Miyokard Enfarktüsü Fare Modelinde Modifiye mRNA Teslimi

Gen tedavisi, insan hastalıklarının tedavisi, tedavisi veya önlenmesi için nükleik asitlerin teslimini içeren güçlü bir araçtır. Kalp hastalığı için tanı ve tedavi yaklaşımlarında kaydedilen ilerlemeye rağmen, miyokard enfarktüsü (MI) ve kalp yetmezliği (HF) genlerin tesliminde sınırlı başarı olmuştur. Gen terapisi süreci ne kadar basit görünse de, belirli bir teslimat aracını kullanmadan önce optimize edilmesi gereken birçok faktörü göz önünde bulundurarak oldukça karmaşık bir yaklaşımdır. Doğru teslim vektörü insan vücudunda immünojenik olmayan, verimli ve kararlı olmalıdır. Bu alandaki çalışmalar iki tür dağıtım sistemi oluşturmuştur: viral veya viral olmayan. Adenovirüs, retrovirüs, lentivirüs veya adeno ilişkili virüs tarafından gen transferi de dahil olmak üzere yaygın olarak kullanılan viral sistemler, olağanüstü transdüksiyon kapasitesi göstermiştir. Ancak, kliniklerde kullanımları nedeniyle güçlü bağışıklık yanıtı indüklenen^{sınırlıdır 1}, tümörigenez riski², veya nötralize antikorların varlığı³, tüm bunlar insan gen tedavisinde viral vektörlerin geniş ve etkili uygulanması için önemli bir engel olmaya devam etmektedir. Öte yandan, onların etkileyici ifade desen rağmen, çıplak plazmid DNA teslim düşük transfksiyon verimliliği görüntüler, mRNA transferi RNase tarafından bozulmaya yüksek immünjenite ve duyarlılık sunarken⁴.

mRNA alanında kapsamlı bir araştırma ile, modRNA geleneksel^vektörler5 üzerinde sayısız avantajları nedeniyle kalp ve çeşitli diğer organlara genlerin teslimi için cazip bir araç haline gelmiştir. Doğal olarak meydana gelen psödoürin ile idrar tam değiştirilmesi daha sağlam ve geçici protein ekspresyonu sonuçları, doğuştan gelen bağışıklık yanıtı ve genomik entegrasyon riski minimal indüksiyon ile⁶. Son zamanlarda kurulan protokoller, sentetik mRNA^7'ninstabilitesini ve transability'sini artırarak protein çevirisini daha da artıran optimize edilmiş bir anti-ters kapak analogu (ARCA) kullanmaktadır.

Önceki raporlar çeşitli muhabir veya fonksiyonel genlerin ifade göstermiştir mi sonra kemirgen miyokardinde modRNA tarafından teslim. ModRNA uygulamaları ile, kardiyomiyositler ve nonkardiyomiyositler de dahil olmak üzere miyokardiyumun önemli alanları, anjiyogenez⁹,^10,kardiyak hücre sağkalım¹¹ve kardiyomiyosit proliferasyonu¹²neden olmak için başarıyla post-kardiyak yaralanma⁸ transfected edilmiştir. Mutasyona uğramış insan follistatin benzeri 1 için kodlanmış modRNA tek bir uygulama fare yetişkin CMs çoğalmasını indükler ve önemli ölçüde kardiyak fonksiyonu artırır, skar boyutunu azaltır, ve kılcal damar yoğunluğunu artırır 4 hafta post-MI¹². Daha yeni bir çalışmada bir domuz modeli nde VEGFA modRNA uygulaması ile MI sonra geliştirilmiş kardiyak fonksiyon bildirdi¹⁰.

