Yöntem makalesi

Dondurulmuş Doku Kesitlerinin Multispektral Floresan Görüntülemesi için Hızlı Bir Yöntem

DOI:

10.3791/60806

⸱

30 Mart 2020

 ,  ,  , 
1Robert Lurie Comprehensive Cancer Center and Department of Dermatology, Feinberg School of Medicine, Northwestern University, 2Department of Pathology, University of Illinois at Chicago, 3Department of Microbiology and Immunology, Feinberg School of Medicine, Northwestern University

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biz dondurulmuş dokularda multispektral görüntüleme gerçekleştirmek için hızlı bir boyama yöntemi açıklar.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Formalin-sabit parafin gömülü (FFPE) dokularda multispektral floresan görüntüleme, tek bir doku örneğinde antijen koekspresyonu ve belirteçlerin mekansal dağılımı hakkında bilgi sağlayabilen birden fazla belirteç saptanmasını sağlar. Ancak, formalin-sabit dokular için uygun antikoreksikliği tespit edilebilir belirteçlerin doğasını kısıtlayabilir. Buna ek olarak, boyama yöntemi zaman alıcıdır. Burada dondurulmuş dokularda multispektral floresan görüntüleme yapmak için hızlı bir yöntem açıklanmaktadır. Yöntem kullanılan florofor kombinasyonları, fare ve insan dondurulmuş dokuların boyama için ayrıntılı adımlar ve tarama, edinim ve analiz prosedürleri içerir. Boyama analizi için, ticari olarak kullanılabilen yarı otomatik multispektral floresan görüntüleme sistemi kullanılır. Bu yöntemle, en fazla altı farklı belirteçler lekeli ve tek bir dondurulmuş doku bölümünde tespit edildi. Makine öğrenme analiz yazılımı kantitatif analiz için kullanılabilecek hücreleri fenotip olabilir. Burada dondurulmuş dokular için açıklanan yöntem FFPE dokularında tespit edilemeyen veya FFPE dokuları için antikor bulunmayan belirteçlerin saptanmasında yararlıdır.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikroskobik görüntüleme tekniklerindeki son gelişmeler, biyolojik süreçler ve hastalık durumları hakkındaki bilgi mizi ve anlayışımızı önemli ölçüde geliştirmiştir. Kromozomimmünohistokimya (IHC) yoluyla dokularda proteinlerin yerinde tespiti patolojide rutin olarak yapılmaktadır. Ancak, kromojenik IHC boyama kullanarak birden fazla belirteç lerin saptanması1 zorlu ve birden fazla biyolojik belirteçtekbir doku örneğinde etiketlendiği multipleks immünoresans (mIF) boyama yaklaşımları kullanmak için yeni yöntemler geliştirilmektedir. Doku mimarisi, hücrelerin mekansal dağılımı ve antijen ko-ekspresyonu ile ilgili bilgiler tek bir doku örneği2yakalanır, çünkü birden fazla biyolojik belirteçlerin tespiti yararlıdır. Multispektral floresan görüntüleme teknolojisinin kullanımı birden fazla biyolojik belirteç lerin tespitini mümkün kılmıştır. Bu teknolojide, belirli optik kullanarak her bir florofor floresan spektrumları ayrılabilir veya "karışmamış", herhangi bir spektral crosstalk olmadan birden fazla belirteçlerin algılanmasını sağlayan3. Multispektral floresan görüntüleme hücre biyolojisi, preklinik ilaç gelişimi, klinik patoloji ve tümör immün profilleme4,5,5,6kritik bir yaklaşım haline gelmektedir. Daha da önemlisi, bağışıklık hücrelerinin aralıklı dağılımı (özellikle CD8 T hücreleri) mevcut tümörleri olan hastalar için bir prognostik faktör olarak hizmet verebilir7.

Çokleksi floresan boyama için çeşitli yaklaşımlar geliştirilmiştir ve aynı anda veya sırayla yapılabilir. Eşzamanlı boyama yönteminde, tüm antikorlar tek bir adımda bir kokteyl olarak doku etiketlemek için bir araya eklenir. UltraPlex teknolojisi hapten konjuge birincil antikorlar bir kokteyl ve florofor konjuge anti-hapten ikincil antikorlar bir kokteyl kullanır. InSituPlex teknolojisi8 aynı anda bir amplifikasyon adım ve son olarak birincil antikor her benzersiz DNA dizisi tamamlayıcı florofor konjuge problar takip doku eklenir benzersiz DNA konjuge birincil antikorlar bir kokteyl kullanır. Bu teknolojilerin her ikisi de nükleer boyama için dört belirteç artı 4',6-diamino-2-fenilindole (DAPI) tespitisağlar. Eşzamanlı multipleks boyama için diğer iki yaklaşım ikincil iyon kütle spektrometresi dayanmaktadır9. Hyperion Görüntüleme Sistemi 37 belirteçleri tespit etmek için görüntüleme kitle sitometri10 kullanır. Bu teknoloji dokuları lekelemek için metal konjuge antikorlar bir kokteyl kullanır, ve dokuların belirli alanlarda bir lazer tarafından ablated ve metal iyonları tespit edilen bir kitle sitometre aktarılır. Başka bir benzer teknoloji IONPath, hangi multiplexed iyon ışını görüntüleme teknolojisi11kullanır. Bu teknoloji, metal konjuge antikorları ablate lazer yerine değiştirilmiş bir kütle spektrometresi alet ve oksijen iyon kaynağı kullanır. Tüm bu eşzamanlı multipleks boyama yaklaşımları birden fazla belirteçlerin saptanmasını sağlarken, DNA, haptens veya metallerin antikorlara konjugasyonu için yapılan maliyetler, ablasyon nedeniyle doku kaybı ve karıştırmayı ortadan çıkarmak için kapsamlı görüntü işleme hafife alınamaz. Ayrıca, kitleri ve boyama protokolleri şu anda sadece FFPE dokular için kullanılabilir ve özel paneller geliştirmek ek zaman ve harcama gerektirir.

