM)^5,6 ve genleşme mikroskobu⁷ geniş alan mikroskopisi ile gözlenen içerir. Hedef numunenin kendisinden bir çapraz konuşma referans görüntüsü elde edilir. Gerekli tüm kanallarda elde edilen bir boyanın çapraz konuşma (bleed-through) floresan bir görüntüsüdür. Floresan emisyon her zaman uzun dalga boylarına doğru genişler, bu nedenle en kısa emisyon dalga boyuna sahip boyalar, uzun dalga boylarındaki kanallarda çapraz sap floresan elde etmek için heyecanlanırlar. Örneğin, örnek mavi, yeşil ve kırmızı ile boyandığında, yalnızca mavi boya heyecanlanır ve emisyon ışığı mavi, yeşil ve kırmızı kanallarda elde edilir. Bu protokolde, 4′,6-diamidino-2-fenilindole (DAPI) ile boyanmış DNA çapraz sap floresan elde etmek için kullanılmıştır.

"Parlak alan referans görüntüleri" "crosstalk referans görüntüleri" için daha kolay ve daha az fototoksik bir alternatif ama en az doğru³ (Tablo 1)vardır. Bunlar, hedef görüntüde kullanılan tüm renk kanallarında elde edilen hedef örneğin parlak alan görüntüleridir.

"Biyolojik kalibrasyon referans görüntüleri" hem uyarma hem de emisyon yollarında renk kaymalarını ölçebilme yeteneği nedeniyle her türlü mikroskopiye uygulanabilir olma avantajına sahiptir^3,8 ( Tablo1). Uygun mikroskopi geniş alan mikroskobu, konfokal mikroskobu, ışık sayfası mikroskobu, uyarılmış emisyon tükenmesi (STED)⁹, yapılandırılmış aydınlatma mikroskobu (SIM)¹⁰, Airyscan / SORA^11,12, SMLM toplam iç yansıma floresans (TIRF) modu ile gözlenen, Olympus süper çözünürlük (OSR)¹³, vb. içerir. Biyolojik kalibrasyon referans görüntüsü, hedef numune olarak benzer şekilde hazırlanmış, ancak birden fazla renkte tek bir yapının boyanarak bir kalibrasyon örneğinden elde edilir. Düzeltme doğruluğu en süper çözünürlüklü mikroskopi çözünürlüğü öne çıkmaktadır ve biyolojik kalibrasyon örneği hazırlanması nispeten basit olabilir. Başka bir avantajı "ortalama" birden fazla referans görüntüleri için kullanılabilirliği. Bu nedenle, tek tek görüntüler renk değişimleri ölçümü için zayıf bilgi içerse de, bilgi içeriği birden çok görüntü nün ortalaması ile artırılabilir. Doğruluk görüntüleme koşullarının ne kadar sabit tutulduğuna bağlıdır. Bu bağlamda, hem hedef hem de referans örnekleri aynı slaytta olduğunda, örneğin 8 kuyulu odacıklı tulum(Tablo 1, en sağ) kullanılarak en iyi performans elde edilir. Bu protokolde, phalloidin üç renk ile boyanmış aktin biyolojik kalibrasyon olarak kullanılmıştır.

Bir referans görüntü elde edildikten sonra, kromatik kayma ölçülür ve bizim yazılım Chromagnontarafından düzeltilir. Chromagnon'un kromatik kaymaları ölçebileceği ve düzeltebileceği kanal, Z bölümleri ve zaman dilimlerinin sayısında herhangi bir sınırlama yoktur. Kromatik kaymaları iki adımda ölçer. İlk adım, X, Y, Z eksenlerinde çevirinin "global" veya "affine" hizalama parametrelerini, X, Y, Z eksenleri boyunca büyütmeve Z ekseni etrafında dönmeparametrelerini kazanır. Küresel hizalamanın hesaplama doğruluğu 3D'de ~16 nm ve 2B'de ~8 nm'dir. İkinci adım, daha yüksek bir doğruluk elde etmek için yansıtılan görüntülerde isteğe bağlı 2D yinelemeli "yerel hizalama"dır. Yerel hizalama işleminde, görüntüler birden çok bölgeye bölünür ve bu yerel bölgelerdeki renk kaymaları ölçülür. Daha sonra, bölgeler daha da bölünür ve bölgedeki piksel sayısı en az piksel sayısına (genellikle 60 x 60 piksel) ulaşana kadar alt bölgelerdeki kromatik kaymalar yinelemeli olarak ölçülür. Elde edilen yerel hizalama eşlemi, genel hizalama parametresi ile birleştirilir ve elastik bir dönüşüm le hedef görüntüye uygulanır. Bu adımı takiben, hesaplama doğruluğu 3D'de ~14 nm ve 2D'de ~6 nm'ye yükseltilir. Referanstaki biyolojik yapı hedeftekilerden farklı olduğundan, yerel hizalama biyolojik kalibrasyon referans görüntüleri için uygun değildir(Tablo 1). Bu nedenle, biyolojik kalibrasyon referans görüntüleri için yalnızca küresel hizalama kullanılır.

Lokal kromatik değişimler iki kaynaktan kaynaklanır; mikroskop enstrümental lokal distorsiyon ve biyolojik yapısal inhomojenite. Mikroskop enstrümantal yerel distorsiyon sabit olduğundan, bu çok renkli boncuk referans örnek ölçülebilir ve sabit bir parametre olarak düzeltilir. Kromaton mikroskop enstrümantal lokal bozulma haritasını ve biyolojik kalibrasyonlardan küresel hizalama parametrelerini birleştirebilir(Tablo 1). Bu yöntem kullanılarak, biyolojik kalibrasyonun ortalama doğruluğunun ek 1−2 nm ile iyileştirilmesi beklenmektedir.

Burada, bizim yazılım Chromagnonkullanarak 3D floresan görüntülerin kromatik kaymaları düzeltmek için bir protokol açıklar , en kolay düşük ucundan en yüksek doğruluk için. HeLa hücrelerinin immünboyamasını örnek olarak kullanıyoruz ve 3Boyutlu geniş alan mikroskobu ve 3D SIM kullanarak gözlemledik. Birinci bölümde, hedef numunelerin ve biyolojik kalibrasyon örneklerinin nasıl hazırlanacağı açıklanmıştır. Protokolün bu bölümü araştırmanın belirli hedefleri için optimize edilmelidir. İkinci bölümde, mikroskoplar tarafından üç çeşit referans görüntü elde edilmesi yöntemlerini açıklıyoruz. Varsayım mavi, yeşil ve kırmızı kanallar elde etmekti, ancak kanal kompozisyonu araştırmanın belirli hedefleri ve mikroskop un kurulumları tarafından değiştirilmelidir. Mikroskop tek bir kamera veya birden fazla kamera ile donatılmış olup olmadığını fark etmez. Üçüncü bölümde, referans görüntüleri kullanarak hedef görüntünün kromatik kaymalarını ölçmek ve düzeltmek için yazılımımızı nasıl kullanabileceğimizi anlatıyoruz. Son olarak, dördüncü bölümde, bir mikroskop enstrümental lokal kalibrasyon kullanarak biyolojik kalibrasyon referans görüntüleri tamamlamak için bir yöntem açıklar.

