Fare Sperm Kapasasyonu Sırasında Glikoliz ve Oksidatif Fosforilasyondaki Değişiklikleri Ölçmek için Hücre Dışı Akı Analizörü Kullanma

Kütle spektrometresi uygulaması metabolizma çalışmalarında devrim yarattı. Hedeflenen metabolik profilleme ve metabolomik izleme, enerji metabolizmasındaki değişikliklerin hassas bir şekilde izlenmesine olanak sağlar. Ancak, metabolomik performans başarıyla kapsamlı eğitim gerektirir, deneyimli personel, ve pahalı, son derece hassas kütle spektrometreler her laboratuvar için hazır değil. Son yıllarda, bir hücre dışı akı analizörü kullanarak, Seahorse XFe96 gibi çeşitli hücre tiplerinde enerji metabolizmasında ki değişiklikleri ölçmek için bir vekil yöntemi olarak popüler büyüdü^1,2,3,4,5.

Sperm son derece özel hareketli hücrelerdir; kimin görevi yumurta için baba genomu teslim etmektir. Boşaldıktan sonra erkek üreme sisteminden ayrılan spermler hala işlevsel olarak olgunlaşmamış durumdadır ve yumurtaların yeleklerine giremedikleri için yumurtayı dölleyemezler. Onlar kapacitation^6,7olarak bilinen bir olgunlaşma sürecinde kadın üreme sistemi ile transit olarak Sperm döllenme yetkinliği elde . Cauda epididimisinden yeni boşalan sperm veya sperm, Ca²⁺içeren tanımlanmış kapasitasyon ortamlarında inkübasyon veya hücregeçirgen cAMP analogu (örn. dibutyryl-cAMP), kolesterol kabul verici (örneğin, sığır serum albumini, BSA) ve bir enerji kaynağı (örneğin, glikoz). Kapacitation sırasında, sperm asimetrik kamçı ritmi içine hareketlilik deseni değiştirmek, hiperaktivasyon denilen bir yüzme modu temsil 8^,9, ve onlar akrozom reaksiyonu geçmesi için yetkili hale⁷, proteolitik enzimler yumurtaların vestments sindirmek serbest bırakılır. Bu süreçler enerji gerektirir ve somatik hücrelere benzer, sperm glikoliz yanı sıra mitokondriyal TCA döngüsü ve oksidatif fosfor (oksfos)¹⁰yoluyla ATP ve diğer yüksek enerjibileşikleri üretmek . Birden fazla çalışma glikoli gerekli ve sperm kapacitation desteklemek için yeterli olduğunu göstermek iken^11,12,13,14, okfos katkısı daha az açıktır. Glikolisfiziksel TCA döngüsü ile birleştiğinde diğer hücre türlerinin aksine, sperm son derece bölümlere ayrılmıştır ve ayrı kamer bölmelerinde bu süreçleri korumak için düşünülmektedir: midpiece mitokondriyal makine konsantreleri, glikoli anahtar enzimleri ana parça 15 ile sınırlı gibi görünür ise^16. Bu bölümleme, glikoliz tarafından ana parçada üretilen pirüvatın orta parçadaki mitokondriyal okfosu destekleyip desteklemeyeceği ve orta parçada oxphos tarafından üretilen ATP'nin ana^{parçanın 17,18,19'un}distal kısımlarındaki enerji gereksinimlerini desteklemek için kamçının uzunluğu boyunca yeterince hızlı bir şekilde yayılıp dağıtılamayacağı konusunda devam eden bir tartışmayla sonuçlanır. Ayrıca sperm kapasitasyonunda oksfos rolü desteklenir. Sadece oxphos glikoliz daha enerjik olumlu, glikoliz daha 16 kat daha fazla ATP üreten, ancak orta hacim ve mitokondriyal içerik doğrudan eşleri için erkekler arasında rekabet daha büyük derece sergileyen memeli türlerinde üreme fitness ile ilişkilidir²⁰. Bu soruların ele alınması, sperm kapanizasyonu sırasında glikoli ve okfosun göreceli katkılarını incelemek için yöntemler gerektirir.

