Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Homojen Glikokonkonjuggate Kombine Doğal Olmayan Amino Asit Birleşme ve Tıklama-Kimya Aşı Amaçlı Tarafından Üretilen

4.9K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/60821

⸱

19 Aralık 2020

 ,  ,  ,  , 
1Université de Nantes, CNRS, Unité Fonctionnalité et Ingénierie des Protéines (UFIP), UMR 6286

Bu makalede

Özet

Genetik kod genişlemesi, tanımlanmış bir bölgede taşıyıcı protein üzerinde biyortgonal fonksiyonel bir grup taşıyan doğal olmayan bir amino asitin getirilmesi için uygulanır. Biorthogonal fonksiyon daha homojen bir glikokonjugate aşısı sağlamak için bir karbonhidrat antijen site seçici kaplin için kullanılır.

Özet

Genetik kod genişlemesi, doğal olmayan amino asitleri (UAA) proteinlerin özelliklerini değiştirmek, yeni protein fonksiyonlarını incelemek veya oluşturmak veya protein konjugatörlerine erişmek için tanıtmak için güçlü bir araçtır. Stop kodon bastırma, özellikle kehribar kodon bastırma, genetik olarak tanımlanmış pozisyonlarda BA'ları tanıtmak için en popüler yöntem olarak ortaya çıkmıştır. Bu metodoloji burada bir biyoortogonal fonksiyonel grup barındıran bir UAA içeren bir taşıyıcı protein hazırlanması için uygulanır. Bu reaktif sap ı daha sonra homojen bir glikokonjugate aşısı sağlamak için sentetik bir oligosakkarit hapteni özel ve verimli bir şekilde aşılamak için kullanılabilir. Protokol 1:1 karbonhidrat hapten/taşıyıcı protein oranında glikokonjugates sentezi ile sınırlıdır ancak biorthogonal fonksiyonel grupların çok sayıda çiftleri için münasiptir. Glycococonjugate aşı homojenliği tam fizyo-kimyasal karakterizasyonu sağlamak için önemli bir kriterdir, bu nedenle, daha fazla ve daha zorlu ilaç düzenleyici kurum önerileri tatmin, klasik konjugasyon stratejileri ile karşılanmayan bir kriter. Ayrıca, bu protokol, yapı-immünojenite ilişkilerine yönelik araçlar ortaya çıkararak, gerçek eşleç aşının yapısını hassas bir şekilde ayarlamayı mümkün kılmıştır.

Giriş

Glikokonjugate aşıları, bulaşıcı hastalıkların profilaktik tedavisinde mevcut olan aşı cephaneliğinin temel unsurlarıdır. Onlar güvenli, iyi tolere ve genç bebekler de dahil olmak üzere geniş bir yaş grubunda verimli. Meningokok, pnömokok veya Haemophilus influenzae tip b1gibi kapsüllü bakterilerin neden olduğu enfeksiyonlara karşı en iyi savunmayı sağlarlar. Glycococonjugate aşılar bakteri kapsülleri oluşturan saflaştırılmış bakteriyel polisakkaritler veya bu yüzey ifade li polisakkaritler taklit sentetik oligosakkaritler yapılır2, kovalent bir taşıyıcı protein ebağlı. Bir taşıyıcı protein varlığı karbonhidrat antijenleri tarafından ifade antijenik determinant karşı yönlendirilen koruyucu humoral bağışıklık yanıtları teşvik etmek esastır3. Karbonhidrat antijeninin dikkatli bir seçimi ve üretimi dışında, glikokonjugate aşısının etkinliği üzerinde etkili olduğu bilinen özellikler şunlardır: taşıyıcı proteinin doğası, konjugasyon kimyası (kullanılırsa bağlayıcının doğası ve uzunluğu dahil) veya sakkarit/protein oranı3. Açıkçası, sakkarit proteine konjuge pozisyonları yanı sıra bağlantı noktalarının sayısı immünjenite için ilgilidir. Glikokonjugates hazırlanması büyük ölçüde ampirik kalır, çünkü bugüne kadar, bu iki parametre pek çalışılmıştır. Sentezleri genellikle taşıyıcı protein dizisinde bulunan lizin veya aspartik/glutamik asit yan zincir kalıntılarının amin veya karboksilik asit fonksiyonlarının kullanımına dayanır. Bu tek bir değil, glikokonjugates heterojen bir karışıma yol açar.