Protokol

1. Örnek hazırlama

1. Hedef numunenin hazırlanması
   1. Tohum 2.5 x 10⁵ HeLa hücreleri 35-mm cam alt çanak ve büyüme orta 2 mL onları büyümek (L-glutamin ve sodyum pirüuvat ile Dulbecco modifiye kartal orta ile 10% fetal sığır serumu ile takviye (FBS]) 37 ° C ve% 5 CO₂ konsantrasyonu. Alternatif olarak, tohum 6 x 10⁴ 8 kuyulu bir kapak cam üzerinde HeLa hücreleri ve 37 °C büyüme orta 0,5 mL ve% 5 CO₂ konsantrasyonu onları büyümek. Yüksek çözünürlüklü mikroskopi için #1,5 kapaklı (0,170 mm kalınlığında) kullanın.
      NOT: 1.1.5, 1.1.6, 1.1.8, 1.1.11 ve 1.2.5 adımları dışında, kabın türüne bakılmaksızın hacmin 100 μl olduğu 8 kuyulu kapak camı için 1/4 hacim kullanın.
   2. Yaklaşık 24 saat inkübasyondan sonra, çözeltiyi fosfat tamponlu salinde (PBS) 2 mL formaldehit ile değiştirin. Hafif karıştırma sonra, bir rotasyon platformu üzerinde oda sıcaklığında 15 dakika (RT) hücreleri düzeltmek için devam edin.
      DİkKAT: Duman kaputunda çalışın.
   3. Hücreleri 2 mL PBS, her biri 5−10 dk'lık bir dönüş platformunda 3 kat az dır.
      NOT: Formaldehit atıklarını bertaraf etmek için yerel yönetmeliklere uyun.
   4. PBS'de %0,1 Triton X-100 ile 2 mL'lik hücreleri bir rotasyon platformunda 5 dakika boyunca permeabilize edin, ardından her biri 5−10 dakika boyunca bir rotasyon platformunda 2 mL PBS'li üç yıkama takip edin.
   5. PBS'de 100 μL'lik %1'lik büyükbaş serum albuminin (BSA) 100 μL'lik inkübasyon hücreleri rt'de bir rotasyon platformunda 1 saat.
   6. Çözeltiyi, pbs'de %1 BSA'da (anti-emerin ve anti-tubulin için 1/100) primer antikor (anti-emerin poliklonal antikor¹⁴ ve anti-tubulonal antikor¹⁵⁾karışımının 100 μL'lik karışımı ile değiştirin ve gece boyunca 4 °C'de inkübül.
   7. Hücreleri 2 mL PBS, 3−5x her biri 10 dk döndürme platformunda yıkayın.
   8. Çözeltiyi 1/500 seyreltmede PBS'de %1 BSA'da ikincil antikor (anti-tavşan IgG ile Alexa Fluor 488 ve anti-mouse IgG ile Alexa Fluor 555) karışımının 100 μL'lik kısmı yla değiştirin ve RT'de 3−4 saat kuluçkaya yatırın.
   9. Hücreleri 2 mL PBS, 3−4x her biri 5 dk'lık bir dönüş platformunda yıkayın.
   10. Çözeltiyi PBS'de 2 mL 0,5 g/mL DAPI ile değiştirin ve bir dönüş platformunda RT'de 30 dakika DNA lekeleyin.
       NOT: Hoechst 33342, DAPI yerine aynı konsantrasyonda da kullanılabilir.
   11. Çözeltiyi ~100 μL montaj ortamı(Malzeme Tablosu) ile değiştirin.
2. Biyolojik kalibrasyon numunesinin hazırlanması
   1. 1.1.1−1.1.4 adımlarında açıklandığı gibi sabit hücreleri hazırlayın.
      NOT: Tercihen, numuneler, hem hedef hem de referans örneklerini ayrı odalara aynı kapak lı bölmelere yerleştirmek için odacıklı bir kapak camına hazırlanır(Tablo 1, en sağ) Bu hazırlık, deneme en yüksek düzeltme doğruluğunu gerektirdiğinde tercih edilir. Numunenin normal bir kapak üzerinde hazırlanması gerektiğinde, tekrarlanabilirliği sigortalamak için düşük kalınlık varyasyonuna ("No. 1.5H") sahip hassas kapaklı dudaklar kullanın.
   2. Floresan boya konjuge phalloidinin stok çözeltisini 1,5 mL metanol de hazırlayın ve -20 °C'de saklayın. Aşağıdaki seyreltme de PBS karışımı phalloidin stok çözeltisi: 1/100 Faloidin için Alexa Fluor 405 ile, 1/1,000 Faloidin için Alexa Fluor 488 ile, ve 1/200 Alexa Fluor 594 ile phalloidin için.
   3. Çözeltiyi adım 1.2.2'de hazırlanan phalloidin karışımının 1 mL'si ile değiştirin ve rt'de 30 dakika boyunca bir rotasyon platformunda kuluçkaya yatırın.
   4. Hücreleri 2 mL PBS, 3−5x her biri 10 dk döndürme platformunda yıkayın.
   5. Çözeltiyi ~100 μL montaj ortamı ile değiştirin.
      NOT: Kalibrasyon numuneleri tekrarlanan kullanım için 4 °C veya -20 °C'de saklanabilir.