Tourmente ve ark. 24-iyi ekstrasellüler akı analizörü uygulanan önemli ölçüde farklı sperm performans parametreleri ile yakından ilişkili fare türlerinin enerji metabolizmasını karşılaştırmak için²¹. Kapasitif olmayan spermin bazal ECAR ve OCR değerlerini raporlamak yerine, fare sperm kapaizasyonu sırasında ki enerji metabolizmasındaki değişiklikleri gerçek zamanlı olarak izlemek için 96 kuyulu hücre dışı akı analizörü kullanarak metodlarını uyarlıyoruz. Oksijen (O₂) ve proton (H⁺)(Şekil 1A)akını ölçerek, spermde glikoliz ve okfosların on iki farklı deneysel koşullarda kamçıyı yenerek gerçek zamanlı olarak izlenmesini sağlayan bir yöntem geliştirdik. Glikoliz sırasında laktat için piruvat ın bozulması ve TCA-döngüsü ile CO₂ üretimi nedeniyle, kapasite olmayan ve kapasitasyonlu sperm ekstrüzyonu H⁺ ispret media içine h⁺-hassas floropores ile algılanan bir sensör kartuşunun prob ucuna hareketsiz. Buna paralel olarak, oksidatif fosforilasyon ile O₂ tüketimi aynı prob ucuna hareketsiz hale getirilen O₂-duyarlı florofores ile tespit edilir(Şekil 1B). Serbest bırakılan H⁺ ve tüketilen O₂ etkili tespiti bikarbonat veya fenol kırmızı olmadan düşük tamponlama kapasitesi ile değiştirilmiş bir sperm tampon gerektirir. Böylece, bikarbonat yokluğunda kapacitation indüklemek için, geniş menzilli PDE inhibitörü IBMX²²ile birlikte enjekte bir hücre geçirgen cAMP analog kullanımını kabul etti. Üç ek bağımsız enjeksiyon portu farmakolojik aktivatörlerin ve/veya inhibitörlerin enjeksiyonuna izin verir, bu da deneysel manipülasyon nedeniyle hücresel solunum ve glikoliz hızındaki değişikliklerin gerçek zamanlı olarak algılanmasını kolaylaştırır.

Spermler 8-16 haftalık CD-1 erkek farelerden toplanır. Hayvan deneyleri Weill Cornell Medicine'in Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır.

1. Tsamadan önceki gün

1. Sensör kartuşunun ve hücre dışı akı analizörü kallibrantının hazırlanması
   1. Sensör kartuşunu nemlendirmek için sensör kartuşunu XFe96 Hücre Dışı Akı Çıkış Kiti'nden çıkarın ve sensör kartuşunu servis plakasının yanına ters yerleştirin.
   2. Çok kanallı pipet kullanarak 25 mL çift distile H₂O ile bir çözelti haznesini doldurun, yardımcı plakanın her kuyuya 200 μL H₂O ekleyin. Sensör kartuşu tekrar yardımcı plakaya yerleştirin ve bir gecede 37 °C'lik_CO 2 kuluçka makinesine yerleştirin.
      NOT: Kartuşun en az 4 saat süreyle sulu olması gerekir.
   3. Aliquot 25 mL hücre dışı akı analizörü calibrant 50 mL konik tüp içine ve bir gecede 37 ° C non-CO₂ kuluçka kuluçka.
2. ConA kaplamalı mikroplakaların hazırlanması
   1. 0,5 mg/mL (w/v) stok hazırlamak için 5 mL'lik çift distile H₂O'da 2,5 mg ConA'yı çözün.
   2. Çok kanallı bir pipet kullanarak, 0,5 mg/mL Con A çözeltisinin 50 μL'si ile hücre dışı akı analizörü 96 kuyulu bir plakanın her bir kuyuyu doldurun. Kapağı açık bırakın ve oda sıcaklığında bir gecede tabağı kurutun.
      NOT: Birden fazla plaka aynı anda kaplanabilir ve kullanıma hazır olana kadar dört hafta boyunca 4 °C'de saklanabilir.
3. Sperm tamponunun hazırlanması
   1. 138 mM NaCl, 4.7 mM KCl, 1.7 mM CaCl₂, 1.2 mM KH₂PO₄, 1.2 mM MgSO₄, 5.6 mM glukoz ve 1 mM HEPES içeren düşük HEPES içeren 250 mL ekstrasellüler akı analizörü TYH tampon hazırlayın. Tamponu 37 °C'ye ısıtın ve pH'ı 7,4'e ayarlayın.

