Method Article

Besleyicisiz ve Kimyasal Olarak Tanımlanmış Kültür Koşulları Altında İnsan Pluripotent Kök Hücreleri Kullanan Postgangliyonik Sempatik Nöronların Verimli Farklılaşması

DOI:

10.3791/60843

⸱

May 24th, 2020

 , 
1Center for Molecular Medicine, University of Georgia, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, Franklin College of Arts and Sciences, University of Georgia, 3Department of Cellular Biology, Franklin College of Arts and Sciences, University of Georgia

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokolde, postgangliyonik sempatik nöronların insan pluripotent kök hücrelerinden üretimi için istikrarlı ve yüksek verimli bir ayırım stratejisi tanımlıyoruz. Bu model nöronlar birden fazla otonom bozuklukların çalışmalarının kullanımı için kullanılabilir hale getirecek.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İnsan pluripotent kök hücreleri (hPSCs) hastalık modelleme ve in vitro insan embriyonik gelişim çalışması için güçlü bir araç haline gelmiştir. Daha önce otonom nöropatili hastalara uygulanan sempatik karakterli otonom nöronların türemesi için bir ayırım protokolü sunmuştuk. Ancak protokol Knock Out Serum Replasmanı (KSR) ve besleyici tabanlı kültür koşulları üzerine inşa edildi ve yüksek farklılaşma verimliliği sağlamak için hücre sıralamagerekliydi. Bu faktörler yüksek değişkenlik, yüksek maliyet ve düşük tekrarlanabilirlik neden olur. Ayrıca, elektriksel aktivite de dahil olmak üzere olgun sempatik özellikleri doğrulanmamıştır. Burada, PSC kültürünün ve farklılaşmasının besleyicisiz ve kimyasal olarak tanımlanmış kültür koşullarında gerçekleştirildiği optimize edilmiş bir protokol salıyoruz. Gövde nöral ibikini tanımlayan genetik belirteçler tanımlanır. Postgangliyonik sempatik nöronlar içine daha fazla farklılaşma hücre sıralama gerek kalmadan 20 gün sonra elde edilir. Elektrofizyolojik kayıt fonksiyonel nöron kimliğini daha da gösterir. Bizim farklılaşmış nöronlar tespit Ateş nikotin tarafından geliştirilmiş ve adrenerjik reseptör antagonist propranolol tarafından bastırılmış olabilir. Bu protokoldeki orta sempatik nöral atalar, kültürlerin genişlemesine olanak sağlayan 2 haftaya kadar nöral küresel olarak muhafaza edilebilir. Özetle, bizim güncellenmiş sempatik nöron farklılaşma protokolü yüksek farklılaşma verimliliği gösterir, daha iyi tekrarlanabilirlik, daha fazla esneklik, ve önceki sürüme göre daha iyi nöral olgunlaşma. Bu protokol otonom sinir sistemini etkileyen insan bozuklukları incelemek için gerekli hücreleri ile araştırmacılar sağlayacaktır.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Postganglionik sempatik nöronlar (symNs) otonom sinir sistemine ait (ANS) ve yanıt ve bilinç bağımsız vücudun homeostaz düzenlenmesinde birden fazla önemli rolleri vardır. Örneğin, stres symNs uyarır ve kalp hızı, kan basıncı ve terleme bir artışa yol açan mücadele-veya-uçuş yanıtı çağrıştırıyor. SymNs genetik nedeniyle birden fazla insan bozuklukları etkilenir, toksisite / yaralanma, ya da diğer hastalıklara yardımcı olarak. Genetik nöropati nin bir örneği çocukluk çağı bozukluğu Ailesel Disotonomi (FD), symNs şiddetli bir disregülasyon disotonomik krize neden olur, terleme ile belirgin, cilt lekeleme, kusma atakları, hipertansiyon, ve anksiyete1

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

NOT: H9 PHOX2B:GFP muhabir hattı Oh ve ark.19tarafından sağlanmıştır. Bu yazıda kullanılan bazı qPCR astarları OriGene Technologies'den, birkaç sekans ise Frith ve ark. 20,30'danelde edilebilir.30