2. Referans görüntülerinin edinimi

1. Crosstalk referans görüntüleri
   1. Adım 1.1'de hazırlanan hedef numuneyi geniş alan mikroskobuna yerleştirin.
   2. Hedefin mavi, yeşil ve kırmızı kanallarda floresan görüntüsünü elde edin.
      NOT: 3B görüntüler için, görüntü dosyası adım boyutuna ait bilgiler içerdiği sürece, referans görüntüsündeki Z adım boyutu hedef görüntüdekinden farklı olabilir. Referans ve hedef görüntüler için Z adım boyutu tercihen Z ekseninin optik çözünürlüğünün yarısından daha azdır, bu da λ nanometrelerde dalga boyu ve NA'nın nesnel lensin sayısal diyafram açıklığı olduğu kırınım sınırlı bir mikroskop için hesaplanır. Örneğin, eksenel çözünürlük 550 nm ise, 275 nm'den küçük bir Z adımı kullanın. Referans görüntü için zaman serisi gerekmez.
   3. Daha sonra, başvurunun floresan görüntüsünü elde etmek için yalnızca DAPI için uyarma ışığını seçin ve mavi, yeşil ve kırmızı kanallarda edinmeyi seçin. 3B yığın durumunda referans görüntüsünü tam olarak aynı sahne konumunda ve Z yüksekliğinde edinin.
      NOT: Daha uzun emisyon dalga boyları için, daha fazla aydınlatma yoğunluğu ve pozlama süresi gerekecektir.
2. Parlak alan referans görüntüleri
   1. Adım 1.1'de hazırlanan hedef numuneyi geniş alan mikroskobuna yerleştirin.
   2. Hedefin mavi, yeşil ve kırmızı kanallarda floresan görüntüsünü elde edin.
      NOT: Z adım boyutu tercihen adım 2.1.2'de açıklandığı gibi Nyquist kriterini yerine getirerek yerine getirin.
   3. Hedefin mavi, yeşil ve kırmızı kanallarda 2.2.2 ve 3B yığın durumunda aynı Z yüksekliğinde parlak bir alan görüntüsü elde edin.
3. Biyolojik kalibrasyon referans görüntüleri
   1. Adım 1.1'de hazırlanan hedef numuneyi 3D SIM mikroskobuna yerleştirin.
   2. 3D-SIM ile hedefin mavi, yeşil ve kırmızı kanallarda floresan görüntüsünü elde edin. Süper çözümlenmiş görüntüyü yeniden oluştur.
      NOT: Mikroskop türü 3D-SIM, konfokal, STED, vb gibi herhangi bir türde olabilir. Z adım boyutu tercihen adım 2.1.2 açıklandığı gibi Nyquist kriteri yerine getirin.
   3. 3D-SIM ile hedef görüntüye (adım 2.3.2) benzer farklı sahne pozisyonlarında adım 1.2'de hazırlanan referansın birden fazla floresan görüntüsünü edinin. Süper çözümlü görüntüleri yeniden yapılandırın...
      NOT: XY'deki toplam piksel sayısı tüm referans görüntülerinde aynı olmalıdır. Z'deki adım boyutu tüm başvuru görüntülerinde aynı olmalıdır. Z bölümlerinin toplam sayısı hedef görüntüdekiyle aynı olması tercih edilir, ancak bu mutlak bir gereklilik değildir. Bu referans görüntüler için sahnedexy konumu önemli değildir çünkü pozisyon veya coverslip zaten hedef örnek konumundan farklı ve ayrıca tek bir coverslip üzerinde kromatik kayma farkı az 15 nm³. Objektif lens, gözlem sıcaklığı, daldırma yağı, konfokal mikroskopi iğne deliği boyutu ve yüksek eğimli aydınlatma mikroskobu¹⁶eğim açısı dahil görüntüleme koşulları, tüm en iyi performans için referans maç gerekir. Mikroskop aynı anda birden fazla kanal elde etmek için birden fazla kamera donatıyorsa, referans görüntüleri enstrümental sürüklenme düzeltmek için haftalık olarak sık sık elde edilmelidir.

3. Chromagnon yazılımı kullanarak kromatik kaymanın düzeltilmesi

1. Bir web tarayıcısı kullanarak, https://github.com/macronucleus/Chromagnon/releasesgidin ve Chromagnonen yeni ikili sürümü indirin.
   NOT: İkili sürümler Windows, Mac ve bazı Linux sürümleri için kullanılabilir.
2. Programı ayıklayın ve çalıştırılabilir dosyayı uygun bir konuma koyun. Windows veya Mac'te dosyayı açmak için dosyayı çift tıklatın veya bir Linux sistemindeki komut satırından ikili dosyayı çalıştırın.
   NOT: Şekil 1'deki grafik kullanıcı arabirimi açılacaktır. Programın bir güvenlik nedeni nedeniyle ilk kez çift tıklayarak açılması engellenebilir. Bu durumda, internetten indirilen programı açmak için platforma bağımlı yöntemi kullanın.

Şekil 1: Chromagnon grafik kullanıcı arabiriminin ekran görüntüsü. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

3. Başvuru dosyalarını "Başvuru kutusu"(Şekil 1)veya dosya seçici iletişim kutusunu açmak için Başvuru dosyaları (Şekil 1A)tuşuna basarak sürükleyin ve bırakın. Dosya biçimlerine bağlı olarak, program bir Java Geliştirme Kiti (JDK) yüklemek isterse, evet tuşuna basın ve kullanıcı indirme sayfasına yönlendirilir. Talimat verildiği gibi işletim sistemi için JDK'yı indirin ve kurun. Chromagnon programı yeniden başlattıktan sonra görüntü dosyası biçimini okuyabilmeli.
   NOT: Chromagnon çoğu resim dosyası biçimini (çok sayfalı 'tif', 'czi', 'nd2', 'oib', 'lif', 'dv', vb.) okuyabilir. Bu adımda orijinal mikroskop görüntü biçimi tercih edilir, çünkü bir görüntü biçimi çok sayfalı tif dosyasına dönüştürüldüğünde meta veriler kaybedilebilir. Kanal adı 528, 609(Şekil 2A, yeşil kutular) gibi dalga boyları yerine 0, 1, 2, vb. olarak gösterilirse, Chromagnon görüntüdeki kanalların kimliğini bilmez. Bu durumda, kanalların sırasının ve başvuru dosyasındaki piksel boyutunun hedef dosyadakilerle eşleştirdiğinden emin olun. Örneğin, başvurudaki kanalların sırası yeşil ve kırmızıise, hedefteki kanalların sırası da yeşil ve kırmızı olmalıdır, ancak kırmızı ve yeşil olmamalıdır.