Proteindeki amino asit kalıntılarının reaktivitesi, erişilebilirliği veya dağılımı üzerinde oynamak, sakkarit/protein bağlantısının etkisini belgelemek için daha güvenilir olan daha tanımlı glikokonjugates'e yol açar4. Bu hedefe doğru bir adım protein glikan kaplin teknolojisi, hücre fabrikalarında kontrollü glikokonkonjugate aşıların üretimine olanak sağlayan bir rekombinant süreci uygulayarak elde edilebilir5,6. Ancak, glikozilasyon sadece D /EXNYS/T sequons içinde bir asparagin kalıntısı yer alır (x herhangi bir olduğu gibi 20 doğal amino asitler, doğal taşıyıcı proteinler üzerinde mevcut değildir.

Site seçici mutagenez ve sistein özellikle dahil onların yüksek ve seçici reaktivite yararlanmak için alternatif olarak görünür7,8. Kendi sıralarına UAA'ları içeren taşıyıcı proteinlerin üretimi homojen glikokonleklek aşı hazırlanması için daha fazla esneklik sunabilir. 100'den fazla UAA geliştirilmişve daha çeşitli proteinler9,10dahil edilmiştir. Birçoğu genellikle post translational modifikasyonlar11 veya aşılamak için kullanılan biyoortogonal fonksiyonlar içerir12 veya ilaçlar13 ama karbonhidrat antijenleri ile daha fazla konjugasyon için ideal kolları vardır. Başarılı örnekler Biotech14 tarafından hücresiz protein sentezi15 kullanılarak iddia edilmiştir ancak bu stratejiye göre glikokonjugate aşıların hazırlanması hala popüler hale gelmesini beklemaktadır.

Mutasyona uğramış taşıyıcı protein üretimi için in vivo stratejisinin uygulanması belirli bir kodon içeren değiştirilmiş bir çeviri makine ihtiyacı, kodonu tanıyan bir tRNA ve özellikle tRNA üzerinde UAA transferi katalizler bir aminoasil-tRNA synthetase (aaRS) (Şekil 1)16. Pyrrolysine kehribar stop kodon bastırma uaa dahil etmek için en yaygın olarak kullanılan yöntemlerden biridir, özellikle propargyl-lizin (PrK)17. İkincisi sırayla tam tanımlanmış, homojen glycococonjugates sağlamak için azido fonksiyonel karbonhidrat haptens ile reaksiyona olabilir. Bu el yazmasında, alkin sapı taşıyan bir UAA olan propargyl-L-lizinin nasıl sentezleneceğini, bir bakterinin çevirisi sırasında hedef proteine nasıl dahil edilebildiğini ve son olarak da modifiye edilmiş protein ile tıklama kimyası kullanan bir azit fonksiyonu taşıyan hapten arasında çekimin nasıl yapılacağını anlatıyoruz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