1. Bulaşık kaplama, ortam hazırlama ve hPSC bakımı için kurulum

  1. Çanak kaplama
    1. Vitronectin (VTN) kaplama
      1. VTN şişelerini 37 °C'lik bir su banyosuna tamamen eriyene kadar yerleştirin ve iyice karıştırın.
      2. 100 mm Petri kabı için 7 mL 1x fosfat tamponlu salini (PBS) ile 0,5 mg/mL VTN karıştırın, kabın vtn çözeltis....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokolde, hPSC'lerden symN'lerin nasıl üretilenlere ilişkin talimatlar veriyoruz. Burada gösterilen kültür koşulları daha önce yayınlanmış bir protokol23,24 (Şekil 1A)ile besleyicisiz ve kimyasal olarak tanımlanmış koşullara(Şekil 1B)iyileştirilmiştir. İki seçenek sağlanır, biri 20 gün içinde symN'lerin yapıldığı, diğeri ise Daha sonra symN'lere ayrıştırılabilen daha fazla hücre oluşturmak için 2 ha.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Geçenlerde iki değerlendirme yayınladı, bir hastalık modelleme için hPSC kaynaklı symNs kullanımını tartışırken31 yanı sıra mevcut farklılaşma protokolleri derinlemesine bir karşılaştırma22. Bu nedenle, burada ilgili araştırmacı symNs yapmada başarılı yardımcı olmak için mevcut protokol sorun giderme üzerinde duruluyor. Tüm farklılaşma sürecinde, sağlıklı farklılaşmış hücrelerin yanı sıra tutarlı veri elde etmek için, her aşamada kontaminasyon dikkatle kontrol edilmelidir. .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Heidi Ulrichs'e makalenin eleştirel okuması ve düzenlenmesi için teşekkür ederiz.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
100 mm hücre kültürü kaplarıFalcon353003
15 mL konik doku kültürü tüpleriVWR/Corning89039-664
24 oyuklu doku kültürü plakalarıFalcon353047
24 kuyulu ultra düşük bağlantılı plakalarCorning07 200 601 ve 07 200 602
%5 CO2/%20 O2 doku kültürü inkübatörüThermo Fisher/Life TeknolojilerHeracell VIOS 160i
50 ml konik doku kültürü tüpleriVWR/Corning89039-656
6 oyuklu doku kültürü plakalarıCostar3516
AccutaseInnovation Cell TechnologiesAT104500Hücre ayrışma solüsyonu
Anti-AP2a antikoruAbcamab108311Ev sahibi: Tavşan; 1:400 seyreltme
Anti-Ascl1 antikoruBD Pharmingen556604Konakçı: Fare IgG1; 1:200 seyreltme
Anti-CD49D antikoruBioLegend304313Ev sahibi: Fare IgG1; 5 ve mu; 100 &mu'da l/milyon hücre; l hacim
Anti-CD49D antikoru (izotip)BioLegend400125Ana bilgisayar: Fare IgG1; 5 & mu; 100 &mu'da l/milyon hücre; l hacim
DAPI boyaSigmaD95421:1000 seyreltme
Anti-DBH antikoruImmunostar22806Ev sahibi: Tavşan; 1:500 seyreltme
Anti-GFP antikoruAbcamab13970Ev sahibi: Tavuk; 1:1000 seyreltme
Anti-HOXC9 antikoruAbcamab50839Ev sahibi: Fare; 1:100 seyreltme
Anti-NET1 antikoruMabNET17-1Ev sahibi: Fare; 1:1000 seyreltme
Anti-PRPH antikoruSanta Cruz BiyoteknolojiSC-377093/H0112Ana bilgisayar: Fare IgG2a; 1:200 seyreltme
Anti-SOX10 antikoruSanta Cruz Biyoteknolojisc-365692Ana bilgisayar: Fare IgG1; 1:100 seyreltme
Anti-TH antikoruPel-FreezP40101- 150Ev sahibi: Tavşan; 1:500 seyreltme
Askorbik asitSigmaA8960-5GStok konsantrasyonu: 100 mM
B27 takviyesiThermo Fisher/Life Technologies12587-010Stok konsantrasyonu: 50x