Şekil 2: Birden çok dosya yüklemek için örnek ekran görüntüsü. (A) Tüm referans görüntülerinin karşılık gelen hedef görüntülere sahip olduğu bir durum. Kanal adları, bu örnekte kullanılan görüntü dosyalarında dalga boylarıyla (yeşil kutuyla gösterilir) doğru bir şekilde tanımlanır. (B) Birden çok hedef görüntüyü düzeltmek için tek bir referans görüntüsünün kullanıldığı bir durum. (C) Birden çok referans görüntüsünün (kırmızı bir kutuyla gösterilir) ortalamalandığı ve ortalama landıktan sonra elde edilen referans görüntüsünün birden çok hedef görüntüyü düzeltmek için kullanıldığı bir durumdur. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

4. Hedef dosyaları "Hedef kutusu"(Şekil 1)veya dosya seçici iletişim kutusunu açmak için Hedef dosyaları (Şekil 1B)tuşuna basın.
   NOT: Birden çok hedef görüntü varsa ve her birinde karşılık gelen referans görüntüleri varsa, ilgili referans görüntüsü ve hedef görüntü ilgili referans ve hedef kutularında aynı satırda olmalıdır(Şekil 2A). Birden fazla hedef görüntüyü hizalamak için tek bir referans görüntüsü de kullanılabilir(Şekil 2B).
5. İşaretlenmemişse kırpma kenar boşlukları onay kutusunu işaretleyin ( Şekil1C).
   NOT: Bu onay kutusu işaretlenirse, hizalamadan kaynaklanan kenar boşlukları kırpılır. Genel kullanım için bu seçeneği işaretleyin, ancak hizalamadan önceki ve sonra görüntüler arasında piksel düzeyinde karşılaştırma gerekip gerekmeytolup olmadığını denetleyin.
6. Seçim listesinden bir çıktı görüntü biçimi seçin (Şekil 1D).
   NOT: Kullanılabilir biçimler 'tif' (ImageJ¹⁷ formatı), 'dv', ve 'ome.tif'; 'ome.tif' formatı yalnızca JDK'yı yükledikten sonra kullanılabilir.
7. Çıktı dosya adının sonekini(Şekil 1E, varsayılan değer '_ALN') olarak belirtin ve hedef dosya adına eklenir.
8. Yüksek sinyal-gürültü oranına sahip çapraz konuşma referans görüntüleri için, Yerel hizalama (Şekil 1F)seçim listesinden yerel hizalama yı kullanın, yerel hizalamayı kullanmak için Projeksiyon'u seçin ve devre dışı kalmak için Yok'u seçin. En az 60 pencere boyutu kullanın (Şekil 1G).
   NOT: Yerel hizalama kullanırken, tüm hedef görüntülerde karşılık gelen referans görüntüleri olmalıdır(Şekil 2A). Yerel renk değişimleri bir örnekten diğerine değiştiğinden biyolojik kalibrasyon referans görüntüleri için yerel hizalama önerilmez(Tablo 1). Aynı nedenle, tek bir yerel hizalama birçok hedef görüntüye uygulanamaz(Şekil 2B). Bir istisna olarak, ilgi örneği sadece kapak yüzeyinde olduğunda ve görüş alanı çok renkli floresan boncuk örnekleri gibi parlak nesnelerle doldurulduğunda kullanılabilir.
9. Birden çok biyolojik kalibrasyon referans görüntüleri için, ortalama görüntüden tek bir hizalama parametresini ölçmek için ortalama referansseçeneğini (Şekil 1H)işaretleyin ve tek hizalama parametresi daha sonra tüm hedef görüntülere uygulanır(Şekil 2C). Yerel hizalama için Yok'u seçin (Şekil 1F).
10. Ölçümleri başlatmak için Tümünü Çalıştır 'ı(Şekil 1I)tıklatın; hizalama parametreleri hedef görüntülere uygulanır.
    NOT: Başvuru dosyalarından renk kaymalarını ölçtükten sonra, program uzantılı "chromagnon.csv" veya "chromagnon.tif" içeren dosyalar yapar. Çıktı dosyasının türü, yerel hizalamanın etkin olup olmadığına bağlıdır (Şekil 1F). Hizalama yerel hizalama olmadan yapılırsa, çıktı "chromagnon.csv", yerel hizalama ise çıktı "chromagnon.tif" olur. Dosya adları belirtilen sonek(Şekil 1J, varsayılan sonek olmadan) ve uzantısı ("chromagnon.csv" veya "chromagnon.tif") dışında başvuru dosyası ile aynıdır. Hizalama işleminin ayrıntılı bir açıklamasını aynı klasörde oluşturulan "Chromagnon.log" dosyasında bulabilirsiniz.
11. Düzeltilen görüntü görüntüleyicide görünene kadar bekleyin (Şekil 3).
    NOT: Görüntüyü fare ile sürüklemek görüntüyü hareket ettirir ve fare tekerleğinin hareket ettirilmesi yakınlaştırmayı değiştirir. Görüntülenmek üzere Z (ve/veya T) bölümünü değiştirmek için kaydırıcıyı(Şekil 3A)taşıyın. Görüntüleyici görüntüyü yenilemek için çok yavaşsa, sabit diskteki verilere erişmesini engellemek için tüm verileri bellek düğmesine (Şekil 3B)yükleyin. Renk kutularının sol veya sağ kenarını sürüklemek(Şekil 3C)görüntülemek için minimum veya maksimum değerleri kontrol edebilir. Her kanal için düğmeyi tıklatmak(Şekil 3D),seçili kanalı görüntüleyicide göstermek veya gizlemek arasında geçiş yapmak. Renk kutusuna sağ tıklayarak(Şekil 3D)kullanıcıların görüntü için renkleri seçmelerine veya renk çubuğunun ekran seçeneklerini değiştirmelerine olanak tanır ve ayrıca kullanıcıların "ölçeklendirme ..." seçeneğini seçerek ekran ölçeklendirmesi için tam minimum ve maksimum değerleri belirtmelerine olanak tanır. Ortogonal görünüm düğmesini tıklattığınızda(Şekil 3E)ZY ve XZ görünümlerinin görüntüleri gösterilmektedir. Çapraz çizgilerin taşınması, yan görünümlerde gösteriş konumunu değiştirir.

