Method Article

Dondurulmuş Doku Kesitlerinin Multispektral Floresan Görüntülemesi için Hızlı Bir Yöntem

DOI:

10.3791/60806

⸱

March 30th, 2020

 ,  ,  , 
1Robert Lurie Comprehensive Cancer Center and Department of Dermatology, Feinberg School of Medicine, Northwestern University, 2Department of Pathology, University of Illinois at Chicago, 3Department of Microbiology and Immunology, Feinberg School of Medicine, Northwestern University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biz dondurulmuş dokularda multispektral görüntüleme gerçekleştirmek için hızlı bir boyama yöntemi açıklar.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Formalin-sabit parafin gömülü (FFPE) dokularda multispektral floresan görüntüleme, tek bir doku örneğinde antijen koekspresyonu ve belirteçlerin mekansal dağılımı hakkında bilgi sağlayabilen birden fazla belirteç saptanmasını sağlar. Ancak, formalin-sabit dokular için uygun antikoreksikliği tespit edilebilir belirteçlerin doğasını kısıtlayabilir. Buna ek olarak, boyama yöntemi zaman alıcıdır. Burada dondurulmuş dokularda multispektral floresan görüntüleme yapmak için hızlı bir yöntem açıklanmaktadır. Yöntem kullanılan florofor kombinasyonları, fare ve insan dondurulmuş dokuların boyama için ayrıntılı adımlar ve tarama, edinim ve analiz prosedürleri içerir. Boyama analizi için, ticari olarak kullanılabilen yarı otomatik multispektral floresan görüntüleme sistemi kullanılır. Bu yöntemle, en fazla altı farklı belirteçler lekeli ve tek bir dondurulmuş doku bölümünde tespit edildi. Makine öğrenme analiz yazılımı kantitatif analiz için kullanılabilecek hücreleri fenotip olabilir. Burada dondurulmuş dokular için açıklanan yöntem FFPE dokularında tespit edilemeyen veya FFPE dokuları için antikor bulunmayan belirteçlerin saptanmasında yararlıdır.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikroskobik görüntüleme tekniklerindeki son gelişmeler, biyolojik süreçler ve hastalık durumları hakkındaki bilgi mizi ve anlayışımızı önemli ölçüde geliştirmiştir. Kromozomimmünohistokimya (IHC) yoluyla dokularda proteinlerin yerinde tespiti patolojide rutin olarak yapılmaktadır. Ancak, kromojenik IHC boyama kullanarak birden fazla belirteç lerin saptanması1 zorlu ve birden fazla biyolojik belirteçtekbir doku örneğinde etiketlendiği multipleks immünoresans (mIF) boyama yaklaşımları kullanmak için yeni yöntemler geliştirilmektedir. Doku mimarisi, hücrelerin mekansal dağılımı ve antijen ko-ekspresyonu ile ilgili bilgiler tek bir doku örneği

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Laboratuarımızdan fare dalak ve HLF16 fare tümör dokuları23 elde edildi. İnsan bademcik dokusu ticari bir satıcıdan satın alındı. Ayrıntılar Malzeme Tablosu'ndaverilmiştir.

1. Doku Katıştırma

  1. Taze dokuyu OCT (optimum kesme sıcaklığı) çözeltisi ve kuru buz veya sıvı nitrojen kullanarak ani donma yerleştirin.
  2. Dokuları -80 °C'de saklayın.