BDNFR& D Systems248-BDStok konsantrasyonu: 10 μ g/mL
BMP4Ar-Ge D Systems314-BPStok konsantrasyonu: 6 mM
Hücre sayacıThermo Fisher/Life TechnologiesCountess II
Hücre sayma odası slaytlarıInvitrogenC10312
SantrifüjEppendorf57021& 5424R
CHIR99021Ar-Ge D Systems4423Stok konsantrasyonu: 6 mM
Cryo-flakonThermo Fisher/Yaşam Teknolojileri375353
dbcAMPSigmaD0627Stok konsantrasyonu: 100 mM
DMEMThermo Fisher/Yaşam Teknolojileri10829-018Stok konsantrasyonu: 1x
DMEM/F12Thermo Fisher/Yaşam Teknolojileri11330-057Stok konsantrasyonu: 1x
DMSOThermo Fisher/Yaşam TeknolojileriBP231-100
E6 ortagibcoA15165-01
E8 ortagibcoA15169-01Stok konsantrasyonu: 1x
E8 takviyesigibcoA15171-01Stok konsantrasyonu: 50x
EDTASigmaED2SSStok konsantrasyonu: 0,5 M
Elektrofizyoloji plakaları (AXION sitoview MEA96)Axion BioSystemsM768-tMEA-96W
FACS makinesiBeckman CoulterCytoFLEX (FACS için)
FACS makinesiBeckman CoulterMoFlo Astrios EQ (sıralama için)
FACS tüpleri (mavi filtre kapağı)Falcon352235
FACS tüpleri (beyaz kapak)Falcon352063
Fetal sığır serumu (FBS)Atlanta BiologicalsS11150
GDNFPeproTech450Stok konsantrasyonu: 10 μ g/mL
GeltrexInvitrogenA1413202Bazal membran matrisi; Stok konsantrasyonu: 100x
hPSC Thomsonve diğerleri, (1998)WA09
hPSC'lerOh ve ark. (2016)H9-PHOX2B::eGFP
İnsan fibronektini (FN)VWR/Corning47743-654Stok konsantrasyonu: 1 mg/mL
L-glutaminThermo Fisher/Gibco25030-081Stok konsantrasyonu: 200 mM
LN tankıÖzel Biyojenik SistemlerV-1500AB
MEA okuyucuAxion BioSystemsMaestro Pro
Fare laminin I (LM)R & D Systems3400-010-01Stok konsantrasyonu: 1 mg/mL
N2 takviyesiThermo Fisher/Life Technologies17502-048Stok konsantrasyonu: 100x
Neurobazal mediumgibco21103-049Stok konsantrasyonu: 1x
NGFPeproTech450-01Stok konsantrasyonu: 25 μ g/mL
Fosfat tamponlu salin (PBS)Gibco14190-136Stok konsantrasyonu: 1x
Poli-L-ornitin hidrobromür (PO)SigmaP3655Stok konsantrasyonu: 15 mg/mL
Primocin (antibiyotikler)InvivoGenANTPM1Stok konsantrasyonu: 50 mg/mL
qPCR makinesiBio-Rad LaboratoriesC1000 Touch
qPCR plakalarıBio-Rad LaboratuvarlarıHSP9601
rekombinant FGF2R& D Sistemleri233-FB/CFStok konsantrasyonu: 10 μ g/mL
Retinoik asitSigmaR2625Stok konsantrasyonu: 1 mM
SB431542Tocris/R& D Systems1614Stok konsantrasyonu: 10 mM
Tripan mavisiCorningMT-25-900-CI
Vitronectin (VTN)Thermo Fisher/Life TechnologiesA14700Stok konsantrasyonu: 0,5 mg/mL
Su banyosuVWR/Corning706308
Y27632R& D Systems1254Stok konsantrasyonu: 10 mM

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Norcliffe-Kaufmann, L., Slaugenhaupt, S. A., Kaufmann, H. Familial dysautonomia: History, genotype, phenotype and translational research. Progress in Neurobiology. 152, 131-148 (2017).
  2. Stone, J. B., DeAngelis, L. M. Cancer-treatment-ind....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Human Pluripotent Stem CellsSympathetic Neuron DifferentiationFeeder free CultureChemically Defined ConditionsNeural Crest MarkersElectrophysiological RecordingRetinoic Acid TreatmentSpheroid Culture ExpansionPostganglionic Sympathetic NeuronsAutonomic Nervous System

Related Articles