Şekil 3: Görüntü görüntüleyicinin ekran görüntüsü. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

12. Ölçümün doğru yapIlip gerçekleştirilmeyip gerçekleştirilmeyip gerçekleştirilmesini denetlemek için, referans görüntülerini "Başvuru kutusuna" ve "Hedef kutusuna" sürükleyin ve bırakın. Programı çalıştırın ve görüntülerin mükemmel bir şekilde örtüp örtülmeyip örtülmeyip örtülmeyip örtülmeyip örtülmeyip örtülmeyip örtülmey
    NOT: Varsa, "chromagnon.csv" veya "chromagnon.tif" dosyaları ölçümleri atlamak için referans olarak kullanılabilir. Görüntüdeki kromatik kayma düzeltilmemiş sayılsa, Tablo 2'deözetlenen çözümleri deneyin.
13. Örnekteki hizalama parametrelerine erişmek veya hizalama parametrelerinin el ile düzenlenmesi gerektiğinde, "chromagnon.csv" dosyalarını doğrudan herhangi bir metin düzenleyicisi veya elektronik tablo yazılımıyla açın. Düzenlendiğinde , "csv" olarak kaydedin.
    NOT: Değerler "tz", "ty", "tx" ve "r" derecelerinde ve "mz", "benim" ve "mx" için büyütme faktörlerinde piksel olarak dır.
    1. Alternatif olarak, Chromagnon'unReferans veya Hedef kutusuna bir "chromagnon.csv" veya "chromagnon.tif" dosyasını yükleyin(Şekil 1),ardından hizalama düzenleyicisini açmak için çift tıklatın (Şekil 4).
    2. Parametreler düzenlendiğinde bir kanalın ne kadar kaydırılacağını görmek için, düzenleyicideki görüntüyü açmak için başvuru resim dosyasını alt alana(Şekil 4A)sürükleyin ve bırakın. Tablodaki(Şekil 4B)değerleri düzenleyip enter/return tuşuna basArak, değerler değiştikçe ilgili kanalın görüntüsünün nasıl hareket ettigini gözlemleyin. Düzenlemeden sonra, değişiklikleri kaydetmek için kaydet... (Şekil 4C)seçeneğini tıklatın.

Şekil 4: Hizalama parametresi düzenleyicisinin ekran görüntüsü. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

14. Yerel hizalama haritasını kontrol etmek için, "chromagnon.tif"i Chromagnon'unReferans veya Hedef kutusu(Şekil 1)üzerinden yükleyin ve hizalama düzenleyicisini açmak için çift tıklatın (Şekil 4). Büyütme seçim listesinde belirtilen faktöre göre uzunlukları büyütülmüş çizgilerle gösterilen yerel değişimi görüntülemek için görünüm (Şekil 4D)'yi tıklatın (Şekil4E).
    NOT: "Orijinal resim dosyası"(Şekil 4F)belirtilerek, kaymalar orijinal görüntüyle birlikte eşlenir.

4. Mikroskopa özgü yerel hizalama haritası oluşturma

1. 18 μL etanolde 200 nm çapında çok renkli floresan boncukların 2 μL'sini seyreltin.
2. Çözeltiyi girdap layın ve boncuk çözeltisinin 10 μL'sini cam alt kabının ortasına yerleştirin. Yüksek çözünürlüklü mikroskopi için #1,5 kapaklı cam (0,170 mm kalınlığında) kullandığınızdan emin olun.
3. Tamamen kuruması için 1 saat RT'de çanak bırakın.
4. Kalibrasyon için bir mikroskop çanak yerleştirin ve floresan boncuk odaklanmak.
5. Kalibre edilecek mikroskopi ile 2D veya 3D görüntüler elde edin. Sahne konumunu değiştirerek birden çok görüntü elde edin.
6. Chromagnon grafik kullanıcı arabirimini açın.
7. "Başvuru kutusu"(Şekil 1)üzerindeki boncuk resim dosyalarını sürükleyin ve bırakın veya dosya seçici iletişim kutusunu açmak için Başvuru dosyalarına (Şekil 1A)tıklayın.
8. Ortalama referanslar seçeneğini işaretleyin (Şekil 1H). Yerel hizalama seçim listesinden(Şekil 1F), Projeksiyonseçin. En az 60 pencere boyutu kullanın (Şekil 1G). Ölçümleri başlatmak için Tümünü Çalıştır 'ı(Şekil 1I)tıklatın.
   NOT: Mikroskobun yerel hizalama haritasının depolandığı bir ".chromagnon.tif" dosyası oluşturulur.
9. Ölçümden sonra Ekstra parametreleri (Şekil 1K)tıklatın. Mikroskop cihaz kutunuzun Yerel bozulmasından seçim listesini tıklatın ve bir iletişim kutusu açmak için Yeni... seçeneğini belirleyin. 4.8 adımda oluşturulan "chromagnon.tif" dosyasını dosya adı kutusuna sürükleyin ve bırakın veya dosya seçici iletişim kutusunu açmak için dosya yı seç düğmesini tıklatın. Mikroskobun adını girin ve Tamam'ıtıklatın.
10. Çapraz konuşma veya biyolojik kalibrasyon referans görüntülerinden kromatik kaymaları ölçerken, Ekstra parametreleri (Şekil 1K)tıklatın. Mikroskop cihaz kutunuzun yerel bozulmasından, adım 4.9'da belirtilen mikroskobun adını seçin. Tamam'ıtıklatın.
    NOT: Program kapatıldıktan sonra "Mikroskop cihazınızın yerel bozulması" seçeneği kaydedilmez.
11. Bölüm 3'te olduğu gibi yerel hizalama olmadan renk düzeltmeye devam edin.
    NOT: Mikroskop kalibrasyonuna ek olarak yerel hizalama da mümkündür. Bu durumda, yerel hizalama mikroskop kalibrasyonu ile başlar.

Sonuçlar

Bir crosstalk referans görüntüsü kullanılarak kromatik kaydırma düzeltme örneği Şekil 5'tegösterilmiştir. Görüntü, tek bir kamera ile donatılmış geniş alan mikroskobu ile elde edildi. DAPI'den floresan emisyonu mavi, yeşil ve kırmızı kanalları düzeltmek için referans olarak(Şekil 5A,B)kullanılmıştır. Görüntü, her biri 256 x 256 pikselden oluşan 60 Z dilimden oluşan 3 kanaldan oluşmaktadır. Görüntüler renk kaymalarını ölçmeden önce dekonvolved edildi. Chromagnon kullanarak yerel kromatik vardiya ölçme Intel Core i7 (dört çekirdekli, 8-threads, 2.7 GHz), 16 GB RAM ve 1 TB flaş depolama ile mac 51 s aldı. Hizalama parametresi, referans görüntüsüyle tam olarak aynı sayıda voxel olan hedef görüntüye(Şekil 5C,D)uygulanmıştır. Hizalanmış dosyanın hazırlanması 3 s aldı. Hizalama işlemi sırasında kenar piksellerinin (Şekil 1C'dekikırpma kenar boşlukları onay kutusu) kırpığı sonucunda, voxel sayısı hizalamadan sonra azaltıldı(Şekil 5B, 51 Z dilimleri, 252 x 251 piksel). Anafaz köprüsündeki DNA (ok uçları ile gösterilir) hizalamadan önce nükleer zarfın dışında yanlış görülür(Şekil 5C, XZ görünümünü gösteren alt panelde belirgin), ancak hizalamadan sonra zarfın içinde beklendiği gibi(Şekil 5D).