1. UAA sentezi: propargyl-lizin (PrK)

  1. N αsentezi -Boc-propargyl-lizin18
    1. 500 mg Boc-L-Lys-OH (2,03 mmol) sulu 1 M NaOH (5 mL) ve THF (5 mL) karışımını bir şişede çözün ve şişeyi silikon septumla sığdırın.
    2. Bir buz banyosunda şişeyi soğutun ve karıştırırken mikroşiniş kullanarak 158 μL propargyl kloroformate (1,62 mmol) damla (2-3 dk'lık bir süre içinde) ekleyin.
    3. Reaksiyon karışımını oda sıcaklığına Kadar ısıtın ve 10 saat karıştırmaya devam edin.
    4. Bir buz banyosunda 50 mL dietil eter, 50 mL sulu 1 M hidroklorik asit ve 60 mL etil asetat çözeltilerini soğutun.
    5. Bir buz banyosunda ham reaksiyon karışımı serin ve bir ayırma hunisi içine karışımı dökün. Metil eter 50 mL ile karışımı ayıklayın. Organik katmanı atın.
    6. Ayırma hunisindeki sulu faza sulu 1 M hidroklorik asit dikkatlice ekleyin. Daha sonra 30 mL etil asetat kullanarak sulu tabakayı iki kez ayıklayın. Organik fazda N-Boc-propargyl-lizin in varlığını TLC ile CH2Cl2-metanol (9:1) elüent olarak kullanarak doğrulayın.
    7. MgSO4üzerinde kombine organik katmanları kurulayın, katı faz kapalı filtre ve bir döner buharlaştırıcı üzerinde azaltılmış basınç altında filtrat konsantre.
    8. Ham yağlı Nα-Boc-propargyl-lizin örneğini deuterated kloroform (CDCl3)içinde çözünve 1H NMR ile kimliğini kontrol edin.
      DİkKAT: Çıkarma basınç birikme neden olabilir. Sık sık herhangi bir basınç birikimi bırakın.
  2. Doğal olmayan amino asit propargyl-L-lizin sentezi (PrK)
    1. Bir septum ile donatılmış yuvarlak bir alt şişe Nα-Boc-propargyl-lizin tanıtın.
    2. Nα-Boc-propargyl-lizin içözünür argon altında şişeye 4 mL susuz diklorotan (CH2Cl2)ekleyin.
    3. Karıştırırken bir şırınga kullanarak 4 mL trifloroasetik asit (TFA) ekleyin.
    4. RT'de 1 saat boyunca reaksiyon karışımını karıştırın.
    5. Reaksiyon karışımını azaltılmış basınç altında yoğunlaştırın.
    6. Ham kalıntıya dietil eter ekleyin ve PrK'yı çökeltmek için 4 °C'de 1 saat kuluçkaya yatırın. Daha yüksek ölçekte çalışırken, PrK tamamen çökelmemişse, onu çökeltmek ve gerekirse kuluçka süresini uzatmak için trituat.
    7. PrK'yi, çatallı camüzerinde beyaz bir katı şeklinde filtreleyin.
    8. PrK'nın bir aliquotunu D2O'da eritin. Daha sonra kimliğini ve saflığını kontrol etmek için NMR analizleri gerçekleştirin.
    9. Daha fazla kullanım için, 100 mM nihai konsantrasyonda distile suda doğal olmayan amino asit PrK eritin ve 1 mL aliquots olarak -20 °C'de saklayın.