2. Teşekkün günü

1. Kartuş kalibrasyonu için hazırlık
   1. Yardımcı plakadaki H₂O'yu kuyu başına 200°L XF kallibrant ile değiştirin ve CO₂ 37 °C'li olmayan bir kuluçka makinesinde en az 1 saat inkübatör.
      NOT: Kalibran yerine steril filtreli PBS, pH 7.4 kullanılabilir.
   2. 37 °C'de 50 mL TYH tamponu ısıtın.
2. Hücre dışı akı çözümleyicisi için dalga şablonu oluşturma
   1. Hücre dışı akı analizörü açın ve sıcaklığın 37 °C'ye sabitlemesine izin verin.
   2. Dalga yazılımını açın ve boş bir şablon açarak yeni bir şablon tasarlayın (Bkz. Ek Dosya 1, dalga şablonu).
   3. Grup tanımları sekmesini aç. Assay ortamını TYH olarak tanımlayın; pH 7.4 ve fare spermi olarak hücre tipi, enjeksiyon stratejileri ve ön tedaviler boş bırakın. Her bir atama koşulu için farklı gruplar oluşturun; Bu örnekte 6 farklı grup bulunmaktadır (TYH, TYH + db-cAMP/IBMX, 2-DG, 2-DG + db-cAMP/IBMX, Ant/Rot, Ant/Rot + db-cAMP/IBMX); dibutyryl cAMP (db-cAMP) ve 3-Izobutyl-1-metilxanthine (IBMX) kapacitation indüklemek için, 2-deoksiglukoz (2-DG) glikoliz inhibitörü olarak, antimisin A (antA) ve rotenon (rot) karmaşık III ve elektron taşıma zincirinin kompleks I inhibitörü olarak.
      NOT: Kuyular arasındaki değişkenliği hesaba katmak için, her koşul da en az 7-8 kuyu paralel olarak ölçülmelidir.
   4. Plaka haritası sekmesini açın ve belirli kuyulara gruplar atayarak plaka haritasını tanımlayın.
      NOT: Dört köşe kuyusu (A1, A12, H1, H12) TYH tamponu (sperm yok) ile doldurulacak ve daha sonra arka plan çıkarma için kullanılacaktır.
   5. Protokol sekmesini açın, 4 farklı ölçüm döngüsü ekleyin, ilgili bağlantı noktasını seçin ve ölçüm ayrıntılarını edin(Şekil 2, Tablo 1). Enjeksiyondan sonra ölçüvurgulayın ve dengeyi vurgulamayın.
   6. Tahsin şablonu kaydedin, proje özetini doldurun ve sonuç dosyası için kaydetme konumunu tanımlayın.
3. Sensör kartuşuna yüklemek için bileşiklerin hazırlanması
   1. TYH tamponunda 9,8 mg bileşiğin eritilmesi yle 50 mM db-cAMP'ın 2 mL'sini hazırlayın ve IBMX'i 5 mM'lik son konsantrasyona ekleyin.
      NOT: IBMX, TYH arabelleği nde seyreltildikten sonra çökelme eğilimine sahiptir. Çökeltiler, TYH/db-cAMP/IBMX çözeltisinin 5 dakika boyunca 37 °C'lik bir ısı bloğunda girdap ve kuluçkaya yatırılarak çözülebilir.
   2. TYH tamponundaki 82.1 mg bileşiği eriterek 500 mM 2-DG'nin 1 mL'sini hazırlayın.
   3. HER iki ilacı da TYH tamponunda seyrelterek 1 mL 5 M AntA/Rot hazırlayın.
      NOT: Bileşikler hücre dışı akı analizörü kartuşuna enjekte edilerek 10 kat seyreltilir; bu nedenle, enjeksiyon çözeltilerinin 10 kat daha konsantre olduğundan emin olun.
4. Fare sperminin izolasyonu
   1. 8 ile 16 hafta arasında 3 erkek fareyi izofluran e-posta ile anesteleştirin ve parmak sıkışmasına yanıt alınamadıktan sonra servikal çıkık ile fareleri kurban edin. Kauda epididamids ve vasa deferentia kaldırın.
   2. Her kauda'yı 24 kuyulu plakaya 500 μL önceden ısıtılmış TYH tamponuna yerleştirin, bir çift çalgılar kullanarak kauda'yı tabağın dibine yerleştirin ve tüy makası ile 5-7 küçük kesi yaparak dokuyu açın.