Sıralı multipleks boyama yöntemi, aksine, bir işaretleyici bir antikor ile doku etiketleme içerir, antikor kaldırmak için sıyırma, birden fazla işaretleri etiketlemek için bu sürecin ardışık tekrarları takip12. Tiramid sinyal amplifikasyonu (TSA) en sık kullanılan ardışık çoklama yöntemidir. Diğer iki çoklama teknolojisi, eşzamanlı ve sıralı boyama yöntemlerinin bir kombinasyonunu kullanır. CODEX platformu13, 50'ye kadar belirteç tespit etmek için süreci görüntüleme, sıyırma ve yineleme nin ardından indeksli polimerizasyon adımı kullanılarak florofor ile etiketlenen benzersiz DNA oligonükleotid dizilerine konjuge antikorlardan oluşan bir kokteyl kullanır. MultiOmyx multiplex boyama yaklaşımı14 üç ila dört florofor konjuge antikorlar bir kokteyl ile boyama bir yineleme, görüntüleme, floroforlar söndürme, ve tek bir bölümde 60 belirteçleri kadar tespit etmek için bu döngünüks. Eşzamanlı multipleks boyama yöntemine benzer şekilde, çok çeşitli belirteçler tespit edilebilirken, boyama, görüntü edinme, işleme ve analiz de dahil olmak üzere zaman geniştir. Sıyırma/söndürme adımı, doku örneğinin ısıtılması ve/veya beyazlatma işlemini içerir ve böylece, sıralı multipleks boyama yaklaşımı genellikle ısıtma veya ağartma üzerine doku bütünlüğünü koruyan FFPE dokularda gerçekleştirilir.

Formalin fiksasyonu ve sonraki parafin katıştırma klinik ortamda kolayca yapılır, doku blokları nın saklanması kolaydır ve birkaç multipleks boyama protokolü mevcuttur. Ancak, işleme, katıştırma ve FFPE dokuların deparafinizasyon, yanı sıra antijen alma15, antikorlar daha iyi epitoplar erişebilirsiniz hangi bir süreç, zaman alıcıdır. Ayrıca, FFPE dokularında yer alan işleme otofloresans katkıda16 ve maskeler hedef epitoplar, değişkenlik ve FFPE dokularda antijenleri tespit etmek için mevcut antikor klon eksikliği ile sonuçlanan17,18,19. Bir örnek insan lökosit antijeni (HLA) sınıf I alel20olduğunu. Buna karşılık, dokuların hızlı dondurma önce veya sabitleme sonra kapsamlı işleme adımları içermez, antijen alma ihtiyacını atlatmak21,22, ve hedeflerin daha geniş bir yelpazede tespit etmek için yararlı hale. Bu nedenle, multispektral floresan görüntüleme için dondurulmuş dokuların kullanılması preklinik ve klinik çalışmalar için hedefleri tespit etmek için değerli olabilir.

FFPE dokuları kullanırken yukarıda belirtilen sınırlamalar göz önüne alındığında, dondurulmuş dokularda multispektral floresan görüntüleme yapılıp yapılamayacağını sorduk. Bu soruyu çözmek için, birden fazla antijeni tespit etmek için florofor konjuge antikorlardan oluşan bir panel kullanarak eşzamanlı çok katlı boyama yöntemini test ettik ve yarı otomatik multispektral görüntüleme sistemi kullanarak boyama analiz ettik. Aynı anda 90 dakika içinde tek bir doku bölümünde altı belirteçleri kadar leke başardık.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Laboratuarımızdan fare dalak ve HLF16 fare tümör dokuları23 elde edildi. İnsan bademcik dokusu ticari bir satıcıdan satın alındı. Ayrıntılar Malzeme Tablosu'ndaverilmiştir.

1. Doku Katıştırma

  1. Taze dokuyu OCT (optimum kesme sıcaklığı) çözeltisi ve kuru buz veya sıvı nitrojen kullanarak ani donma yerleştirin.
  2. Dokuları -80 °C'de saklayın.

