Bu protokol, hasta kaynaklı ksenogreftlerin (PDX) genişletilmiş in vitro kültürünü mümkün kılacak yöntemleri göstermektedir. Bir adım, 3D hidrojellerde çok hücreli küme kültürlerinin genel canlılığını, canlı olmayan tek hücrelerin doğrudan çıkarılması yoluyla artırır. İkincibir adım, pdx kültürü için en iyi uygulamaları perfüzyonlu mikroakışkan bir platformda gösterir.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Perfüzyonlu Mikroakışkan Platformda Hasta Kaynaklı Ksenogreftlerin Ex vivo 3D Hidrojel Kültürleri için Geliştirilmiş Canlılık
Bu makalede
Özet
Özet
Hasta kaynaklı ksenogreftler (PDX), rezeke edilen hasta tümör dokusu doğrudan immünazatlı farelere aşılandığında ortaya çıkan, biyolojik olarak stabil kalır, böylece moleküler, genetik ve histolojik özelliklerin yanı sıra orijinal tümörün heterojenliği de korur. Ancak, bu modellerin uyuşturucu taraması da dahil olmak üzere çok sayıda deney icra etmek için kullanılması hem maliyet hem de zaman açısından engelleyicidir. Üç boyutlu (3D) kültür sistemleri yaygın olarak kanser hücrelerinin biyokimyasal etkileşimler, morfoloji ve mimari yoluyla biyolojik bütünlüklerini korudukları platformlar olarak görülür. Ekibimiz hyaluronik asit (HA) oluşan 3D matrisler kullanarak in vitro PDX hücreleri kültürleme geniş bir deneyime sahiptir. PDX'lerle ilişkili fare fibroblaststromal hücrelerini ayırmak için, stromal hücrelerin doku kültürü yle tedavi edilmiş plakaların yüzeyine yapıştığı, ayrıştırık PDX tümör hücrelerinin yüzdüğü ve çok hücreli kümelere kendi kendini bağdaştırdığı rotasyon kültürünü kullanıyoruz. Ayrıca supernatant yüzen tek, genellikle ölü hücreler, hangi 3D hücre kültürü için hidrojeller içine aşağı kapsülleme için canlı PDX kümeleri toplama bir sorun mevcut. Bu tek hücreleri canlı hücre kümelerinden ayırmak için yoğunluk adım gradyan santrifüj uyguladığız. Burada açıklanan protokol, daha fazla in vitro deney için kullanılacak hücre kümelerinin sağlıklı popülasyonundan canlı olmayan tek hücrelerin tükenmesine olanak sağlar. Çalışmalarımızda, kültür sırasında medya perfüzyonuna olanak sağlayan mikroakışkan plakalara 3Boyutlu kültürleri dahil ediyoruz. Arınmış ve saflaştırılmayan hücrelerin floresan görüntü tabanlı canlılık tahsini kullanılarak ortaya çıkan kültürleri değerlendirdikten sonra, elde edilen sonuçlar, bu ek ayırma adımının kültürlerimizden canlı olmayan hücrelerin sayısını önemli ölçüde azalttığını göstermektedir.
Giriş
Son on yılda, kanser araştırma alanı hasta kaynaklı ksenogreftler için yenilenen coşku göstermiştir (PDXs) kanser hücre yolu güven ve ilaç duyarlılık değerlendirmek için bir araç olarak1. En sık görülen PDX modelleri insan tümör hücrelerinin deri altı veya ortotopik implantasyonu ile kurulur-bir tümör parçası, ayrışmış tümör türevi hücrelerin bir küme, ya da izole dolaşan tümör hücrelerinin bir örnek (CtCs)—bir kemirgen konak içine. Tümör "almak" başarılı olursa, ksenogreft hücreleri çoğalır, vaskülarite, ve aksi takdirde bir tümör oluşturmak için konak doku ile etkileşim, hangi optimal boyutta hasat edilebilir, bölünmüş, ve diğer konakiçine ye....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Tümör dokusu hasta onayı ile ve onaylı Kurumsal İnceleme Kurulu (IRB) protokolüne göre elde edildi. Ksenogreftler kabul edilen Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) protokolüne göre implante edildi, büyüdü ve hasat edildi.
NOT: Tüm çalışmalar steriliteyi korumak için steril bir biyolojik güvenlik kabininde yapılmalıdır. Aksi belirtilmedikçe tüm adımlar oda sıcaklığında yapılmalıdır.
1. PDX işleme için malzemelerin hazırlanması
- Otoklav forceps ve neşter sapı veya jilet.
- Doku dissosiyasyonu ile aynı gün 4 °C'de veya oda sıcaklığında çözülme enzim çözeltisi.