Biyolojik kalibrasyon referans görüntüsünü kullanarak kromatik kayma düzeltmeörneği Şekil 6'dagösterilmiştir. Görüntüler üç kamera ile donatılmış bir SIM mikroskop ile elde edildi. Mavi, yeşil ve kırmızı boyalarla konjuge phalloidinlerle boyanmış HeLa hücrelerinin üç görüntüsü ortalaması na göre belirlenmiştir(Şekil 6A). Referans görüntü, her biri 1.024 x 1.024 pikselden oluşan 76 Z diliminden oluşan 3 kanaldan oluşmaktadır. Chromagnon kullanılarak yerel hizalama olmadan kromatik kaymaların ölçülmesi yukarıda açıklanan Mac sisteminde 194 s gereklidir. Parametre, her biri 1.024 x 1.024 pikselden oluşan 73 Z diliminden oluşan 3 kanaldan oluşan hedef görüntüye uygulandı. Hizalanmış dosyanın üretimi 25 s aldı. XZ görünümü Z boyunca ve X yönleri boyunca biraz yanlış kanal konumlarını gösterir(Şekil 6A,C) ancak bu yanlış kayıt hizalamadan sonra düzeltilmiştir (Şekil 6B,D).

Şekil 5: Çapraz konuşma referans görüntüsüyle hizalama örneği. HeLa hücreleri DNA için DAPI ile boyandı (macenta gösterilir), Alexa Fluor 488 (sarı gösterilir) nükleer zarf için, ve Alexa Fluor 555 (mavi gösterilir) mikrotübüller için. Görüntüler tek bir kamera ile 3D geniş alan mikroskopisi ile elde edildi ve deconvolved. (A,B) Dapi emisyon kullanarak temsili bir crosstalk referans görüntü, önce ve Chromagnontarafından hizalama sonra . Üç renk kanalları overlaid olarak gösterilir. (C,D) Hizalamadan önce ve sonra üç kanalhalinde 3B yığının optik bir bölümü. Ok başları ile gösterilen anafaz köprüsünde eksenel renk sapması belirgindir. A panelindeki ölçek çubuğu tüm paneller için 5 μm'yi gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 6: Biyolojik kalibrasyon referans görüntüsü ile hizalama örneği Görüntüler üç kamera ile donatılmış 3D-SIM ile elde edildi. (A,B) (A ) ve sonra (AB) hizalamadan önce üç görüntüden ortalama bir referans görüntü. HeLa hücreleri Alexa Fluor 405, 488 veya 594 ile konjuge phalloidin ile boyandı. (C,D) (C) ve sonrası (D) hizalamadan önceki hedef görüntü. HeLa hücreleri DNA için DAPI ile boyandı (macenta gösterilir), Alexa Fluor 488 (sarı gösterilir) nükleer zarf için, ve Alexa Fluor 594 (mavi gösterilir) mikrotübüller için. A panelindeki ölçek çubuğu tüm paneller için 5 μm'yi gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

Renk düzeltme prosedürü doğruluk ve çaba arasında bir dengedir. Gereksiz çabaları kaydetmek için, çalışmanız için ne kadar doğruluk gerektiğini bilmek daha iyidir. Konvansiyonel geniş alan (canlı) görüntüleme için en yüksek doğruluk gerekli olmayabilir ve bu nedenle, parlak alan referans görüntüleri genellikle renk değişimini düzeltmek için yeterlidir. Benzer şekilde, görüntüleme durumu ve ortam sabit olduğunda, biyolojik kalibrasyonun tekrar tekrar kullanılması zamandan tasarruf sağlayacaktır. Öte yandan, son derece doğru bir kayıt isteniyorsa, yüksek kaliteli crosstalk veya biyolojik kalibrasyon referans görüntüleri gereklidir. En iyi performans için, referans görüntüleri mümkün olduğunca hedef görüntüler olarak benzer koşullar ve zamanlamaları ile elde edilmelidir. Hem referans hem de hedef görüntüler aynı mikroskopi ile elde edildiği sürece, daha yüksek uzamsal çözünürlük düzeltme doğruluğunu artıracaktır. Deconvolution hem referans hem de hedef görüntüler için kullanılabilirse, düzeltmeden önce bunu uygulamak düzeltme doğruluğunu artırabilir. Ayrıca, en iyi performans için optik (Z) eksenine ait örnekleme teoremi, hassas alt piksel enterpolasyonu için hem referans hem de hedef dosyasında gerçekleştirilmelidir (protokol adımı 2.1.3).

Kromatik değişimin düzeltilememesi yanlış sonuçlara yol açar. Ayrıca, yanlış kalibrasyon kullanarak bile kromatik vardiya yerine bunları düzeltmek daha kötü olabilir, ve bu nedenle kaçınılması gerekir. Hataların olası nedenlerini ve bunların ortak çözümlerini Tablo 2'deözetledik. Bir hatanın nedenini incelemek için öncelikle, referans görüntüdeki renk değişiminin tam olarak düzeltilip düzeltilmeyişecenin görsel olarak kontrol edilmesi gerekir (protokol adım 3.12). Çoğu hata referans görüntülerin kalitesinden kaynaklanmaktadır ve Tablo 2'dekiaçıklamalara göre kolayca giderilir. Referans görüntülerin kalitesine ilişkin olarak, tüm görüş alanı örnekle doldurulmamışsa küresel hizalamanın doğruluğunun azaldığını belirtmek önemlidir (Şekil 7, Tablo 2). Şekil 7A'dagösterilen iyi örnekle karşılaştırıldığında, Şekil 7B'de gösterilen kötü örnek, sol üst bölgede yalnızca üç nükleer zarf içerir ve Chromagnon bu görüntünün bir bölümünü hizalamayı başaramaz. Bunun nedeni, Chromagnon'un küresel hizalama yönteminin, döndürme ve büyütme farklılıklarını yüksek doğrulukla ölçmek için görüş alanını dört bölgeye(Şekil 7C)bölmesidir³. Bu yöntem, doğru çalıştırılırsa, günlük polar dönüşümü ve simpleks^yöntemleri3 gibi diğer doğrusal yöntemlerden daha doğru bir sıradır. Dört bölgeden herhangi biri kullanılamıyorsa, Chromagnon daha az etkili doğrusal yöntemlere geçecektir. Bu nedenle, en iyi performans için Şekil 7B ve Şekil 7C'de gösterilen örnekler istenmez ve dört bölge nesnelerle doldurulmalıdır. Kullanıcılar, günlük dosyasına bakarak görüş alanının herhangi bir kuadratik bölgesinin ölçülemez olup olmadığını kontrol edebilir ("Chromagnon.log"; bkz. protokol adımı 3.10). Neyse ki, bu sorun kolayca birden fazla biyolojik kalibrasyon görüntüleri ortalama veya crosstalk veya parlak alan referans görüntüleri(Tablo 2)için yerel hizalama kullanarak aşılabilir. Referans görüntülerinin düzeltilememesi durumunda, hedef görüntülerin düzeltilmemesi nin belirlenmesi daha zordur. Dosya biçimlerindeki farklılıklar, görüntüleme koşulları, görüntüleme zamanlamaları, referans ve hedef görüntüler arasındaki görüntüleme/hizalama yöntemleri(Tablo 2)gibi hatalar ortaya çıktığından, kullanıcılar hedef görüntülerden farklı koşullarda/zamanlamalarda elde edilen referans görüntülerini kullanırken her zaman dikkatli olmalıdır. Bazı örnek görüntüler, iyi ve kötü örnek görüntülerin somut bir fikrini elde etmek için test(https://github.com/macronucleus/Chromagnon)için kullanılabilir.