Bu nedenle, kardiyak alanda modRNA artan popülaritesi ile, geliştirmek ve kalp sonrası MI modRNA teslimi için bir protokol optimize etmek esastır. Burada herhangi bir bağışıklık yanıtı uyarıcı olmadan sağlam, istikrarlı protein ifadesi sağlayan bir biyouyumlu sitrat-salin formülasyonu saf ve optimize modRNA hazırlanması ve teslim açıklayan bir protokoldür. Bu protokol ve videoda gösterilen yöntem, sol anterior inen arterin (LAD) kalıcı ligasyonu ile fare MI'nin standart cerrahi işlemini ve ardından üç adet modRNA intrakardiyak enjeksiyonunu göstermektedir. Bu makalenin amacı, modRNA uygulamasını kardiyak gen tedavisi için yaygın olarak erişilebilir hale getirmek için minnet miyokardiyumuna modRNA teslimatının son derece doğru ve tekrarlanabilir bir yöntemini açıkça tanımlamaktır.

Burada özetlenen tüm hayvan prosedürleri Mount Sinai Kurumsal Bakım ve Kullanım Komitesi'nde Icahn Tıp Fakültesi tarafından onaylanmıştır.

1. modRNA sentezi

NOT: ModRNA sentezinin ayrıntıları Kondrat ve ark.^13'tebulunabilir.

1. Plazmid şablonlarını(Malzeme Tablosu)sipariş edin ve mRNA şablonu olarak kullanmak üzere temiz bir PCR ürünü oluşturun.
2. Aşağıdakiözelleştirilmiş ribonükleoside karışımı ile transkripsiyon in vitro ile modRNA'ları hazırlayın (Malzeme Tablosu): T7 transkripsiyon kiti, 6 mM anti-ters kapak analogu (ARCA) 30-O-Me-m7G(50) ppp(50)G, 75 mM guanozin trifosfat, 75 mM adenozin trifosfat, 75 mM sitidin trifosfat, 100 mM psödoürin-5-trifosfat ve T7 DNase enzimi.
3. Bir transkripsiyon temizleme kiti(Malzeme Tablosu)ile adım 1.2 yapılan modRNA arındırın ve antarktika fosfataz ile tedavi. Daha sonra, transkripsiyon temizleme kiti ile modRNA repurify ve bir spektrofotometre kullanarak ölçmek.
4. ModRNA'yı 10 mM Tris-HCl ve 1 mM EDTA'da etanol ve amonyum asetat ile çökeltin ve resuspend.
5. Santrifüj filtreler ile in vivo teslimat için modRNA konsantre ve otomatik bir elektroforez platformu(Tablo Malzemeler)kullanarak kalite ölçmek.

2. In vivo doğum için modRNA enjeksiyonu hazırlanması

1. 100 μg luciferase (Luc)/Cre modRNA enjeksiyonu için gereken hacmi modRNA konsantrasyonuna göre hesaplayın.
2. ModRNA'nın hesaplanan hacmini çekirdeksiz suda hazırlanan eşit parçadaki sakaroz çözeltisi (0,3 g/mL) ve 0,1 M sitrat çözeltisi (pH = 7) (her biri önerilen 20 μL) ile karıştırın.
3. Enjeksiyonun son hacmini tuzlu çözelti ekleyerek 60 μL'ye getirin.