2. PrK tarafından modifiye edilen rekombinant proteinin üretimi

  1. Plazmid hazırlığı
    1. Hedef olgun Pnömokok yüzey yapıştırıcısı A (mPsaA) geni (p) içeren bir plazmid (pET24d-mPsaAK32TAG-ENLYFQ-HHHHHH) bir ekspresyon oluşturmak ET24d-mPsaA-WT) pET24d plazmid Insert ve XhoI kısıtlama siteleri arasında ekleme klonlama tarafından bir Tütün Etch Virüs (TEV) proteaz dizisi izledi. Bu proteinin C-terminus bir His6 etiketi tanıtacak. Konvansiyonel site yönelimli mutagenez tekniği ni kullanarak lizin-32 kodonunu kehribar kodonu (TAG) ile değiştirin.
    2. Methanosarcina mazei (MmPylRS) pirrolysyl-tRNA synthetase için gen kodlama iki kopyasını içeren ikinci bir ifade plazmid (pEVOL-MmPylRS) ve daha önce açıklandığı gibi ilgili tRNAPyr için gen kodlama oluşturmak19. BaA'ların verimli bir şekilde dahil edilmesi için bu özel olarak tasarlanmış plazmid vektörü olan pEVOL'u kullanın.
      NOT: Ayrıntılı plazmids bilgileri Ek Dosya 1'deaçıklanmıştır.
  2. Plazmidlerin ifade gerilimine ortak dönüşümü
    1. 5 dakika boyunca buz üzerinde kimyasal olarak yetkin Escherichia coli BL21(DE3) bir 100 μL aliquot çözülme.
    2. Hücrelere her plazmidin 1 μL'sini (her biri 50-100 ng) ekleyin ve 30 dakika boyunca buz üzerinde kuluçkaya yatırın.
    3. 1,5 mL'lik mikrotüpü 42 °C'de bir kuvözde erimiş hücrelerle 45 s'ye aktarın ve 2 dakika boyunca tekrar buza taşıyın.
    4. Antibiyotik ekspresyonuna izin vermek için 37 °C'de 1 saat sallayarak 900 μL LB orta ve inkübat ekleyin. Daha sonra bakterileri 25 g/mL kanamisin ve 30 g/mL kloramfenikol ile LB agar üzerine plakalayın. Bakterilerin bir gecede 37 °C'de büyümesini bekleyin.
  3. PrK ile modifiye proteinlerin ekspresyonu
    1. 5 mL LB orta sında tek bir ortak dönüştürülmüş koloniyi antibiyotiklerle (25 μg/mL kanamisin ve 30 g/mL kloramfenikol) aşılamak. Bir gece boyunca 37 °C'de sallayarak kuluçkaya yat.
    2. Birincil kültürü (5 mL) antibiyotik içeren 500 mL,L-arabinose%0.02 ve doğal olmayan amino asit PrK'nın 1 mM'sine seyreltin ve 37 °C'de 24 saat sallayarak inkükarta edin. WT proteini içeren bir klonun kültürünü gerçekleştirerek prk olmadan kültürü paralel olarak gerçekleştirerek negatif bir kontrol ve pozitif kontrol ekleyin.
    3. Aliquot 5 mL 500 mL kültür orta ve santrifüj dışında 10 dakika 5.000 x g. Supernatant atın ve -20 °C pelet dondurun. Kalan 495 mL'den 10 dk 5.000 x g.'da santrifüj ile hasat hücreleri . Supernatant atın ve -20 °C pelet dondurun.
  4. SDS-PAGE ve batı Blot analizi ile 5 mL kültür örneklerinden ham hücre özlerini analiz edin
    1. 5 mL hücreli peleti 250 μL lysis tamponuna (50 mM Na2HPO4/NaH2PO4, 150 mM NaCl, pH 8, 5 mM imidazole, 0.2 mM PMSF) yeniden askıya alın ve 1,5 mL mikrotüpiçine aktarın.
    2. Hücreleri sıvı nitrojendeki tüpleri dondurarak, 42 °C'lik bir banyoda eriterek ve 30 s yüksek hızda girdap layarak lyse hücreleri. Bu adımı 3 kez tekrarlayın.
    3. Hücre enkazLarını ortadan kaldırmak için 10 dk için 17.000 x g'de santrifüj örnekleri.
    4. Supernatant 10 μL alın ve 5 μL su ve yükleme tampon (bromofenol mavisi, SDS, β-mercaptoetanol) 5 μL ekleyin. Numuneleri 100 °C'de 5 dk ısıtın ve SDS-PAGE ve western Blot analizlerini gerçekleştirin.
  5. Nikel-NTA boncuklar kullanılarak yerçekimi akış-tezgah afinite kromatografisi ile protein saflaştırma
    1. Hücre peletlerini (495 mL kültüründen) 20 mL lysis tamponuna (50 mM Na2HPO4/NaH2PO4,150 mM NaCl, pH 8, 5 mM imidazole, 0.2 mM PMSF) yeniden askıya alın.
    2. Süspansiyona 5 μL DNase I (1 mg/mL) ve 500 μL (50 mg/mL) ekleyin ve süspansiyonu 30 dakika boyunca 37 °C'de kuluçkaya yatırarak lysis'e izin verin.
    3. Hücreleri 5 dakika boyunca sonicate (5 s-5 s döngüleri, genlik 50%) ve sonra 30 dk için 20.000 x g santrifüj ile hücre enkaz kaldırmak ve 0.45 μm filtre üzerinde filtrasyon takip.
    4. Süspansiyona Ni-NTA reçin ekleyin (hücre kültürünün 500 mL'si için 500 l L) ve 4 °C'de 1 saat hafifçe karıştırın.
    5. Bir polipropilen sütuniçine süspansiyon dökün ve bağlanmamış fraksiyonu toplamak.
    6. Reçin'i 50 mM Na2HPO4/NaH2PO4,150 mM NaCl, 10 mM imidazol içeren 10 mL yıkama tamponu ile yıkayın. Reçiyiyi 5 mL yıkama tamponu (50 mM Na2HPO4/NaH2PO4,150 mM NaCl, 20 mM imidazol) ile ikinci kez yıkayın. Yıkama kesirlerini toplayın.
    7. 1 mL elüsyon tamponu (50 mM Na2HPO4/NaH2PO4, 150 mM NaCl, 300 mM imidazol) ile etiketli proteini eute. Bu adımı 4 kez tekrarlayın ve tüm elüsyon kesirlerini toplayın.
    8. %12 akrilamid jelüzerinde SDS-PAGE tarafından 7 saflaştırma fraksiyonu gibi ham lysate analiz edin.
    9. Saf His-tagged protein içeren fraksiyonları birleştirin ve bir diyaliz membranı kullanarak bir gecede TEV proteaz tampon (50 mM Tris-HCl, 0.5 m M EDTA, pH 8) 1 L karşı diyaliz diyaliz membranı (cut-off MW 6000-8000 Da) karşılaştırın. 37 360 cm-100 M-1 molar yok olma katsayısı ve mPsAA için 34,14 kDa molekül ağırlığı ile proteinin konsantrasyonu 280 nm ölçün.