   3. Plakayı hemen CO₂ 37 °C'li olmayan bir kuluçka makinesine aktarın ve spermin 15 dakika boyunca dağılmasını sağlar.
5. Sensör kartuşunun yüklenmesi
   1. Hücre dışı Akı kitinde A ve D portu ile B ve C bağlantı noktası için iki bağlantı noktası yükleme kılavuzu bulunur. Belirli bir bağlantı noktasını yüklemek için, sensörün kartuşundan kapağı çıkarın ve ilgili bağlantı noktası yükleme kılavuzunun harfini kartuşun sol üst köşesine hizalayın. Enjekte ederken, bağlantı noktası yükleme kılavuzunu yerinde tutmak için enjekte etmeyen elin parmak uçlarını kullanın ve pipet uçlarını bağlantı noktası yükleme kılavuzu deliklerine dikey olarak yerleştirin.
   2. Port A: Çok kanallı bir pipet kullanarak, her sütuna 20 μL TYH tampon enjekte edin.
   3. Port B: 22 μL TYH tamponu 1-4 sütununa enjekte edin, 22 μL 500 mM 2-DG'yi 5-8 sütununa ve 25 μL 5 μM AntA/Rot'u 9-12 no'lu kolona enjekte edin.
   4. Port C: Her sütuna tek sayılarla 25 μL TYH arabellek enjekte edin, 25 μL 10 mM db-cAMP/ 500 μM IBMX'i eşit sayılarla her sütuna enjekte edin.
   5. Sensör kartuşunu kalibrasyon plakalı hücre dışı akı analizörüne yerleştirin ve tayı başlatın. Kalibrasyon 10 - 15 dk sürer.
6. Sperm plakalarının hazırlanması
   1. 45 mg BSA'yı 15 mL TYH tamponunda (3 mg/mL w/v) çözün ve 5 mL santrifüj tüpte her biri 3 mL BSA/TYH çözeltisi üç ertaminek hazırlayın.
   2. Her biri 1,5 mL'lik santrifüj tüpünde iki sperm kuyusu birleştirin, hematositometre kullanarak spermi sayın ve spermi 2 x 10⁷ sperm/mL konsantrasyonuna seyreltin.
      NOT: Hücrelere zarar vermemek için sperm borulamak için kesme pipet uçlarını kullanın.
   3. 700 x g3 dakika sperm santrifüj, supernatant kaldırmak ve TYH tampon 1 mL ekleyin. Santrifüj adımını tekrarlayın, süpernatantı çıkarın ve her sperm süspansiyonu 3 mL BSA/TYH ile 5 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın.
   4. 180 μL TYH tamponu her köşeye cona kaplamalı bir plakanın (A1, A12, H1, H12) yerleştirin. ConA kaplı plakanın her boş kuyusunun içine 180 μL sperm süspansiyonu yerleştirin (1.2 x 10⁶ sperm/kuyu).
   5. Sperm plakasını 1 dk için 250 x g'de santrifüj edin, plakayı 180°'ye döndürün ve 1 dk için 250 x g'de tekrar santrifüj edin (en düşük frenleme oranı 1).
   6. Ekstrasellüler akı analizöründen kalibrasyon plakasını çıkarın ve sperm plakasını ekleyin. Taramaya devam et.
7. Veri ayıklama ve analiz
   1. Tahkikatı tamamladıktan sonra kartuşun kaldırılmasını, sonuç dosyasını açın, Dışa Aktar sekmesini tıklatın ve tamamlanan çalıştırmayı GraphPad Prizma dosyası olarak dışa aktarın (Ek Dosya 2: Şekil 3için kullanılan birincil örnek veriler).
   2. ECAR ve OCR dosyasını Yeni sekmesine ve ardından Yinelenen Aile sekmesine tıklayarak çoğaltma ... ( Şekil3A).
   3. İlk 7 veri satırını silin (Şekil 3B).
   4. CAMP/IBMX enjeksiyonundan önceki veri noktasına temel satır 1'i çıkararak normalleştirin. Analyze sekmesine tıklayın, ardından Taban Çizgisi ve Sütun Matematik sekmesini kaldır. İlk Satır, Hesaplama: Oran:Değer/Taban Çizgisive Alt Sütunlar: Alt Sütunu Yokla. Tamam 'ı tıklatın (Şekil 3C).