2. Kriyoding

  1. -25 °C sıcaklıkta ayarlanmış bir kriyostatta 8 μm kesitler kesin.
    NOT: Tercih edilen kesit kalınlığı daha net görüntüler oluşturmak için ayarlanabilir.
  2. Bölümleri yüklü cam slaytlara yerleştirin.
  3. Histoloji sınıfı buz gibi aseton 10 dakika sabitleme den önce oda sıcaklığında (RT) 1 saat boyunca bölümleri hava kurutun.
    NOT: Aseton suda çözünen proteinlerin pıhtılaşmasına neden olur ve lipidleri ayıklar ancak karbonhidrat içeren bileşenleri etkilemez. Buna karşılık, formalin en lipidler korur ve karbonhidratlar üzerinde çok az etkisi vardır24. Fiksatif seçimi, algılanan işaretçi seçimine bağlı olarak önemlidir.
  4. Slaytları -20 °C'de saklayın.

3. Antikor ve Florofororların Seçimi

NOT: Doku boyama önce, sağlam ve özellikle aseton sabit doku sıralı bölümler içinde ilgi onların antijenleri leke olacak antikor klonları doğrulanmalıdır. Bazı antikorlar farklı bir fiksatif gerektirebilir ve paneldeki diğer antikorlarla uyumlulukları da ampirik olarak belirlenmelidir. Amaç aynı zamanda DAPI, FITC, Cy3, Texas Red ve Cy5 için epifloresan filtreleri ile tespit edilebilir minimal örtüşme ile florofores belirlemektir.

  1. Bilinen ekspresyon hedef antijeni ile doku kesitlerinde konvansiyonel IHC veya immünofloresan (IF) tespiti ile boyama onaylayın.
  2. Yarı otomatik görüntüleme sisteminde bulunan uyarma ve emisyon filtre setlerini kullanarak ve florofokonskonslu primer antikorların çeşitli kombinasyonlarını test ettikten sonra, en az spektral çakışma olan floroforları hazırlayın (örn. Tablo 1'ebakınız).

4. Boyama

NOT: Doku rehidrasyonu ve kaymayı Coplin kavanozunda yapıldı. Bloke ve antikor kuluçka adımları nemlendirilmiş bir slayt kutusunda gerçekleştirildi.

  1. Slaytların 5-10 dakika boyunca RT'ye ısınmasına izin verin.
  2. Fosfatta rehidrat 5 dk.
  3. Antikorlar ile dokuları boyama önce bir engelleme adımı gerçekleştirin. Fare bölümleri için, RT'de 10 dakika boyunca özel engelleme çözümünün (Bkz. Malzeme Tablosu)kullanın. İnsan kesitleri için PBS'de 15 dakika boyunca seyreltilmiş %10 normal havuzlu insan serumu (NHS) RT kullanın.
    NOT: Kullanılacak takip prosedürlerine bağlı olarak bölümlerin belirli özelliklerini korumak için gerektiğinde farklı engelleme arabellekleri test edilebilir.
  4. Tıkalı ktan sonra pbs 5 dakika slaytlar yıkayın.
  5. Multipleks boyama için, önceden belirlenmiş optimal seyreltmelerde uyumlu floroforlarla antikorlardan oluşan bir kokteyl hazırlayın.
  6. Slaytlara florofor konjuge antikorkokteylekleyin. Tek işaretli boyama için, slayta yalnızca birincil konjuge antikor ekleyin.
  7. Herhangi bir birincil konjuge antikor ilave sayılmadan aynı boyama işleminden geçen bir kontrol lekesiz slayt ekleyin.
  8. Karanlıkta RT'de 1 saat slaytları kuluçkaya yatırın ve slaytları 5 dakika boyunca PBS ile 2x yıkayın. Bundan sonra, ortaya çıkan slayt çokkanlı olarak adlandırılır.
  9. Karşı leke için, çokkatlı slayt dapi ekleyin, RT karanlıkta 7 dakika kuluçka ve 5 dakika her için PBS ile slaytlar 2x yıkayın. Tek lekeli ve lekesiz slaytları lekelemeyin.
  10. Coverslip için, montaj ortamı bir damla ekleyin ve yavaşça doku üzerinde cam kapak kayma yerleştirin.