NOT: 37 °C'de erime ta....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Programlanabilir bir perfüzyon rocker standart bir su jacked hücre kültürü kuluçka hazırlandı ve iki şeritli mikroakışkan plakalar yükleme için standart bir biyogüvenlik kabini(Şekil 1)hazırlanmıştır. Bir MDA-PCA-118b PDX tümörü in vivo olarak genişletildi, maksimum boyuta ulaştığında hasat edildi ve protokol bölüm 2'de açıklandığı gibi hücrelerin bulamaç süspansiyonu oluşturmak için ayrıştırıldı, yaklaşık olarak tek hücreli bir durumda(Şekil 2A). Bulamaç 6 kuyu.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Burada, yüksek iş yapımı, perfüzyonlu 3D kültür sisteminde uygulanabilir PDX kaynaklı tümör hücrelerinin işlenmesi ve kültürlenmesi için bir yöntem açıklıyoruz. Bu protokolpca PDX dokusu nu kullanırken, diğer epitel kaynaklı tümörler için de aynı derecede etkilidir. Tümör özellikleri, menşe dokuda (prostat, meme, vb.) bile bireysel PDX çizgileri arasında farklılık gösterir. Bazı PCa PDX hatları daha fibrotik ve diğerleri daha hücresel iken canlı hücreleri izole etmek zordur. Burada belirtilen tümör boyutu özellikle düşük.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Teşekkürler
Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri Ulusal Kanser Enstitüsü SBIR Faz I (HHSN26120700015C) ve P01CA098912 tarafından desteklenmiştir.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 1N, NaOH | herhangi bir uygun doku kültürü derecesi, | ||
| 60 mm, yuvarlak doku kültürü kapları | herhangi bir uygun | ||
| 6 oyuklu doku kültürü plakası | herhangi bir uygun | ||
| 70 ve mikro; m hücreli süzgeçler | Corning | 431751 | veya eşdeğeri |
| Santrifüj | Eppendorf | 5810R, 15/50 mL konik santrifüj tüpleri veya eşdeğeri için uygun rotor ve kovalara sahip | |
| Yoğunluk gradyanlı santrifüj çözeltisi | Millipore Sigma | P1644 | Percoll |
| Dimetilsülfoksit | herhangi bir uygun doku kültürü sınıfı | ||
| Ayrışma enzimi çözeltisi | Kök Hücre Teknolojileri | 07921 | ACCUMAX |
| DMEM-F12 | ThermoFisher Scientific | 11039021 | veya eşdeğeri |
| Forseps | herhangi bir uygun | ||
| HA hidrojel kiti | ESI BIO | GS311 | HyStem (Hyaluronik asit-SH ve PEGDA) |
| Hanks Dengeli Tuz Çözeltisi | Lonza | 10-527F | veya eşdeğeri |
| Isı ile inaktive edilmiş fetal sığır serumu | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| Hemositometre | Fisher Scientific | 02-671-51B Hausser BrightLine | veya eşdeğeri |
| Hoechst 33342 | ThermoFisher Scientific | H1398 | veya eşdeğeri |
| Görüntü işleme yazılımı | Oxford Instruments | Imaris 9.3 | veya eşdeğeri |
| CANLI/ÖLÜ Hücre Canlılığı/Sitotoksisite Kiti (Calcein-/ Etidyum Homodimer-1) | ThermoFisher Scientific | L3224 | veya eşdeğeri |
| Mikroakışkan kültür plakası | Mimetas | 9603-400-B | 2 şeritli OrganoPlate |
| Mikroskobu | Nikon | A1R | veya eşdeğeri |
| Çok kanallı pipet | Eppendorf | 3125000036 | veya eşdeğeri |
| PDX türevi tümör dokusu | insan dokusu için IRB onayı ve hayvan konakçısı için IACUC onayı kapsamında alınmıştır | ||
| Penisilin-streptomisin | ThermoFisher Scientific | 15140-122 | veya eşdeğeri |
| Perfüzyon rocker | Mimetas | OrganoPlate Perfusion Rocker Mini | |
| pH şeritleri (pH 5-9) | herhangi bir uygun | ||
| Fosfat tamponlu tuzlu su çözeltisi | Lonza | 17-516F | veya eşdeğeri |
| Tıraş bıçakları | herhangi bir uygun | ||
| Döner xy-çalkalayıcı | VWR | Gelişmiş 3500 Orbital Çalkalayıcı | veya eşdeğeri |
| Neşter kolu | herhangi bir uygun | ||
| Tek kanallı tekrarlayan pipet | Eppendorf | 22260201 | |
| Steril, 15 mL konik santrifüj tüpleri | herhangi bir uygun | ||
| Steril, 50 mL Konik santrifüj tüpleri | herhangi bir uygun |
Kaynaklar
- Jung, J., Seol, H. S., Chang, S. The Generation and Application of Patient-Derived Xenograft Model for Cancer Research. Cancer Research and Treatment: Official Journal of Korean Cancer Association. 50 (1), 1-10 (2018).
- Malaney, P., Nicosia, S. V., Dave, V.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