3. Miyokard enfarktüsü cerrahisi

1. Anestezi ve hayvanın hazırlanması
   NOT: Bu çalışmada 8−12 haftalık erkek ve dişi CFW fareler kullanBilen.
   1. Bir indüksiyon odası kullanarak% 2 izofluran ile fare anestezi ve anestezi tutmak için burun ve ağız üzerinde bir yüz maskesi ile sırt üstü hayvan yerleştirin. 7−8 mm hava yolu tüpü ve filtre ile donatılmış bir solunum cihazı kullanarak mekanik ventilasyon ile anesteziyi koruyun.
   2. Fareyi ameliyat platformunda hareketsiz hale getirmek için, kol ve bacaklarını cerrahi bantla sabitleyin. boyun bölgesini ve göğüs kafesinin sol tarafını tıraş edin ve %70 etanol ve povison iyot kullanarak dezenfekte edin. Dezenfekte adımını iki kez tekrarlayın. Anestezi nin derinliğini değerlendirmek için kuyruk ve arka ayakları çimdikleme, refleksleri kontrol edin.
   3. Normothermia 'da (37.5−38 °C) çekirdek vücut sıcaklığını sürekli olarak izleyin ve koruyun.
   4. İntratrakeal entübasyon gerçekleştirerek açık hava yolunu koruyun. Bunu yapmak için fareyi, ağzı deneyciye bakacak şekilde ventral bir konuma yerleştirin ve dili yavaşça çekin. Boyun açısını ayarlayın ve entübasyon yolunu düzleştirmek ve entübasyon kanülitine itin.
   5. Hayvanın içinden nefes alamaması durumunda trakeostomi yapılabilir. Bir mikroskop kullanarak trakea özetleyen deri, kas ve doku izole orta hat boyunca bir servikal kesi gerçekleştirin. Trakea açıkça görülebildiğinde, küçük bir delik açarak ve mikrocerrahi forceps kullanarak trakeanın kranial kısmını tutarak glottisin altındaki iki kartuş halkası arasındaki dokuya endotrakeal tüpü yerleştirin.
   6. Her iki akciğerin de oksijen aldığını doğrulamak için farenin torasik hareketini gözlemleyin. Solunum hızı (RR) dakikada yaklaşık 120 nefes, 17−18 cm H₂O inspiratuar basınç ile olmalıdır.
2. Sol anterior inen (LAD) arter ligasyonu
   1. LAD ligasyonunu gerçekleştirmek için fareyi dikkatlice çevirin, böylece sağ tarafında durun. Cildi kaldırın ve 3 ve 4 kaburga arasında sol taraflı torakotomi yapmak ve dikkatle doku ve kas incelemek. Kanamayı önlemek için bir cautery kullanın.
   2. Thorax dikkatle açın ve bir kez açık, herhangi bir keskin nesne ile akciğer dokunmadan, kalp bulmak. Torasik boşluğu açık tutmak ve kalbi net bir şekilde görmek için retraktörleri kesiye yerleştirin. Şimdi kesi kenarına akciğerleri hareket ettirin ve kalbin ön yüzeyine erişmek için kalbi kaplayan perikardiyal kese parçası çıkarın.
   3. Dikkatle lad tanımlamak, pulmoner arter ve sol auricle arasında bulunan derin ışık kırmızı damar olarak görülebilir. 7-0 ipek dikiş tek bir dikiş ile LAD proksimal ligate. 4 ve 5 kaburga arasında bir göğüs tüpü (28 G, venal kateter) yerleştirin.
   4. Torasik kesiyi katmanlar halinde kapatın. Kaburga adapte ve cilt kapatmak için 5-0 ipek çalışan dikişler kullanmak için 6-0 ipek çalışan dikişler kullanın. Gelecekteki ekokardiyografik ölçüm için uygun bir pencere bıraktığından emin olun.
   5. 2 mL şırınga kullanarak toraksı ılık izotonik solüsyonla (1 L suda 9 g sodyum klorür) dikkatlice boşaltın. Fareyi sırtına yerleştirin. Trakeostomi yapıyorsanız, endotrakeal tüpü dışarı alın ve 7-0 ipek dikişler kullanarak tek bir dikiş ile trakeal kartuş halkaları adapte. Fare nin üzerine yüz maskesi yerleştirin ve 5-0 ipek çalışan dikişler kullanarak cildi kapatın.
   6. Kurtarma aşaması için entübasyon kanüllerini ventilatörden kesin ve spontan solunuma izin verin. Hayvanı, bilinçliliğe erişene kadar ısı lambasının altına yerleştirin. Tamamen uyanık olana kadar hayvanı ameliyattan sonra başıboş bırakmayın.
   7. 0.1 mg/kg vücut ağırlığında buprenophine ile ağrı tedavisi yönetin, 12 saat aralıklarla önümüzdeki 3 gün boyunca deri altı enjekte.

4. ModRNA kardiyak doğum

1. Mi'den sonra insülin şırıngası (31 G) kullanarak 2.3 adımda hazırlanan modRNA'nın toplam 60 μL'sini insülin şırıngası (31 G) ile türün.
   1. Enfarkt alanı çevreleyen kalp kasının üç farklı yerinde modRNA 20 μL enjekte (ligasyon her iki tarafında iki ve apeks bir). Göğüs kapatmadan önce, LAD hemen sonra enjeksiyonları gerçekleştirin.
      NOT: ModRNA enjeksiyon bölgelerinin temsili görüntüleri Şekil 1'degörülebilir.