5. Spektral Kütüphane Hazırlama

  1. Görüntü edinimi
    1. Lambanın gücünü %100'e ayarlayın. FFPE dokularında floresan tespiti bir sinyal amplifikasyon adımı içerdiğinden genellikle güç %10'a ayarlanır.
    2. Mikroskop işletim yazılımını açarak başlayın (bkz. Malzeme Tablosu).
    3. Protokolü Edit'i ve ardından Yeni Protokol'useçin.
    4. Bir "Protokol Adı" sağlayın ve Görüntüleme Modualtında Floresan'ı seçin ve bir "Çalışma Adı" sağlayın.
    5. Tek lekeli slaytları sahneye yerleştirin ve boyama sağlamak için her belirteçleri ilgili floresan kanalında inceleyin. Doku üzerinde işaretçi için en güçlü sinyali ifade eden bir bölge seçin.
    6. Otomatik Netleme ve Otomatik Pozlama seçeneklerini kullanarak pozlama sürelerini ayarlayın.
    7. Tek lekeli ve lekesiz slaytlar için anlık görüntüler edinin ve protokolü kaydedin.
      NOT: Aşağıdaki adımlar, belirli boyamaları doğrulamak ve antikor çapraz konuşmasını belirlemek için tek lekeli ve lekesiz slaytlar kullanılarak makine öğrenimi yazılımında (bkz. Malzemeler Tablosu'nabakınız) gerçekleştirilir.
    8. Yazılımdaki Kitaplıkoluştur sekmesinin altında, her tek lekeli slayt görüntüsünü yükleyin, uygun Flor'u seçin ve Ayıkla'yıtıklatın. Yazılım otomatik olarak Fluor seçilen floresan sinyali ayıklamak olacaktır.
    9. Çıkarılan rengi kaydetmek için Mağazaya Kaydet'itıklatın. Bir "Yeni Grup" oluşturulabilir veya çıkarılan renk varolan bir gruba depolanabilir.
  2. Spektral kitaplığı doğrulama
    1. Her filtre kümesi için çıkarılan görüntünün sağında bulunan emisyon spektral eğrisi penceresini kontrol edin.
      NOT: Spektral eğri yalnızca florofor tespit edilen filtre kümelerinde gözlenirse çıkarılan sinyal doğrudur. Yanlış filtre kümesinde bir spektral eğri gözlenirse, filtre kümesinde beklenen birincil sinyalin yeterince güçlü olmadığı veya yazılımın muhtemelen spektral çakışma nedeniyle çok yüksek başka bir sinyal algıladığını söyleyebilir. Bu durumda, ilk olarak görüntüdeki floresan işaretçisini ve otofloresansı ifade eden bölgelerin etrafında bölgeler çizmek için İşleme Bölgeleri Çizimi aracını kullanmayı deneyin. Bu, yazılımı gerçek sinyali algılamak ve müdahale eden sinyalleri kaldırmak için eğitiyor. Bu işe yaramazsa, farklı antikor titrasyonları test etmek için tek lekeli slayt için boyama işlemini tekrarlayın.

6. Multispektral Görüntüleme

NOT: Spektral kitaplık oluşturulduktan ve doğrulandıktan sonra, çoklekeli slayt için aşağıdaki adımları gerçekleştirin.

  1. Tüm slayt tonu
    1. Bölüm 5.1'de belirtildiği gibi çok lekeli slayttaki odak ve pozlama süreleriniayarlayın.
    2. Slaytları Tarayıp, Yeni Görev oluşturun ve yukarıda kaydedilen protokolü seçin.
    3. Çok lekeli slaytta tüm slayt tayini gerçekleştirin.
    4. Tüm slayt tonu yazılımını kullanarak, slayt tonu görüntüsünün tamamını açın. Bu görüntü, karıştırılmamış olarak spekülasyon olmamıştır.
    5. Damga veya YG aracını kullanarak tüm slayt tonu görüntüsünde ilgi çekici bölgeleri (YG) seçin. Bu ROI'lar spektral karıştırma ve analiz için kullanılmak üzere 6.1.1'de belirlenen pozlama süreleri kullanılarak taranır.
    6. 20x büyütmede ROI'lar elde etmek için İşlem Slaytı'na tıklayın
  2. Spektral unmixing
    1. ROI'lar alındıktan sonra, makine öğrenimi yazılımında, Manuel Analiz sekmesi altında, Dosyaaltında Aç'a tıklayarak çok katlı resimleri yükleyin.
    2. Spektral Kütüphane Kaynak açılır menüsünde Florseç'itıklatın.
    3. Yeni bir pencere açılacak. Burada, yukarıda oluşturulan spektral kitaplığı veya grubu seçin.
    4. Lekelenmemiş slayt görüntüsünü yükleyin. Seçili spektral kitaplığın üzerinde bulunan AF mürekkep işaretsimgesine tıklayın ve dokudaki otofloresanlığı tanımlamak için lekesiz slayta bir çizgi veya bölge çizin.
    5. İşaretçileri ve Renkleri Edit sekmesinin altında, her işaretçi için adatayın. Sözde renkler bu adımda atanabilir.
      NOT: Autofloresan görüntünün rengi varsayılan olarak DarkSlateGray'e gelir. Bunu Black olarak değiştir.
    6. Tümlerini Hazırla'yıtıklatın.
  3. Spektrometredeki karışık olmayan görüntülerin doğrulanması
    NOT:     Spektral karıştırma adımı tamamlandığında, tüm renklerden oluşan kompozit bir görüntü oluşturulur.
    1. Göz Görünümü simgesini edit'i tıklatın. Burada, "Bileşen Ekranı"ndaki her renk, her bir işaretçinin boyamasını görüntülemek için kapatılabilir veya açılabilir.
    2. Biyolojik olarak alakalı olmadığı sürece, belirteçle çakışma olmadığından emin olmak için hücrelerin boyanmasını ve morfolojisini görsel olarak inceleyin. Bir patolog da boyama doğrulamak yardımcı olabilir.
      NOT: Çok katlı slayttaki boyama, bir seferde bir florofor bırakılarak ve boyama deseni gözden geçirilerek doğrulanmalıdır. Buna ek olarak, doğrulama da antikor çapraz konuşma veya kanama-through nedeniyle komşu spektrumlarda görünen güçlü floropores belirlemek için yardımcı olacaktır.
    3. Her floresan işaretçi için parlak alan görüntülerini simüle eden Patoloji Görünümleriiçin Bileşen Görüntüsü Seç düğmesini tıklatın. Burada, benzetilen bir brightfield görüntüsünü görüntülemek için bir işaretçi seçin.