Sorun	Neden	Çözüm
Başvuru görüntüsünü düzeltemedi	Düşük kontrast	Mümkünse daha yüksek kontrastlı görüntü elde edin. Parlak alan referans görüntüsü kullanılırsa, hücrenin daha yüksek kontrastını elde etmek için görüntüyü su tabanlı bir çözeltide yeniden edinin. Alternatif olarak, hesaplamalı gürültü azaltma (örneğin Gaussian filtreleme) uygulamayı deneyin. Gürültüye karşı daha hassas olan yerel hizalamayı kapatın.
	Alakasız görüntülerin kirlenmesi	Mümkünse örnekteki ilgisiz görüntülerin kaynağını kaldırın. Crosstalk referans görüntüleri için, hedef görüntüler için kullanılan boyaların uyarma spektrumlarını kontrol edin. Boyalar bir crosstalk görüntüsünün edinimi sırasında heyecanlıysa (örneğin Alexa Fluor 568 veya 594), diğer boyaları düşünün (örneğin Alexa Fluor 555). Kamera çipindeki tozlar belirgin bir kanal farkı oluşturuyorsa, kamera çipini temizleyin veya hesaplamalı düz alan yöntemi kullanın.
	Kozmik ışıntarafından yapılmış son derece parlak bir nokta	Mümkünse görüntüyü yeniden edinin. Alternatif olarak, hesaplamalı gürültü azaltma (örneğin, Ortanca veya Gaussian filtreleme) uygulamayı deneyin.
	Dekonvolution eserler (eksenel ve lateral kenarlarda yapay sinyaller)	Deconvolution sonra kenar piksel veya Z bölümleri kırpın. Bir taraf kesilmişse, görüntü merkezini korumak için diğer taraf da kesilmelidir.
	Z adım boyutu çok seyrek	Protokol 2.1.3'te yazıldığı gibi Nyquist kriterini yerine getirmek için bir Z yığını alınmalıdır.
	Optik sapma	Küresel sapma, kullanıcıların neden olduğu en büyük sapmadır. Numune için doğru objektif lensi seçin ve 170 μm'lik bir kapak kalınlığı kullanın. Objektif lens bir düzeltme halkası ile donatılmışsa, odaktan en yüksek floresan sayısının elde edildiği konumu bulmak için ayarlayın. Düzeltme halkası olmayan bir yağ daldırma hedefi durumunda, odaktaki floresan sayısını artıran daldırma yağının kırılma indeksini ayarlayın.
	Görüş alanı doldurulmamış (Res. 7)	Biyolojik kalibrasyon referans görüntüleri durumunda, ortalama birçok görüntü. Çapraz konuşma veya parlak alan referans görüntüleri söz konusu olduğunda, yerel hizalamayı kullanın.
	Tanımlanamayan bir yazılım hatası	Sorunu GitHub(https://github.com/macronucleus/Chromagnon/issues) aracılığıyla bildirin
Hedef görüntü düzeltileme	Görüntü dosyasının meta verileri kaybolur	Tam meta veriler içeren özgün mikroskop dosya biçimini kullanın ve işlemeden önce çok sayfalı bir tiff dosyasına dönüştürmeyi kaçının. Protokol 3.3'te yazıldığı gibi kanalların aynı sırasını kullanın.
	Verilen mikroskopi için yanlış hizalama yöntemleri	Biyolojik kalibrasyon referans görüntülerinden hedef görüntülere kadar ölçüm yaparken yerel hizalama yöntemini uygulamayın. Geniş alan mikroskopisi dışında çapraz konuşma referans görüntüleri kullanmayın.
	Görüntüleme koşullarındaki farklılıklar	Görüntüleme koşullarını, protokol 2.3.3'te yazıldığı gibi referans ve hedef görüntüler arasında sabit tutun.
	Numune farklılıkları (coverslip dahil)	Her zaman aynı montaj ortamını, coverslip'i (örn. 1.5H no) ve benzer bir odak derinliği kullanın.
	Kalibrasyon son yapıldığından beri mikroskop kayması	Her iki haftada bir kalibrasyon yapın. Sıcaklığı sabit tutun ve mikroskobun donanım sürüklenmesini önlemek için yüzen bir tablo kullanın.

Tablo 2: Renk düzeltmesi için sorun giderme.

