Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Bacillus anthracis ve Diğer Kapsüllenmiş Patojenlere Karşı Aşı Geliştirmede Fonksiyonel Antikorları Değerlendirmek için Opsono-Adherence Tahlili

3.1K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/60873

⸱

19 Mayıs 2020

 ,  ,  , 
1Bacteriology Division, United States Army Medical Research Institute of Infectious Diseases, 2Headquarters Division, United States Army Medical Research Institute of Infectious Diseases, 3Bioqual

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Opsono-bağlılık testi, antikorların aşı geliştirmedeki opsonik fonksiyonlarını değerlendirmek için opsono-fagositik öldürme testine alternatif bir yöntemdir.

Özet

Opsono-yapışma tahlili, bakteriyel patojenlerin profesyonel fagositlere bağlanmasını numaralayan işlevsel bir testtir. Fagositoz ve öldürme için bağlılık gerekli olduğundan, tahlil opsono-fagositik öldürme testlerine alternatif bir yöntemdir. Opsono-yapışma testinin bir avantajı, birden fazla deneyde standardizasyona izin veren inaktive patojenleri ve memeli hücre hatlarını kullanma seçeneğidir. Testte inaktive bir patojenin kullanılması, biyogüvenlik seviyesi 3 enfeksiyöz ajanlar ve diğer virülan patojenlerle çalışmayı da kolaylaştırır. Çalışmamızda, opsono-yapışmış test, şarbon kapsülü bazlı bir aşı ile aşılanmış hayvanların serasından, sabit Bacillus anthracis'in fare makrofaj hücresi hattı RAW 264.7'ye yapışmasını teşvik etmek için antikorların fonksiyonel yeteneğini değerlendirmek için kullanılmıştır. Makrofajlara bağlı basil görüntülerini yakalamak için otomatik floresan mikroskopisi kullanıldı. Serumda anti-kapsül antikorlarının varlığı ile artan yapışlık ilişkiliydi. Yüksek serum anti-kapsül antikor konsantrasyonları sergileyen insan olmayan primatlar şarbon zorluğundan korundu. Bu nedenle, opsono-yapışıklık testi, seradaki antijen spesifik antikorların biyolojik işlevlerini aydınlatmak, aşı adaylarının ve diğer terapötiklerin etkinliğini değerlendirmek ve bağışıklığın olası bir korelasyon olarak hizmet etmek için kullanılabilir.

Giriş

Bir patojenin tanınması, yapışması, içselleştirilmesi ve bozulması fagositozun ayrılmaz bir parçasıdır 1 , ilk olarakIlyaMetchnikoff tarafından 1883'te tanımlanan konakçı doğuştan gelen immün yanıtta belirgin bir yol2,3. Fagositik lökositler ve bağışıklık sisteminin diğer hücreleri, hedef seçimlerinde son derece ayrımcıdır; patojen ilişkili moleküler desenler aracılığıyla "enfeksiyöz olmayan benlik" ile "enfeksiyöz olmayan benlik" arasında, örüntü tanıma reseptörleri (PRR) repertuarları (PRR)4,5ile ayırt edebiliyorlar. Bir patojenin konak tanıması, tamamlayıcı ve antikorlar gibi konak opsoninlerin bağlanmasıyla da ortaya çıkabilir6. Opsonizasyon adı verilen bu işlem, patojeni bu moleküllerle kaplar, fagositik hücreler üzerindeki opsonik reseptörlere (örneğin, kompleman ve Fc reseptörleri) bağlanması üzerine içselleştirmeyi artırır6. Bir patojenin bir fagositlere yapışması için, birden fazla reseptörün konyak ligandları ile kolektif olarak bağlanması gereklidir. Ancak o zaman içselleştirmeyi başlatmak için ana hücre içinde sinyal basamaklarını yapıştırma tetikleyicisi ve sürdürebilir6.