7. Hücre Segmentasyonu ve Fenotitipleme Yoluyla Multispektral Görüntülerin Analizi

NOT: Gözlüklü karışık olmayan görüntüyü doğruladıktan sonra, hücre segmentasyonu adım adım talimatlar sağlayacak makine öğrenme yazılımı kullanılarak gerçekleştirilebilir. Doku segmentasyonu burada yapılmadı. Panelde bir veya daha fazla dokuspesifik belirteç varsa ve özellikle doku dağınıksa doku segmentasyonu yapılmalıdır.

  1. 'Segment' seçeneği altında "Sitoplazma" ve "Membran" seçeneğini belirleyin.
    NOT: "Nuclei" varsayılan olarak seçilir.
  2. Panelden bir işaretçi seçin. İşaretleyiciyi çekirdek, sitoplazma veya membranı algılayabilmek için yapılandırın. Örneğin, membran için çekirdekleri ve CD3'ü algılamak için DAPI seçilebilir.
  3. " bulmak içinbu sinyali kullan" altında bir seçenek seçmek için elips düğmesine ('...') tıklayın. Örneğin, DAPI için 'çekirdekler'. Segmentasyon için panelden birden çok işaretçi seçilebilir.
    NOT: Sitoplazmik veya membran belirteçleri için "Nükleer segmentasyona yardımcı olmak için bu sinyali kullanın"seçeneğini belirleyin.
  4. Yazılım, görüntüdeki çekirdek, sitoplazma ve membran için her biri otomatik olarak bir maske algılar ve oluşturur.
  5. Tüm hücrelerin segmentasyon için 'maskeli' olduğundan emin olun. Ayarlamak için, 7.3'teseçilen belirli işaretçi için Patoloji Görünümü'ne geçin. ve yazılımdaki yapılandırma seçeneklerini kullanın.
  6. Hücrelerisegmentlemekiçin " Segment Tümlerini " tıklatın.
  7. Hücre segmentasyonundan sonra, fenotilik hücreleri ile devam edin. Bu adımda, fenotileme için gereken işaretleri seçin ve seçilen işaretçiyle parlak bir şekilde boyanmış en az beş hücreyi el ile seçin. Bu, yazılımı, görüntüdeki seçilen işaretçiyle boyanmış tüm hücreleri otomatik olarak algılaması için eğitir.
  8. Bir fenotip eşlemi oluşturulur. İşaretleyici ile boyanmış hücrenin doğru şekilde fenotip olduğundan emin olmak için analiz edin.
    NOT: Hücre fenotipleme bir yinelemeli bir süreç olabilir. Yazılım hücreleri doğru bir şekilde fenotipleyemiyorsa, bu eğitimin yetersiz veya yanlış olduğu anlamına gelir. Bu durumda, kullanıcı el ile daha fazla hücre seçmek ve yazılımı yeniden eğitmek ve kullanıcı eğitim memnun olana kadar bu adımı yinelemek zorundadır.
  9. "Diğerleri" adlı bir grup oluşturun ve işaretçilerin hiçbiri için lekeli olmayan hücreler ekleyin.
    NOT: Bu adım, tüm lekesiz hücreleri fenotiplemeden dışlamak için yazılımı eğitmek önemlidir.