2. Kriyoding

  1. -25 °C sıcaklıkta ayarlanmış bir kriyostatta 8 μm kesitler kesin.
    NOT: Tercih edilen kesit kalınlığı daha net görüntüler oluşturmak için ayarlanabilir.
  2. Bölümleri ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dondurulmuş dalak kesitlerinde tek lekeli belirteçlerin tespiti
Yarı otomatik görüntüleme sistemi, daha geniş bir dalga boyu algılama25aralığına olanak tanıyan sıvı kristal konserve filtre (LCTF) sistemi kullandığından ve burada sinyal amplifikasyon adımları yapılmadığından, ilk olarak mikroskoptaki her bir belirteç için birincil çekimli antikorlarımızın tespitini optimize ettik. Bir örnek Şekil 1'degösterilmiştir , her tek lekeli işaretçi sözde re.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dondurulmuş dokular yaygın geleneksel doğrudan ve dolaylı yöntem32kullanarak bir doku üzerinde üç ila dört belirteçleri31 tespit etmek için mIF görüntüleme için kullanılmıştır. Doğrudan yöntemde, antikorlar floresan boyalar veya kuantum nokta33 doku etiketlemek için konjuge edilir, dolaylı yöntemde ise, konjuge olmayan bir birincil antikor özellikle birincil antikor tanıyan bir florofor-konjuge ikincil antikor takip doku etiketlemek için kullanılır. .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların ifşa etmesi gereken çıkar çatışmaları yok.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Görüntüleme ve analiz rehberliği, Chicago'daki Illinois Üniversitesi'nde Araştırma Kaynakları Merkezi - Araştırma Histolojisi ve Doku Görüntüleme Çekirdeği tarafından, Araştırma dan sorumlu Rektör Yardımcısı'nın desteğiyle kurulmuştur. Çalışma NIH / NCI RO1CA191317 clp, NIH / NIAMS (SBDRC hibe 1P30AR075049-01) Dr A. Paller ve Robert H. Lurie Kapsamlı Kanser Merkezi desteği ile Northwestern Üniversitesi'nde İmmünoterapi Değerlendirme Çekirdek desteklendi.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Aseton (histolojik derece)Fisher ScientificA16F-1GALSabitleme dokuları
Alexa Fluor 488 anti-fare CD3BioLegend100212Klonu - 17A2; birincil konjuge antikor
Alexa Fluor 488, eBioscience anti-insan CD20ThermoFisher Scientific53-0202-82klonu - L26; birincil konjuge antikor
Alexa Fluor 555 Fare anti-Ki-67BD Biyolojik bilimler558617Birincil konjuge antikor
Alexa Fluor 594 anti-insan CD3BioLegend300446Klonu - UCHT1; birincil konjuge antikor
Alexa Fluor 594 anti-fare CD8aBioLegend100758Klonu - 53-6.7; birincil konjuge antikor
Alexa Fluor 647 anti-insan CD8aBioLegend372906Klonu - C8/144B; birincil konjuge antikor
Alexa Fluor 647 anti-fare CD206 (MMR)BioLegend141711Klonu - C068C2; birincil konjuge antikor
Alexa Fluor 647 anti-fare CD4 AntikoruBioLegend100426Klonu - GK1.5; primer konjuge antikor
C57BL / 6 FareCharles River Laboratuvarları27Multispektral eğitim için kullanılan fare donmuş dokuları
Coplin JarSigma AldrichS6016-6EASlaytları yeniden nemlendirme ve yıkama
DAPI Çözümü BDBiosciences564907Nükleik Asit lekesi
Elmas Beyaz Cam Şarjlı SlaytlarDOT ScientificDW7590WDoku kesitlerinin yapıştırılması
Dulbecco'nun Fosfat Tamponlu Tuzlu Suyu 1x (Ca ve Mg olmadan)Fisher ScientificMT21031CVYıkama ve seyreltici
Altın Mühür Kapak FişleriThermoFisher Scientific3306Lekeli dokuların korunması
İnsan Normal Bademcik OCT donmuş doku bloğuAMSBioAMS6023Multispektral boyama için kullanılan insan donmuş dokusu
İnsan Serumu 1xİkizler Biyo-Ürünler100-512İnsan dokuları için bloke edici ve seyreltici
inFormAkoya BiosciencesSürüm 2.4.1Makine öğrenimi yazılımı
PerCP / Cyanine5.5 anti-insan CD4BioLegend300529Klonu - RPA-T4; birincil konjuge antikor
PerCP-Cy 5.5 Sıçan Anti-CD11bBD Biosciences550993Klonu - M1/70; birincil konjuge antikor
FenografikAkoya BiosciencesSürüm 1.0.8Tüm slayt tarama yazılımı
ProLong Elmas Antifade MountantThermoFisher ScientificP36965Montaj ortamı
Araştırma KriyostatLeica BiosystemsCM3050 SDokuları
Superblock 1xThermoFisher Scientific37515Fare dokularının bloke edilmesi
Tissue-Tek O.C.T SolüsyonuSakura Finetek4583Doku gömme
Vectra 3.0 Otomatik Kantitatif Patoloji Görüntüleme Sistemi, 6 SlaytAkoya BiosciencesCLS142568Yarı otomatik multispektral görüntüleme sistem
Vectra YazılımıAkoya BiosciencesSürüm 3.0.5Mikroskobu çalıştırmak için yazılım
bölme

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. van der Loos, C. M. Chromogens in Multiple Immunohistochemical Staining Used for Visual Assessment and Spectral Imaging: The Colorful Future. Journal of Histotechnology. 33 (1), 31-40 (2010).
  2. Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Multispectral Fluorescence ImagingFrozen Tissue SectionsFluorophore CombinationsSpectral Library CreationMachine Learning AnalysisCell SegmentationAntibody Staining ProtocolSpectral UnmixingWhole Slide ScanPhenotype Mapping

Related Articles