Bu yöntem, fare sperm kapamansırasında glikoliz ve oksfos oranındaki gerçek zamanlı değişiklikleri izlemek için hücre dışı akı analizörü kullanır. Şekil 4, farmakolojik modülatörler olarak tek enerji substratı ve 2-DG ve antimisin ve rotenon olarak glikoz varlığında spermin kapasitif olduğu örnek bir deney göstermektedir. Ekstrasellüler akı analizörü TYH tamponundaki enerji substratı ve farmakolojik modülatörler deneyin amacına bağlı olarak serbestçe seçilebilir. BSA/TYH'de kapasitif olmayan fare spermleri kafaları aracılığıyla ConA kaplı geçici mikrohazonun altına bağlandı. Bu örnekte, saptakedilen tüm kuyular arasında bazal ECAR ve OCR değerleri sırasıyla 12.76 ± 2.75 mpH/dk ve 23.64 ± 2.78 pmol/dak idi.

TYH tamponu ile yapılan sahte enjeksiyondan sonra, sırasıyla glikoliz ve oksidatif fosforilasyoninin inhibesi için 2-DG ve karınca/rot enjeksiyonu yapıldıktan sonra, sperm kapajesisi db-cAMP/IBMX enjeksiyonu ile indüklendi.

Temsili sonuçlar, glikoz varlığında, kapasitasyon un ekstrasellüler asitleşme hızında (ECAR) 7 kat artışla eşlik ettiğini göstermektedir, bu da glikoli 2-DG ile bloke ederek inhibe edilir(Şekil 4A). Kapasitif sperm, kapasitasyonsuz sperme(Şekil 4B)göre Oksijen Tüketim Hızında (OCR) 20 kat artış gösterir ve fare sperminin kapasiasyon sırasında artan enerji talebini desteklemek için hem glikoliz hem de oksidatif fosforilasyon olduğunu gösterir. Sperm kapaizasyonu sırasında ECAR'daki artış glikoliz inhibitörü 2-DG tarafından inhibe edilir, ancak oksidatif fosforilasyon inhibitörleri antimisin A ve rotenone etkilenmez(Şekil 4C),ECAR'daki değişimin esas olarak Glikoliz'den Kaynaklanan H+ salınımı ile hareket ettiğini gösterir. OCR artışı, beklendiği gibi, antimisin A ve rotenon tarafından bloke edilir(Şekil 4D), ama aynı zamanda 2-DG tarafından inhibe edilir (Şekil 4B) sperm kapacitation sırasında oksfos artış glikolitik aktiviteye bağlı olduğunu ortaya koymaktadır.