8. Görüntü ve Analiz Tablolarının İhracatı

  1. Dışa Aktarma Ayarları panelini görüntülemek için Dışa Aktarma düğmesini tıklatın.
  2. "Dışa Aktarma Dizini"nde, görüntüleri dışa aktarmak için bir konum seçmek için Gözat'ı tıklatın.
  3. "Görüntü Verme Seçenekleri"nde, Görüntü Çıktı biçimi'niseçin.
  4. "Dışa Aktaracak Görüntüler" listesinde, dışa aktak edilecek resimleri seçin. "Bileşik görüntü" son sözde renkli olmayan karışık görüntüdür. "Patoloji Görünümleri" bireysel simüle brightfield görüntüleri ve "Bileşen Görüntüler (multi-image TIFF)" üçüncü taraf analiz yazılımı tarafından kullanılabilecek bileşen verilerinin bir çok görüntü TIFF dosyasıdır.
  5. Görüntüleridışaaktarmak için " Tümü için Dışa Aktar " butonuna tıklayın.
    NOT: Analiz tabloları da bu adımda seçilebilir ve dışa aktarılabilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dondurulmuş dalak kesitlerinde tek lekeli belirteçlerin tespiti
Yarı otomatik görüntüleme sistemi, daha geniş bir dalga boyu algılama25aralığına olanak tanıyan sıvı kristal konserve filtre (LCTF) sistemi kullandığından ve burada sinyal amplifikasyon adımları yapılmadığından, ilk olarak mikroskoptaki her bir belirteç için birincil çekimli antikorlarımızın tespitini optimize ettik. Bir örnek Şekil 1'degösterilmiştir , her tek lekeli işaretçi sözde re...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dondurulmuş dokular yaygın geleneksel doğrudan ve dolaylı yöntem32kullanarak bir doku üzerinde üç ila dört belirteçleri31 tespit etmek için mIF görüntüleme için kullanılmıştır. Doğrudan yöntemde, antikorlar floresan boyalar veya kuantum nokta33 doku etiketlemek için konjuge edilir, dolaylı yöntemde ise, konjuge olmayan bir birincil antikor özellikle birincil antikor tanıyan bir florofor-konjuge ikincil antikor takip doku etiketlemek için kullanılır. ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların ifşa etmesi gereken çıkar çatışmaları yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Görüntüleme ve analiz rehberliği, Chicago'daki Illinois Üniversitesi'nde Araştırma Kaynakları Merkezi - Araştırma Histolojisi ve Doku Görüntüleme Çekirdeği tarafından, Araştırma dan sorumlu Rektör Yardımcısı'nın desteğiyle kurulmuştur. Çalışma NIH / NCI RO1CA191317 clp, NIH / NIAMS (SBDRC hibe 1P30AR075049-01) Dr A. Paller ve Robert H. Lurie Kapsamlı Kanser Merkezi desteği ile Northwestern Üniversitesi'nde İmmünoterapi Değerlendirme Çekirdek desteklendi.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Aseton (histolojik derece)Fisher ScientificA16F-1GALSabitleme dokuları
Alexa Fluor 488 anti-fare CD3BioLegend100212Klonu - 17A2; birincil konjuge antikor
Alexa Fluor 488, eBioscience anti-insan CD20ThermoFisher Scientific53-0202-82klonu - L26; birincil konjuge antikor
Alexa Fluor 555 Fare anti-Ki-67BD Biyolojik bilimler558617Birincil konjuge antikor
Alexa Fluor 594 anti-insan CD3BioLegend300446Klonu - UCHT1; birincil konjuge antikor
Alexa Fluor 594 anti-fare CD8aBioLegend100758Klonu - 53-6.7; birincil konjuge antikor
Alexa Fluor 647 anti-insan CD8aBioLegend372906Klonu - C8/144B; birincil konjuge antikor
Alexa Fluor 647 anti-fare CD206 (MMR)BioLegend141711Klonu - C068C2; birincil konjuge antikor
Alexa Fluor 647 anti-fare CD4 AntikoruBioLegend100426Klonu - GK1.5; primer konjuge antikor
C57BL / 6 FareCharles River Laboratuvarları27Multispektral eğitim için kullanılan fare donmuş dokuları
Coplin JarSigma AldrichS6016-6EASlaytları yeniden nemlendirme ve yıkama
DAPI Çözümü BDBiosciences564907Nükleik Asit lekesi
Elmas Beyaz Cam Şarjlı SlaytlarDOT ScientificDW7590WDoku kesitlerinin yapıştırılması
Dulbecco'nun Fosfat Tamponlu Tuzlu Suyu 1x (Ca ve Mg olmadan)Fisher ScientificMT21031CVYıkama ve seyreltici
Altın Mühür Kapak FişleriThermoFisher Scientific3306Lekeli dokuların korunması
İnsan Normal Bademcik OCT donmuş doku bloğuAMSBioAMS6023Multispektral boyama için kullanılan insan donmuş dokusu
İnsan Serumu 1xİkizler Biyo-Ürünler100-512İnsan dokuları için bloke edici ve seyreltici
inFormAkoya BiosciencesSürüm 2.4.1Makine öğrenimi yazılımı
PerCP / Cyanine5.5 anti-insan CD4BioLegend300529Klonu - RPA-T4; birincil konjuge antikor
PerCP-Cy 5.5 Sıçan Anti-CD11bBD Biosciences550993Klonu - M1/70; birincil konjuge antikor
FenografikAkoya BiosciencesSürüm 1.0.8Tüm slayt tarama yazılımı
ProLong Elmas Antifade MountantThermoFisher ScientificP36965Montaj ortamı
Araştırma KriyostatLeica BiosystemsCM3050 SDokuları
Superblock 1xThermoFisher Scientific37515Fare dokularının bloke edilmesi
Tissue-Tek O.C.T SolüsyonuSakura Finetek4583Doku gömme
Vectra 3.0 Otomatik Kantitatif Patoloji Görüntüleme Sistemi, 6 SlaytAkoya BiosciencesCLS142568Yarı otomatik multispektral görüntüleme sistem
Vectra YazılımıAkoya BiosciencesSürüm 3.0.5Mikroskobu çalıştırmak için yazılım
bölme