Patojenlerin temizlenmesinde ve enfeksiyonun önlenmesinde fagositozun önemi nedeniyle, hücre dışı patojenler hayatta kalmalarını uzatmak için bu süreci altüst etmenin birçok yolunu geliştirmiştir. Önemli bir strateji, yükü nedeniyle fagositik olmayan, zayıf immünojenik olan ve bakteriyel zarf üzerindeki molekülleri PRR6,7'denkoruyan bir anionik polimerik (örneğin, polisakkarit veya poliamino asit) kapsülünün üretimidir. Cryptococcus neoformans ve Streptococcus pneumoniae gibi patojenler sakkarit polimerlerden oluşan kapsüllere sahipken, Staphylococcus epidermidis ve bazı Bacillus türleri poli-ɣ glutamik asit (PGGA)7,8üretir. Yine de diğer patojenler bulaşıcı olmayan benliğe benzeyen kapsüller üretir. Örneğin, Streptococcus pyogenes ve B. cereus'un patojenik bir suşu, sadece fagositik olmayan, aynı zamanda bağışıklık sistemi tarafından yabancı olarak tanınmayabilecek bir hyaluronik asit kapsülüne sahiptir9,10.

Kapsülün taşıyıcı proteinlere konjugasyonu, onları zayıf, T-bağımsız antijenlerden, yüksek serum anti-kapsül antikor titrelerine neden olabilecek yüksek immünojenik T bağımlı antijenlere dönüştürür11,12. Bu strateji S. pneumoniae, Haemophilus influenzaeve Neisseria meningitides11'ekarşı lisanslı aşılar için kullanılır. Anti-kapsül antikorların opsonik aktiviteleri genellikle opsono-fagositik öldürme tahlilleri (OPKA)13 , 14,15,16ile değerlendirilmiştir. Bu tahliller fonksiyonel antikorların fagositozu tetikleyip tetikleyemeyeceği ve14. Bununla birlikte, OPKA'nın B. anthracis17de dahil olmak üzere Tier 1 Biyolojik Selani Ajanlar ve Toksinler (BSAT) gibi enfeksiyöz patojenlerle kullanımı tehlikelidir ve güvenlik riskleri sunar; bu tahliller, seçilmiş bir ajanın kapsamlı bir şekilde ele alınmasını gerektirir. Belirli ajan işleme sadece sınırlı biyogüvenlik seviye 3 (BSL-3) laboratuvarlarında yapılabilir; bu alanlarda çalışmak, uyulması gereken çok sayıda güvenlik ve emniyet önlemi nedeniyle uzun süreli çalışma prosedürleri talep eder. BSL-3 laboratuvarları da tipik olarak mikroskoplar ve sitometreler gibi OPKA çalışmaları için kullanılan özel ekipmanlarla donatılmamıştır. Böylece, inaktive bakteri kullanımına dayalı alternatif bir test geliştirdik18,19. Buna, içselleştirme ve öldürme tahlil çıktılarına bağlı olmayan bir opsono-bağlılık tahlil (OAA) olarak adlandırıyoruz; bunun yerine, opsonize inaktive patojenlerin yapışmışlığı fagositoz indeksi olarak kullanılır. Mekanistik olarak, OAA uygun bir alternatiftir, çünkü bağlılık bir priori meydana gelir ve içselleştirme ve hücre içi öldürme ile yakından iç içedir. Biyogüvenlik açısından bakıldığında, OAA enfeksiyöz bir ajanın minimum şekilde işlenmesini gerektirdiğinden, deneysel olarak OPKA'dan daha kısa süreli olduğundan ve inaktive patojen stoğu üretildikten ve aktarıldıktan sonra BSL-2 laboratuvarlarında gerçekleştirilebildiği için tercih edilir.