3. TEV proteaz sindirim tarafından histidin etiketinin kaldırılması

  1. Protein örneğini 50 mL'lik bir tüpe toplayın ve 2 mg/mL konsantrasyonda 1 mL'ye kadar TEV tamponu (50 mM Tris HCl, 0.5 mM EDTA, pH 8) ekleyin.
    NOT: Konsantrasyon önceki sonuçlara göre değişebilir. Test ettiğimiz protein konsantrasyonları tipik 2-3 mg/mL aralığındadır.
  2. 100 μL TEV proteaz ekleyin (sindirimi için 20 μg protein için 10 ünite TEV proteaz içeren 1 μL ekleyin).
  3. 0,1 M dithiothreitol (DTT) 50 μL ekleyin.
  4. 5 mL'ye kadar TEV tamponu (50 mM Tris HCl, 0,5 mM EDTA, pH 8) ile tamamlanır.
  5. Gece boyunca 4 °C'de yavaş sallayarak kuluçkaya yat.
    NOT: Sindirim tamamlanmazsa, daha fazla TEV proteaz ekleyin, daha uzun süre veya 30 °C'ye kadar daha yüksek sıcaklıkta kuluçkaya yatırın.
  6. Fosfat tamponuna karşı bir diyaliz membranı (cut-off 6000-8000 Da) kullanarak bir gecede 4 °C'de EDTA'yı çıkarmak için sindirilmiş proteini diyalize kapatın (50 mM Na2HPO4/NaH2PO4, 150 mM NaCl, 5 mM imidazol).
  7. TEV proteazını ve sindirilmemiş proteini ortadan kaldırmak için karışımı Ni-NTA boncuklarıyla kuluçkaya yatırın ve 4 °C'de 1 saat hafifçe karıştırın.
  8. Süspansiyonu polipropilen kolona dökün. Bağlanmamış fraksiyonu toplayın ve kolon5 mL yıkama tamponu (50 mM Na2HPO4/NaH2PO4,150 mM NaCl, 10 mM imidazol) ile yıkayın
    NOT: İlgi proteini bağlanmamış ve yıkanan kesirlerde geri kazanılmalıdır.
  9. Kolona 5 mL elüsyon tamponu (50 mM Na2HPO4/NaH2PO4, 150 mM NaCl, 300 mM imidazol) ekleyerek TEV protease ve sindirilmemiş proteini ete. 280 nm'de ve SDS-PAGE analizi ile protein içeriği için kesirleri kontrol edin.
  10. Sindirilmiş numuneleri sindirilmemiş proteini kontrol edilerek Sindirilmiş numuneleri sindirerek sindirimin verimliliğini kontrol edin.
  11. Sindirilmiş proteini 1 L'lik tıklama tamponuna (50 mM Na2HPO4/NaH2PO4, pH8) bir gecede bir diyaliz zarı (cut-off 6000-8000 Da) ile diyaliz membranı ile diyaliz etimine karşı diyalize sindirin, tamponu değiştirmek için, ve mÖsyö lerin mösyö yok olma katsayısı ve mPsaA'nın moleküler ağırlığı (37 360 cm-1-1 ve MW 34,14 kDa) ile proteinin konsantrasyonunu 280 nm olarak ölçün.

4. Tıklama kimyası için doğal olmayan amino asit propargyl-lizin erişilebilirliğinin ve işlevselliğinin değerlendirilmesi

NOT: Presolski ve ark.20 tarafından tıklama kimyası için açıklanan protokolü kullanarak 6-hexachloro-fluorescein-azide ile milletvekillerini biraraya edin.

  1. 2 mL mikrotüp içine 57,8 μM konsantrasyonda 432,5 μL PrK mutasyona uğramış protein alın.
    NOT: En az 2 μM alkyne konsantrasyonu kabul edilebilir. Protein konsantrasyonu daha düşükse, bir santrifüj konsantratörü ile konsantre veya azide / alkyne molar oranını artırarak reaksiyon dengesi lehine.
  2. 50 mM 6-heksakloro-floresan-azit 10 μL ekleyin ve sonra 20 mM'de 2,5 μL CuSO4 çözeltisi ve 50 mM 'de (stok çözeltisi konsantrasyonları) 7,5 μL Tris(benzyltriazolyethyl)amin (THPTA) premixini ekleyin.
    1. 25 μL sulu 100 mM aminoguanidin hidroklorür ekleyin.
    2. 25 μL 20 mg/mL sodyum askorbat eksfirolarak hazırlanmış sulu çözelti ekleyin.
    3. Tüpü kapatın, birkaç kez ters çevirerek karıştırın ve 2 saat oda sıcaklığında kuluçkaya yatırın.
    4. 0,5 M EDTA 50 μL ekleyerek reaksiyonu durdurun.
    5. Reaksiyon karışımının 15 μL'sini alın ve bir mikrotüp koyun, 5 μL yükleme tamponu (bromofenol mavisi, SDS, β-mercaptoetanol) ekleyin, karışımı 100 °C'de 5 dakika ısıtın ve sonra %12 akrilamid jeline yükleyin. Göçten sonra, 312 nm UV ışığı altında jel üzerinde floresan eşlenik görselleştirin.