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. van der Loos, C. M. Chromogens in Multiple Immunohistochemical Staining Used for Visual Assessment and Spectral Imaging: The Colorful Future. Journal of Histotechnology. 33 (1), 31-40 (2010).
  2. Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C. Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: A review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis. Methods. 70 (1), 46-58 (2014).
  3. Bian, L., et al. Multispectral imaging using a single bucket detector. Scientific Reports. 6, 24752(2016).
  4. Zhou, L., El-Deiry, W. S. Multispectral fluorescence imaging. Journal of Nuclear Medicine. 50 (10), 1563-1566 (2009).
  5. Parra, E. R., et al. Validation of multiplex immunofluorescence panels using multispectral microscopy for immune-profiling of formalin-fixed and paraffin-embedded human tumor tissues. Scientific Reports. 7 (1), 13380(2017).
  6. Wickenhauser, C., et al. Immune Checkpoint Blockade: Methods and Protocols. Pico de Coaña, Y. , Springer. New York. 13-31 (2019).
  7. Feng, Z., et al. Multispectral imaging of formalin-fixed tissue predicts ability to generate tumor-infiltrating lymphocytes from melanoma. Journal for ImmunoTherapy of Cancer. 3 (1), 47(2015).
  8. Manesse, M., Patel, K. K., Bobrow, M., Downing, S. R. The InSituPlex((R)) Staining Method for Multiplexed Immunofluorescence Cell Phenotyping and Spatial Profiling of Tumor FFPE Samples. Methods in Molecular Biology. 2055, 585-592 (2020).
  9. Gamble, L. J., Anderton, C. R. Secondary Ion Mass Spectrometry Imaging of Tissues, Cells, and Microbial Systems. Microscopy Today. 24 (2), 24-31 (2016).
  10. Giesen, C., et al. Highly multiplexed imaging of tumor tissues with subcellular resolution by mass cytometry. Nature Methods. 11 (4), 417-422 (2014).
  11. Angelo, M., et al. Multiplexed ion beam imaging of human breast tumors. Nature Medicine. 20 (4), 436-442 (2014).
  12. Tsujikawa, T., et al. Quantitative Multiplex Immunohistochemistry Reveals Myeloid-Inflamed Tumor-Immune Complexity Associated with Poor Prognosis. Cell Reports. 19 (1), 203-217 (2017).
  13. Goltsev, Y., et al. Deep Profiling of Mouse Splenic Architecture with CODEX Multiplexed Imaging. Cell. 174 (4), 968-981 (2018).
  14. Gerdes, M. J., et al. Highly multiplexed single-cell analysis of formalin-fixed, paraffin-embedded cancer tissue. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (29), 11982-11987 (2013).
  15. Shi, S. R., Key, M. E., Kalra, K. L. Antigen retrieval in formalin-fixed, paraffin-embedded tissues: an enhancement method for immunohistochemical staining based on microwave oven heating of tissue sections. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 39 (6), 741-748 (1991).
  16. Viegas, M. S., Martins, T. C., Seco, F., do Carmo, A. An improved and cost-effective methodology for the reduction of autofluorescence in direct immunofluorescence studies on formalin-fixed paraffin-embedded tissues. European Journal of Histochemistry. 51 (1), 59-66 (2007).
  17. Sorensen, I. V., et al. Characterization of anti-TIMP-1 monoclonal antibodies for immunohistochemical localization in formalin-fixed, paraffin-embedded tissue. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 54 (10), 1075-1086 (2006).
  18. Parra, E. R., Villalobos, P., Mino, B., Rodriguez-Canales, J. Comparison of Different Antibody Clones for Immunohistochemistry Detection of Programmed Cell Death Ligand 1 (PD-L1) on Non-Small Cell Lung Carcinoma. Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology. 26 (2), 83-93 (2018).
  19. Boger, C., Kalthoff, H., Goodman, S. L., Rocken, C. Validation and comparison of anti-alphavbeta3 and anti-alphavbeta5 rabbit monoclonal versus murine monoclonal antibodies in four different tumor entities. Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology. 21 (6), 553-560 (2013).
  20. Torigoe, T., et al. Establishment of a monoclonal anti-pan HLA class I antibody suitable for immunostaining of formalin-fixed tissue: unusually high frequency of down-regulation in breast cancer tissues. Pathology International. 62 (5), 303-308 (2012).
  21. Dapson, R. W. Macromolecular changes caused by formalin fixation and antigen retrieval. Biotechnic & Histochemistry. 82 (3), 133-140 (2007).