Neisseria meningitidlerinindış zar protein kompleksine (OMPC) konjuge edilen bir kapsül konjuge ile aşılanmış insan dışı primatların (NHP'ler) serasında bulunan anti-kapsül antikorlarının opsonik işlevini incelemek için OAA'nın kullanımını gösteriyoruz ]20. Serum opsonize basili, raw 264.7 adlı bir fare makrofaj hücre hattı ile inkübe edildi. Fiksasyondan sonra hücre monolayer ve yapışan basil floresan mikroskopi ile görüntülenmiştir. Bakteriyel yapışma, kapsül konjuge ile aşılanan NHP'lerden serum ile inkübe edildiğinde kontrol serumu20'yekıyasla artmıştır. Yapışlık şarbon mücadelesinin hayatta kalması ileilişkilidir 20,21. Bu nedenle, OAA kullanımı anti-kapsül antikorlarının işlevini karakterize etti ve aşı adayımızın testini büyük ölçüde kolaylaştırdı.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Hayvan Refahı Yasası, Halk Sağlığı Hizmeti politikası ve hayvanlarla ilgili diğer federal tüzük ve yönetmeliklere ve hayvanlarla ilgili deneylere uygun olarak, burada açıklanan araştırma Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi onaylı bir protokol altında gerçekleştirildi. Bu araştırmanın yapıldığı tesis, Uluslararası Laboratuvar Hayvan Bakımı Değerlendirme ve Akreditasyon Derneği tarafından akredite edilmiştir ve Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu' nda belirtilen ilkelere bağlıdır, Ulusal Araştırma Konseyi, 201124.

1. Hücre hattının kültürü ve bakımı, RAW 264.7

NOT: Aşağıdaki işlemler aseptik tekniklerle yapılmalıdır.

  1. Fetal sığır serumu (FBS) 56 °C su banyosunda 30 dakika boyunca ısıtarak komplemanı devre dışı bırakın.
    NOT: 30 dakikalık inaktivasyon süresi FBS 56 °C'ye ulaştığında başlar. Sıcaklığı izlemek için, aynı su banyosunda bir kabın içinde benzer miktarda su ısıtın. Su 56 °C'ye ulaştığında, FBS için 30 dakikalık geri sayıma başlayın. Alternatif olarak, ısı inaktive edilmiş FBS de ticari olarak mevcuttur.
  2. %90 DMEM'i yüksek glikoz ve %10 ısı inaktive FBS (v/v) ile birleştirerek RAW 264.7 hücreleri için ortam hazırlayın. 6 mM'lik son konsantrasyona L-glutamin ekleyin.
    NOT: Yüksek glikozlu DMEM, 4 mM L-glutamin ile formüle edilmiştir. L-glutamin'in 6 mM'ye takviyesi tutarlı hücre büyümesini teşvik eder. Kontaminasyonu önlemek için 100 U/mL penisilin ve 100 μg/mL streptomisilin eklenebilir. Başka bir yaygın murine hücre hattı olan J774A.1 de kullanılabilir ve benzer koşullar altında yetiştirilir.
  3. Donmuş bir hücre şişesi 37 °C su banyosunda çözün ve erir erimez banyodan çıkarın. Konik bir tüpte 5 mL komple ortama aseptik olarak içerik ekleyin. Konik tüpü iki kez ters çevirin ve pelet hücrelerine 5 dakika boyunca 300 x g'da döndürün.
  4. Donma maddesini çıkarmak için vakuma bağlı steril bir Pasteur pipet kullanarak ortamı aspire edin. Hücre peletini 5 mL taze ortamda yeniden ıslatır.
  5. Süspansiyonu tedavi edilen bir doku kültürüne aktarın şişe veya tabak. Şişenin altını tamamen kaplayacak kadar ortam ekleyin ve hücreleri eşit şekilde dağıtmak için döndürün. "1" ile başlayan geçiş numarasını belirtin.
  6. %5 CO2 ve nem varlığında 37 °C'de hücreleri %95 ila %100 izdiah edene kadar kuluçkaya yatırın. Kuluçkanın ikinci gününden başlayarak mikroskop altında günlük hücreleri kontrol edin. Hücrelerin >%100 izdiah etmesine izin vermeyin, çünkü bu hücrelerin kalkmasına ve ölmesine neden olur.
    NOT: Konfüçyüse ulaşmak için gereken süre, kaç canlı hücrenin kaplandığına ve şişenin büyüme alanına bağlıdır. Bu nedenle, hücreleri günlük olarak kontrol etmek ihtiyatlıdır.
  7. Hücre stokunu taze ortamda kazıyarak ve seyrelterek alt kültür hücreleri, kazımalar arasında en az iki gün büyüme sağlar. Her alt kültürde geçiş sayısını 1 artırın.
    NOT: Ertesi gün geçmek ve hemen kazımak, zamanla genel hücre yapışma kaybının daha hızlı kaybolmasına neden olacaktır. RAW 264.7 hücreleri sadece yaklaşık geçiş 15'e kadar kullanılmalıdır.
  8. OAA test için RAW 264.7 hücrelerini kaplamak için, taze ortamla değiştirin ve hücreleri şişeden hafifçe kazımak için bir hücre kazıyıcı kullanın. Daha kolay hücre sayımı için hücre kümelerini parçalamak için pipet yukarı ve aşağı.
    NOT: RAW 264.7'yi alt kültüre etmek için geleneksel yöntem kazıma yöntemidir. Deneyimlerimize göre, tripsin kullanımı RAW 264.7 hücrelerinin zamanla kazımadan daha hızlı yapışmasını kaybetmesine neden olur.
  9. Hücreleri saymak için, eşit hacimli hücreleri seyreltin ve mavi çözeltiyi deneyin. Hemositometreye 10 μL yükleyin. 10x objektif lensli ters bileşik mikroskop kullanarak boyayı dışlayan canlı hücrelerin sayısını gözlemleyin ve sayın.
  10. Plaka 1.4 x10 96 kuyuda kuyu başına 4 uygulanabilir hücre 0.15 μm kalınlığında cam düz alt plaka (Plaka #1). Hücrelerin 3 gün boyunca büyümesine izin verin. OAA gerçekleştirmeden bir gün önce harcanan ortamı değiştirin.
    NOT: 3 günlük kuluçkadan sonra hücre sayısı yaklaşık 5 x 104/well olmalıdır.