5. Kalp sonrası MI protein ifade doğrulaması

1. Biyolüminesans görüntüleme sistemi kullanarak Luciferase modRNA ekspresyonu
   NOT: Sakaroz sitrat tamponunun 60 μL'sinde hazırlanan toplam 100 μg Luc mRNA MI'den sonra CFW farelerin kalbine doğrudan enjekte edilir.
   1. 24 saat mi sonrası ve modRNA enjeksiyon, bir indüksiyon odası kullanarak% 2 isofluran ile fareler anestezi ve intraperitoneally luciferin enjekte (150 mg / g vücut ağırlığı) in vivo Luc sinyalini doğrulamak için.
   2. Luc sinyali doygunluğa ulaşana kadar her 2 dakikada bir biyolüminesans görüntüleme sistemi kullanan fareleri görüntüleyin.
   3. Toplanan görüntüleme verilerini görüntüleme analiz yazılımı ile ölçün. Sadece Luc ifadesi için temel okuma olarak tuzlu su enjekte fareler kullanın ve tuzlu enjekte fareler toplanan arka plan sinyali çıkarmak.
      NOT: Luc sinyali p/s/cm²/sr x 10⁶olarak ifade edilir.
2. Cre transfeksiyon doğrulaması için immünoboyama
   1. Cre ile transfeksiyonu doğrulamak için, 100 mg/kg ketamin ve 10 mg/kg ksilazin intraperitoneal enjeksiyon uyarak 24 saat postenjeksiyon sonrası hayvanları kurban edin ve ardından servikal çıkığı takip edin. Bir kesi yapmadan önce, % 70 alkol bezi kullanarak göğüs ve karın dezenfekte.
   2. Göğüs kafesinden ~1 cm daha aşağıda enine bir kesi yaparak göğüs boşluğunu açın ve makası kafaya doğru hareket ettirin ve göğüs kafesini kesin.
   3. Göğsü açın ve fazla kanı çıkarmak için sağ ventrikül odasına 1 mL steril PBS enjekte edin. Kalbi hemen boşaltın ve kalan kanı temizlemek için steril PBS'ye yerleştirin.
   4. Kalbi 24 saat boyunca %4 paraformaldehit (PFA) ile düzeltin ve ardından 4 °C'de %30 sakaroz çözeltisinde gece kuluçkaya yatırın. Ertesi gün kalpleri optimum kesme sıcaklığına yerleştirin ve bir kriyostat kullanarak 10 μm kalınlığında kesin.
   5. Kardiyak troponin I (cTNI) karşı primer antikor ile kesitleri lekeleyin ve floresan sekonder antikor ile etiketleyin. Çekirdeği tanımlamak için, 5 dk. Floresan mikroskop kullanarak slaytları görüntüle 4',6-diamidino-2-fenilindole (DAPI) ile leke.

6. İstatistiksel analiz

1. Tuzlu ve Luc enjekte edilmiş farelerdeki Luc ifadesine dayalı bir çubuk grafiği çizin ve değerleri ortalama ± SEM olarak bildirin. İki grubu eşleşmemiş bir t-testi (****p < 0,0001) kullanarak karşılaştırın.

Sekiz ila on haftalık fareler isoflurane ile anestezi ve entübe edildi. Hayvan anestezi altında kaldıktan sonra sol torasik bölge tıraş edildi ve etanol ile sterilize edildi ve kalp LAD ligasyonu için maruz kaldı. Sol koroner arter sıkıca arter altında dikiş düğümleme tarafından tıkanmış oldu (diyagram gösterimi Şekil 1A). Başarılı bir enfarktüsten sonra (sol ventrikül serbest duvarının paling ile gösterilir), sakaroz sitrat tamponunda çözünmüş 100 μg Luc veya Cre modRNA doğrudan enjeksiyonu doğrudan insülin şırıngası kullanılarak yaralanma bölgesini çevreleyen üç farklı bölgede(Şekil 1B)

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.