  22. Sompuram, S. R., Vani, K., Hafer, L. J., Bogen, S. A. Antibodies Immunoreactive With Formalin-Fixed Tissue Antigens Recognize Linear Protein Epitopes. American Journal of Clinical Pathology. 125 (1), 82-90 (2006).
  23. Cassetti, M. C., et al. Antitumor efficacy of Venezuelan equine encephalitis virus replicon particles encoding mutated HPV16 E6 and E7 genes. Vaccine. 22 (3-4), 520-527 (2004).
  24. Kiernan, J. A. Histological and Histochemical Methods: Theory and Practice, 3rd Edition. Shock. 12 (6), 479(1999).
  25. Favreau, P., et al. Thin-film tunable filters for hyperspectral fluorescence microscopy. Journal of Biomedical Optics. 19 (1), 011017(2014).
  26. van Kempen, M. J., Rijkers, G. T., Van Cauwenberge, P. B. The immune response in adenoids and tonsils. International Archives of Allergy and Immunology. 122 (1), 8-19 (2000).
  27. Klein, U., Dalla-Favera, R. Germinal centres: role in B-cell physiology and malignancy. Nature Reviews Immunology. 8 (1), 22-33 (2008).
  28. Eiben, G. L., et al. Establishment of an HLA-A*0201 Human Papillomavirus Type 16 Tumor Model to Determine the Efficacy of Vaccination Strategies in HLA-A*0201 Transgenic Mice. Cancer Research. 62, 5792-5799 (2002).
  29. Gonzalez, H., Hagerling, C., Werb, Z. Roles of the immune system in cancer: from tumor initiation to metastatic progression. Genes & Development. 32 (19-20), 1267-1284 (2018).
  30. Sica, A., Schioppa, T., Mantovani, A., Allavena, P. Tumour-associated macrophages are a distinct M2 polarised population promoting tumour progression: potential targets of anti-cancer therapy. European Jorunal of Cancer. 42 (6), 717-727 (2006).
  31. Au-Granier, C., et al. Multiplexed Immunofluorescence Analysis and Quantification of Intratumoral PD-1+ Tim-3+ CD8+ T Cells. Journal of Visualized Experiments. (132), e56606(2018).
  32. Odell, I. D., Cook, D. Immunofluorescence Techniques. Journal of Investigative Dermatology. 133 (1), 1-4 (2013).
  33. Xing, Y., et al. Bioconjugated quantum dots for multiplexed and quantitative immunohistochemistry. Nature Protocols. 2 (5), 1152-1165 (2007).
  34. Schubert, W., et al. Analyzing proteome topology and function by automated multidimensional fluorescence microscopy. Nature Biotechnology. 24 (10), 1270-1278 (2006).
  35. de Vries, N. L., et al. High-dimensional cytometric analysis of colorectal cancer reveals novel mediators of antitumour immunity. Gut. , 03(2019).
  36. Scalia, C. R., et al. Antigen Masking During Fixation and Embedding, Dissected. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry : Official Journal of the Histochemistry Society. 65 (1), 5-20 (2017).
  37. Sorrelle, N., et al. Improved Multiplex Immunohistochemistry for Immune Microenvironment Evaluation of Mouse Formalin-Fixed, Paraffin-Embedded Tissues. Journal of Immunology. 202 (1), 292-299 (2019).
  38. Ackerman, L. V., Ramirez, G. A. The indications for and limitations of frozen section diagnosis; a review of 1269 consecutive frozen section diagnoses. British Journal of Surgery. 46 (198), 336-350 (1959).
  39. Mezheyeuski, A., et al. Multispectral imaging for quantitative and compartment-specific immune infiltrates reveals distinct immune profiles that classify lung cancer patients. The Journal of Pathology. 244 (4), 421-431 (2018).
  40. Feng, Z., et al. Multiparametric immune profiling in HPV- oral squamous cell cancer. JCI insight. 2 (14), 93652(2017).
  41. Yang, L., Liu, Z., Tan, J., Dong, H., Zhang, X. Multispectral imaging reveals hyper active TGF-β signaling in colorectal cancer. Cancer Biology & Therapy. 19 (2), 105-112 (2018).
  42. Blom, S., et al. Systems pathology by multiplexed immunohistochemistry and whole-slide digital image analysis. Scientific Reports. 7 (1), 15580-15580 (2017).
  43. Roy, S., Axelrod, H. D., Valkenburg, K. C., Amend, S., Pienta, K. J. Optimization of prostate cancer cell detection using multiplex tyramide signal amplification. Journal of Cellular Biochemistry. 120 (4), 4804-4812 (2019).
  44. Vickovic, S., et al. High-density spatial transcriptomics arrays for in situ tissue profiling. bioRxiv. , 563338(2019).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Florofor KombinasyonlarSpektral K t phane Olu turmaMakine renmesi AnaliziH cre SegmentasyonuAntikor Boyama ProtokolSpektral Ayr t rmaT m Slayt TaramaFenotip Haritalama

İlgili makaleler