5. Azido-fonksiyonel karbonhidrat antijeni (Pn14TS-N3)ile mPsAA'nın tıklama kimyası ile konjugasyonu

  1. Kaplin
    1. 2 mL mikrotüp içine 57,8 μM'de 432,5 μL PrK mutasyona uğramış protein alın.
    2. Suya 10 mM Pn14TS-N321 ekleyin ve 20 mM'de 2,5 μL CuSO4 çözeltisi ve 50 mM'de 7,5 00 00 00 00 00 00 00 00 00 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 00 00 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 0
      NOT: Streptococcus pneumoniae serotip 14 kapsüler polisakkariti taklit eden tetrasakkarit pn14TS-N3sentezi, referans 21'de tanımlanmıştır. Teorik olarak, herhangi bir karbonhidrat antijeni içeren bir azit fonksiyonu kullanılabilir.
    3. 100 mM aminoguanidin hidroklorür 25 μL ekleyin.
    4. Sodyum askorbat 25 μL 20 mg/mL extemporaneously hazırlanmış sulu çözelti ekleyin.
    5. Tüpü kapatın, birkaç kez ters çevirerek karıştırın ve 2 saat boyunca RT'de kuluçkaya yatırın.
    6. 0,5 M EDTA 50 μL ekleyerek reaksiyonu durdurun.
    7. 15 μL numune alın ve SDS-PAGE ile analiz edin.
  2. Glikokonjugate jel filtrasyon arıtma
    1. Glikokontopil bir steric dışlama agarose sütun (15 x 600 yatak boyutları, 3.000-70.000 fraksiyonasyon aralığı) uygulayarak, 100 mM PBS tampon, pH 7.3 ile dengelenir 0.8 mL/dk akış 280 nm algılama ile arındırın.
    2. Glikokonjugate içeren kesirleri toplayın.
      NOT: Uzun süreli depolama için glikokonjugate'i 1L 2 O'ya karşı iki kez 2 saat diyaliz membranı (kesme Mw 6000-8000 Da) kullanarak 4 °C'de diyalize kapatın, sonra dondurun-kurulayın ve glikokonjugate -80 °C'de saklayın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Bu projede, tanımlanmış bir bölgede UAA tanıtmak için kehribar stop kodon bastırma stratejisi kullanılarak homojen bir glikonkonjuge aşı hazırlanmıştır(Şekil 1). Pnömokok alhesin A taşıyıcı protein moiety olarak seçildi. Bu protein son derece korunmuş ve Streptococcus pneumoniaetüm suşları ile ifade22. Bu son derece immünojenik ve daha önce pnöyokok aşı formülasyonları21,23<...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Site yönelimli mutagenez ancak glikokonjugate aşıları hazırlamak amacıyla kullanılan kalır bir protein tanımlı bir konumda belirli amino asitler dahil etmek için basit bir stratejidir7,8,14. 20 doğal amino asit yaklaşımına dayalı klasik mutagenez, çeviri makinelerinde herhangi bir değişiklik gerektirmediğinden son derece etkilidir. Sistein mutasyonları genellikle daha doğrudan ya da iki adımda benzersiz tiyol reaktivitesi keşfet...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Teşekkürler