Şekil 7: Referans görüntüleri örnekleri. GFP ve mCherry ile etiketlenmiş fisyon maya hücrelerinde nükleer zarf. Görüntüler geleneksel geniş alan mikroskobu ile elde edildi. Kromatik kaymalar, görüntülerin kendileri referans görüntü olarak kullanılarak yerel hizalama olmadan Chromagnon kullanılarak düzeltildi. Görüntüler daha sonra ayrıntıları göstermek için deconvolved edildi. (A) Görüş alanında birçok nesne ile iyi bir örnek. (B) Yalnızca sol üst köşedeki nesnelerle kötü bir örnek. Görüntünün belirli bir bölgesinde yanlış hizalama açıktır. (C) Dörtliki bölümden birinin (noktalı çapraz çizgilerle ayrılmış) boş olduğu istenmeyen bir örnek. A panelindeki ölçek çubuğu tam alan görünümü için 5 m, genişletilmiş görünüm için 1,25 m olduğunu gösterir ve tüm paneller için geçerlidir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Bu protokolde üç farklı referans türü(Tablo 1)açıklanmıştır. Bunlar arasında, crosstalk referans görüntüleri ve biyolojik kalibrasyon referans görüntüleri daha dikkatli tartışma gerekir. Crosstalk referans görüntüleri için, örnekler DAPI veya Hoechst 33342 ile boyanmış ve gliserol veya ticari montaj medya monte verimli mavi hizalamak için kullanılabilir, yeşil, ve kırmızı kanallar. Benzer şekilde, Alexa Fluor 488 yeşil ve kırmızı kanalları hizalamak için kullanılabilir. Ancak, DAPI ve Hoechst dışında birçok mavi boyalar en yeşil ve kırmızı boyalar daha hızlı dimmer ve çürüme beri crosstalk floresan elde genellikle zordur. Ayrıca, modern boyaların emisyon spektrumları daha dardır, bu da bu yöntemle üçten fazla kanalın hizalanmasını zorlaştırır. Ayrıca bazı ortak kırmızı boyalar (örneğin, Alexa Un 568 ve 594, ama Alexa Fluor 555) bu mor ışık tarafından heyecanlı olabilir, mavi boyalar yüksek kontrastlı crosstalk görüntüleri elde önlemek ödenmelidir. Başka bir dezavantajı da, bu yöntemin uyarma ışık yollarının renk sapması çok renkli uyarmada ölçülemez, çünkü uyarma için sadece tek bir uyarma dalga boyu kullanılır(Tablo 1). En gelişmiş mikroskopi değiştirilmiş aydınlatma optik kullandığından, bu yöntemin uygulanması sınırlıdır. Yine de, yüksek düzeltme doğruluğu bu protokolde açıklanacak kadar avantajlıdır. Genel olarak, ağartma veya fototoksik etkileri önlemek için bir hedef görüntü sonra bir crosstalk görüntü alınmalıdır. Geniş alan modu ile gözlenen SMLM için, floresan boyalar görüntüleme sırasında ağartılmış olabilir gibi bir hedef görüntü elde etmeden önce bir referans görüntü elde edilmelidir.

Biyolojik kalibrasyon referans görüntüleri, kullanıcıların ek numune hazırlama pahasına istenilen sayıda kanalı kolayca hizalayabilmelerini sağlar. Biyolojik kalibrasyon referans görüntülerinin bir diğer avantajı da, tüm görüş alanlarını doldurmaya yardımcı olan birden fazla başvurunun "ortalama" bulunmasıdır. Kalibrasyon numunesi farklı bir slaytüzerinde hazırlanırsa, bu yöntem görüntüleme koşullarında farklılıklar yaşayabilir. Bu sorunun çoğu, ticari odacıklı örtüler(Tablo 1)kullanılarak hem hedefler hem de referanslar aynı slayt üzerinde hazırlanırsa ve diğer görüntüleme koşulları protokol adım 2.3.3'te olduğu gibi sabit tutulursa bu sorunun çoğu çözülebilir. Bu durumda, crosstalk referans görüntüleri benzer bir düzeltme doğruluğu beklenebilir³. Burada gösterildiği gibi phalloidin kullanmak için protokol birden fazla renk ile tek bir hücresel yapı leke için en kolay yollarından biridir. Biyolojik kalibrasyon örnekleri hazırlamak için çok sayıda olası senaryo vardır. İmmünboyama için, bir örnek tek bir primer antikor ile etiketlenebilir ve ardından birden fazla rengin ikincil antikorları ile boyanabilir. Bu şekilde, tek bir hedef yapısı birden çok renkile etiketlenebilir. Alternatif olarak, 5-ethynyl-2'-deoksiuridin, "tıklayın" kimya etiketleri tarafından tespit yeni yüksek yoğunlukta birden fazla renkte SENTEZLENEN DNA, daha önce ayrıntılı olarak açıklandığı gibi⁸. Canlı hücreler için, aynı yapıyı iki renkle etiketlemek için GFP veya mCherry'ye kaynaşmış bir genin iki kopyasını barındıran transgenik bir suşu hazırlamak yararlıdır. Genin kopya sayısı membran proteinleri için sıklıkla gözlenen kritik sayılsa, genin tek bir kopyası GFP ve mCherry ile birlikte kaynaştırılabilir(Şekil 7). MEOS2¹⁸gibi fotodönüştürülebilir floresan proteinler, fotodönüşümlü veya fotodönüşümsüz her iki protein türünü elde etmek için orta derecede menekşe ışığını aydınlatarak da kullanılabilir. Düşük oksijen koşullarında, GFP de kırmızı^19,,20yeşil bir fotodönüştürülebilir protein olarak kullanılabilir. Doğru kalibrasyon örneğinin seçilmesi böylece denemeyi daha sağlam hale getirecektir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
% 16 formaldehit çözeltisi	Polyscience	18814-10
35 mm cam tabanlı çanak	MatTek	P35G-1.5-10-C
Alexa Fluor 405 phalloidin	Thermo Fisher Scientific	A30104
Alexa Fluor 488 phalloidin	Thermo Fisher Scientific	A12379
Alexa Fluor 594 phalloidin	Thermo Fisher Scientific	A12381
Sığır Serumu	Thermo Fisher Scientific	16170078
Lamel	Matsunami	No. 1S HT
DAPI (4 ',6-Diamidino-2-fenilindol, Dihidroklorür)	Thermo Fisher Scientific	D1306
Dulbecco' s L-Gln ve sodyum piruvat içeren Modifiye Eagle Ortamı	Nacalai Tesque	08458-16
Montaj ortamı (VECTASHIELD)	Vektör Laboratuvarları	H-1000
Fare anti-tübülin monoklonal antikoru (TAT1)			Ref 15'te açıklanmıştır.
Nunc Lab-Tek II odacıklı kapak camı (8 kuyulu)	Thermo Fisher Scientific	155409
Tavşan anti-emerin poliklonal antikoru (ED1)			Hiroshi Yorifuji, Gunma Üniversitesi, Gunma, Japonya ve Kiichi Arahata, Ulusal Nöroloji ve Psikiyatri Merkezi, Tokyo, Japonya'dan bir hediye; merhum.
Alexa Fluor 488	Thermo Fisher Scientific	A-11034
antikor Alexa Fluor 555 ile ikincil antikor	Thermo Fisher Scientific	A-21424
Alexa Fluor 594 ile ikincil antikor	Thermo Fisher Scientific	A-11032
TetraSpeck Mikroküreler, 0.2 ve mikro; m	Termo Balıkçı Bilimsel	T7280