2. Bakteri Kültürü ve Hazırlıkları

NOT: Bu protokolde kullanılan bakteri türleri kapsüllenmiş bir virülan suşudur, B. anthracis Ames. Bu türle yapılan tüm manipülasyonlar uygun biyogüvenlik ve güvenlik izinleri gerektirir ve bir BSL-3 laboratuvarında bulunan Sınıf II veya Sınıf III biyolojik güvenlik kabininde yapılmalıdır. BSL-3 çalışmaları ve bakterileri işlerken kişisel koruyucu ekipmanların kullanımı için kurumsal çalışma prosedürlerini izleyin.

  1. 37 g BHI tozunu 1 L suda eriterek ve 15 dakika boyunca 121 °C'de otoklavlayarak Beyin Kalbi infüzyonu (BHI) suyu hazırlayın. Et suyunu ortam sıcaklığında saklayın.
  2. Suda% 8 sodyum bikarbonat çözeltisi hazırlayın ve 0,20 μm filtre şırınna kullanarak sterilize edin. Çözeltiyi 4 °C'de saklayın ve 1 gün içinde kullanın.
  3. NBY agar plakalarını hazırlamak için 8 g Besin Suyu, 3 g maya özü ve 15 g agar'ı 1 L suda karıştırın. 15 dakika boyunca 121 °C'de otoklav. Petri kaplarına dökün ve katılaşmaya bırakın. Tabakları 4 °C'de saklayın.
    NOT: NBY agar plakaları sodyum bikarbonatlı veya sodyumsuz yapılabilir. Et suyu ve agar plakalarına sodyum bikarbonat eklenmesi, kapsüllenmiş basillerden oluşan mukoz kolonilerin büyümesini teşvik eder. Hem sıvı hem de katı ortamda sodyum bikarbonatın son konsantrasyonu% 0.8'dir.
  4. %50 otoklavlı BHI suyu, %40 FBS ve %10 sodyum bikarbonat çözeltisini (v/v) karıştırarak B. anthracis için kültür suyu hazırlayın.
    NOT: Bu et suyu, kapsüllenmiş basilin kısa zincirlerini üretmek için formüle edilmiştir.
  5. Et suyunda kültlemeden bir gün önce bir spor stoğundan bir NBY agar tabağında izolasyon için çizgi çizerek bir B. anthracis ana tabağı hazırlayın. 37 °C'de kuluçkaya yaslanın.
  6. B. anthracis'inbirkaç kolonisi ile havalandırmalı 250 mL'lik bir şişede 30 mL kültür suyu aşıla.
    NOT: Burada belirtildiği gibi, et suyunun belirli bir hacimden yüzeye oranı, maksimum kapsüllenmiş basil üretmek için gereklidir.
  7. Et suyu kültürünü 125 rpm, 37 °C'de% 20 CO2 ve nem ile 18-24 saat sallayın.
    NOT: 37 °C'den büyük sıcaklıklarda büyüyen B. anthracis kapsül üretimini engelleyebilir.
  8. Yeterli kapsüllenmeyi ve basilin sabitlemeden önce kısa zincirlerde (1-5 basil/zincir) olmasını sağlamak için Hindistan mürekkeci ile negatif boyama kullanın (bkz. bölüm 3).