E.C. minnetle La Région Pays de la Loire (Pari Scientifique Programı "BioSynProt"), özellikle t.V. bir doktora bursu mali destek kabul eder. Biz de Dr Robert B. Quast (INRA UMR0792, CNRS UMR5504, LISBP, Toulouse, Fransa) onun değerli teknik tavsiyeler için kabul.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
AIM (otoindüktif ortam)OrtaAIMLB0210Katı toz
Boc-Lys-OHAlfa-AesarH63859Katı toz
BL21(DE3)Merck Novagen69450E. coli str. B, F- ompT gal dcm lon hsdSB(rB-mB-) λ (DE3 [lacI lacUV5-T7p07 ind1 sam7 nin5]) [malB+]K-12(λ S)
Diyaliz membranı
DNAseI
Filtresi 0.45 &mikro; m
L-arabinoz
lizozim
Ni-NTA reçinesiMachery NagelProtinoNi-NTA boncukları% 20 etanol içine süspansiyon halinde
Pall santrifüj cihazı
pET24d-mPsaAK32TAG-ENLYFQ-HHHHHHbu çalışmapET24d-mPsaA-WT ile aynıdır, ancak içinde bir K32TAG mutasyonu vardır. mPsaA geni
pET24d-mPsaA-WTbu çalışma, BamHI ve XhoI arasında klonlanmış Wt mPsaA geni ile pET24d plazmidi, ardından mPsaA geninin C-terminal ucunda bir His6 etiketi ve Kanamisin direnç geni
pEVOL plazmidiniLemke EMBL'den (ref 19)hediyep15A orijinli plazmid, iki kopya MmPylRS (biri GlnS promotörü altında ve diğeri pAra promotörü altında), ProK promotörü altında tRNACUA'ın bir kopyası, kloramfenikol direnç geni
Propargil kloroformatSigma-Aldrich460923Sıvı
SonikatörThermo FisherFB120-220
taşıyan Edward