Şekil 1: Hücre dışı akı analizörü prensibi. (A) Glikoliz sırasında laktat glikozun bozulması ve TCA döngüsü ile CO2 üretimi nedeniyle, glikoliz ve okfos değişiklikleri ekstrasellüler ortama H+ atılım eşlik eder. XFe96 Analyzer ecar olarak ekstrasellüler H+ konsantrasyonbu değişiklikleri algılar. Buna paralel olarak oksidatif fosforilasyon ile O2 tüketimine bağlı ekstrasellüler O2 konsantrasyonundaki değişiklikler OCR olarak ölçülür. 2-deoksiglukoz (2-DG) veya kompleks I ve kompleks III inhibitörleri rotenon ve antimisin A ile solunum ile glikoliz bloke hangi metabolik yollar sperm kapaji sırasında artan enerji talebini desteklemek ortaya koymaktadır. (B) Fare spermi, cona kaplı bir mikrohazonun altına başları ile bağlanır; onların flagella serbestçe hareket ediyor. Hücre dışı H+ ve O2 konsantrasyonundaki değişiklikler H+ve O2duyarlı florofores bir sensör sondasına hareketsiz olarak tespit edilirken, sırayla en fazla dört farklı bileşik enjekte edilebilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Örnek deneyin şematik gösterimi. ECAR (mpH/min) ve OCR 'de (pmol O2/dk) hücre dışı akı analizörü kullanılarak kapasitasyonsuz ve kapasitasyonlu spermde değişiklikler saptanır. Döngü 1: Bazal ECAR ve OCR değerleri. Döngüler 2-5: TYH sahte enjeksiyon sonrası sistem stabilizasyonu. Döngüler 6-8: İlaç kuluçka. Döngüler 9-27: Sperm kapasitasyonu. Oklar iğneleri gösteriyor. 2-DG: son konsantrasyon 50 mM, AntA/Rot: son konsantrasyon 0.5 m, db-cAMP: son konsantrasyon 1 mM, IBMX: son konsantrasyon 500 μM. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Veri analizi. (A) Fare sperm kapasasyonu sırasında ECAR'daki değişikliklerin ham verileri. (B) İlk 7 veri noktasının kaldırılmasından sonra veri. (C) Veriler cAMP/IBMX enjeksiyonundan önce veri noktasına normalleştirildi. Veriler ortalama olarak 7-8 kuyu ± S.E.M. enjeksiyonları bir ok ile gösterilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: Fare sperm kapasasyonu sırasında glikoliz ve oksidatif fosforilasyondeğişiklikleri. (A) 50 mM 2-DG varlığında ve yokluğunda, kapasitülize olmayan ve kapasitülize edici fare sperminde normalleştirilmiş ECAR. (B) 50 mM 2-DG varlığında ve yokluğunda, kapasitülize olmayan ve kapasitülize edici fare sperminde normalleştirilmiş OCR. (C) 0.5 μM antimisin A ve rotenone varlığında ve yokluğunda, kapasitülize olmayan ve kapasitize edici fare sperminde normalleştirilmiş ECAR. (D) 0.5 μM antimisin A ve rotenone varlığında ve yokluğunda, kapasitülolmayan ve kapasitize edici fare sperminde normalleştirilmiş OCR. Veriler db-cAMP/IBMX enjeksiyonundan önce veri noktasına normalleştirilmiş ortalama ± S.E.M olarak gösterilir; n = 6 olarak Enjeksiyonlar bir ok ile gösterilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 1: Ölçüm Ayrıntıları.

Ek Şekil 1: Hücre dışı akı analizörü TYH tamponunda fare sperminin kapitalasyonu. (A) TYH'de kuluçka sonrası 25 mM HCO3-3 mg/mL BSA ve 20 mM HEPES veya (B) Hücre dışı flux analizörü TYH'de 5 mM db-cAMP ile kapitalasyon sırasında farklı zaman noktalarında tespit edilen fare sperminin tirozin artıklarının fosforilasyonunu, 500 μM IBMX ve 1 mM HEPES, α-fosfotirozin antikor ile tespit edildi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Dosya 1: Fare sperm kapasiasyonu sırasında glikoliz ve oksidatif fosforilasyon değişiklikleri tespit etmek için dalga tsay şablonu. Dalga masaüstü yazılımı bir kayıt formu doldurduktan sonra ücretsiz olarak indirilebilir(www.agilent.com/en/products/cell-analysis/cell-analysis-software/data-analysis/wave-desktop-2-6)ve Windows 7, 8 veya 10 yüklü, (Mac OSx 10.11 (veya daha yüksek) Parallels 12 (veya daha yüksek). Böylelikle, dalga şablonları hücre dışı akı çözümleyicisinden bağımsız olarak oluşturulabilir, ihraç edilebilir ve daha sonra herhangi bir hücre dışı akı çözümleyicisinin dalga yazılımına aktarılabilir. Bu dosyayı görüntülemek için lütfen buraya tıklayın (İndirmek için sağ tıklatın).

Ek Dosya 2: Örnek veri analizi ile dalga yazılımından dışa aktarılan grafik ped prizma dosyası. Bu dosyayı görüntülemek için lütfen buraya tıklayın (İndirmek için sağ tıklatın).

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.