Kaynaklar

  1. Rappuoli, R. Glycoconjugate vaccines: Principles and mechanisms. Science Translational Medicine. 10 (456), (2018).
  2. Verez-Bencomo, V., et al. A synthetic conjugate polysaccharide vaccine against Haemophilus influenzae type b. Science (New York, N.Y). 305 (5683), 522-525 (2004).
  3. Berti, F., Adamo, R. Antimicrobial glycoconjugate vaccines: an overview of classic and modern approaches for protein modification. Chemical Society Reviews. 47 (24), 9015-9025 (2018).
  4. Stefanetti, G., et al. Sugar-Protein Connectivity Impacts on the Immunogenicity of Site-Selective Salmonella O-Antigen Glycoconjugate Vaccines. Angewandte Chemie (International Ed. in English). 54 (45), 13198-13203 (2015).
  5. Kay, E., Cuccui, J., Wren, B. W. Recent advances in the production of recombinant glycoconjugate vaccines. NPJ Vaccines. 4, 16(2019).
  6. Ma, Z., Zhang, H., Wang, P. G., Liu, X. W., Chen, M. Peptide adjacent to glycosylation sites impacts immunogenicity of glycoconjugate vaccine. Oncotarget. 9 (1), 75-82 (2018).
  7. Grayson, E. J., Bernardes, G. J. L., Chalker, J. M., Boutureira, O., Koeppe, J. R., Davis, B. G. A coordinated synthesis and conjugation strategy for the preparation of homogeneous glycoconjugate vaccine candidates. Angewandte Chemie (International Ed. in English). 50 (18), 4127-4132 (2011).
  8. Pillot, A., et al. Site-Specific Conjugation for Fully Controlled Glycoconjugate Vaccine Preparation. Frontiers in Chemistry. , (2019).
  9. Neumann-Staubitz, P., Neumann, H. The use of unnatural amino acids to study and engineer protein function. Current Opinion in Structural Biology. 38, 119-128 (2016).
  10. Dumas, A., Lercher, L., Spicer, C. D., Davis, B. G. Designing logical codon reassignment - Expanding the chemistry in biology. Chemical Science. 6 (1), 50-69 (2015).
  11. Chen, H., Venkat, S., McGuire, P., Gan, Q., Fan, C. Recent Development of Genetic Code Expansion for Posttranslational Modification Studies. Molecules (Basel, Switzerland). 23 (7), (2018).
  12. Adumeau, P., Sharma, S. K., Brent, C., Zeglis, B. M. Site-Specifically Labeled Immunoconjugates for Molecular Imaging--Part 2: Peptide Tags and Unnatural Amino Acids. Molecular imaging and biology: MIB: the official publication of the Academy of Molecular Imaging. 18 (2), 153-165 (2016).
  13. Kularatne, S. A., et al. A CXCR4-targeted site-specific antibody-drug conjugate. Angewandte Chemie (International Ed. in English). 53 (44), 11863-11867 (2014).
  14. WIPO. Patent US20180333484 Polypeptide-Antigen Conjugates with Non-Natural Amino Acids. , https://patentscope.wipo.int/search/en/detail.jsf?docId=US233548973&recNum=65&docAn=15859251&queryString=(GBS)&maxRec=11858 (2018).
  15. Quast, R. B., Mrusek, D., Hoffmeister, C., Sonnabend, A., Kubick, S. Cotranslational incorporation of non-standard amino acids using cell-free protein synthesis. FEBS letters. 589 (15), 1703-1712 (2015).
  16. Wang, L. Engineering the Genetic Code in Cells and Animals: Biological Considerations and Impacts. Accounts of Chemical Research. 50 (11), 2767-2775 (2017).
  17. Brabham, R., Fascione, M. A. Pyrrolysine Amber Stop-Codon Suppression: Development and Applications. Chembiochem: A European Journal of Chemical Biology. 18 (20), 1973-1983 (2017).
  18. Oller-Salvia, B. Genetic Encoding of a Non-Canonical Amino Acid for the Generation of Antibody-Drug Conjugates Through a Fast Bioorthogonal Reaction. , https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Genetic+Encoding+of+a+Non-Canonical+Amino+Acid+for+the+Generation+of+Antibody-Drug+Conjugates+Through+a+Fast+Bioorthogonal+Reaction (2019).
  19. Young, T. S., Ahmad, I., Yin, J. A., Schultz, P. G. An enhanced system for unnatural amino acid mutagenesis in E. coli. Journal of Molecular Biology. 395 (2), 361-374 (2010).
  20. Presolski, S. I., Hong, V. P., Finn, M. G. Copper-Catalyzed Azide-Alkyne Click Chemistry for Bioconjugation. Current Protocols in Chemical Biology. 3 (4), 153-162 (2011).
  21. Prasanna, M., et al. Semisynthetic glycoconjugate based on dual role protein/PsaA as a pneumococcal vaccine. European Journal of Pharmaceutical Sciences: Official Journal of the European Federation for Pharmaceutical Sciences. 129, 31-41 (2019).
  22. Morrison, K. E., et al. Confirmation of psaA in all 90 serotypes of Streptococcus pneumoniae by PCR and potential of this assay for identification and diagnosis. Journal of Clinical Microbiology. 38 (1), 434-437 (2000).
  23. Lin, H., Lin, Z., Meng, C., Huang, J., Guo, Y. Preparation and immunogenicity of capsular polysaccharide-surface adhesin A (PsaA) conjugate of Streptococcuspneumoniae. Immunobiology. 215 (7), 545-550 (2010).
  24. Safari, D., et al. Identification of the smallest structure capable of evoking opsonophagocytic antibodies against Streptococcus pneumoniae type 14. Infection and Immunity. 76 (10), 4615-4623 (2008).
  25. Wang, Q., Parrish, A. R., Wang, L. Expanding the genetic code for biological studies. Chemistry & Biology. 16 (3), 323-336 (2009).
  26. Lawrence, M. C., Pilling, P. A., Epa, V. C., Berry, A. M., Ogunniyi, A. D., Paton, J. C. The crystal structure of pneumococcal surface antigen PsaA reveals a metal-binding site and a novel structure for a putative ABC-type binding protein. Structure (London, England: 1993). 6 (12), 1553-1561 (1998).
  27. Wright, T. H., Davis, B. G. Post-translational mutagenesis for installation of natural and unnatural amino acid side chains into recombinant proteins. Nature Protocols. 12 (10), 2243-2250 (2017).
  28. Dadová, J., Galan, S. R., Davis, B. G. Synthesis of modified proteins via functionalization of dehydroalanine. Current Opinion in Chemical Biology. 46, 71-81 (2018).
  29. Worst, E. G., et al. Residue-specific Incorporation of Noncanonical Amino Acids into Model Proteins Using an Escherichia coli Cell-free Transcription-translation System. Journal of Visualized Experiments. (114), (2016).
  30. Carboni, F., et al. GBS type III oligosaccharides containing a minimal protective epitope can be turned into effective vaccines by multivalent presentation. The Journal of Infectious Diseases. , (2019).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Glikokonjugat AşıGenetik Kod GenişletmeAmber Kodon BaskılanmasıProtein SaflaştırmaJel FiltrasyonuKütle SpektrometrisiSDS PageWestern Blot
Homojen Glikokonkonjuggate Kombine Doğal Olmayan Amino Asit Birleşme ve Tıklama-Kimya Aşı Amaçlı Tarafından Üretilen
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.