  9. Koloni şekillendirme birimlerini (CFU) belirlemek için, 100 μL kültürü seri olarak seyreltin 1:10 Fosfat Tamponlu Salin (PBS) çözeltisinde ve koyun kanı agar plakalarında plaka kültürü seyreltmelerinde. 37 °C'de 12-18 saat kuluçkaya yaslanın. CFO'ları sayın ve kültürün mL'si başına bakteri sayısını belirleyin.
    NOT: Sayım, bakteriler düzeltildikten sonra mikroskop altında bir hemositometre kullanılarak da yapılabilir. Ancak, basil düşük büyütme altında görülmesi zor olduğu için bu önerilmez.
  10. Basili düzeltmek için % 4 PF'lik son konsantrasyonda tüm bakteri kültürü hacmine% 16 paraformaldehit (PF) ekleyin. 7 gün boyunca ortam sıcaklığında bir çalkalayıcı üzerinde yavaşça çalkalayın.
    NOT: %4 PF'de yedi günlük inkübasyon, vejetatif basilin sabitlenmesi için USAMRIID kurumsal standart işletim prosedürüne dayanmaktadır.
  11. Fiksatifi çıkarmak ve sterilite test etmek için, 45 dakika boyunca 3000 x g ≥ santrifüjleme ile 50 mL konik tüpte 4 mL (%10 hacim) sabit bakteriyel süspansiyonu üç kez yıkayın ve PBS ile 30 mL / yıkama kullanarak yıkayın. Kalan numuneyi %4 PF'de 4 °C'de saklayın.
    NOT: Peletlemeden sonra, bakteriyel pelet kapsülün varlığı nedeniyle kabarıktır. Yıkama sırasında peletin rahatsız olmamasına dikkat edin. Uygulanabilirlik testine müdahale etmemesi için tüm fiksatifleri kaldırmak gerekir. Gerekirse, yıkama sayısını artırın.
  12. Canlılık testi için, 4 mL yıkanmış süspansiyon (et suyu hacminin% 10'u ≤) ile 40 mL bakteri üreme ortamını (örneğin BHI suyu) aşılayıp 7 gün boyunca 37 °C'de kuluçkaya yatırın. Bulanıklığı ölçmek için 7 gün önce ve sonra 600 nm optik yoğunluğu kontrol edin.
  13. Et suyu kültüründe 7 günlük kuluçkadan sonra, bir agar tabağına 100 μL ≥ et suyu plakası ve 7 gün daha kuluçkaya yatırın. Bulanıklıkta bir artış görülmezse ve plakalarda büyüme görülmezse, orijinal kültür steril olarak kabul edilir ve bir BSL-2 laboratuvarına aktarılabilir.
    NOT: Federal Select Agent Program22, B. anthracis'in sadece numunenin tam sterilitesini gösterdikten sonra BSL-3 laboratuvarlarından transfer edilebilmesini zorunlu kılar. Inaktive B. anthracis için canlılık testi, numunenin% 10'unu 7 gün boyunca et suyunda kültleme ve ardından 7 gün daha katı ortamda kültlemeden oluşur22,23. Sterilite belirlendikten sonra transfer onayı almak için kurumsal yönergeleri izleyin.

3. Kapsülleme ve basil zincirlerini gözlemlemek için negatif boyama ve hafif mikroskopi

  1. 5 μL bakteri süspansiyonu 2 μL Hindistan mürekkesi ile mikroskop kaydırağı üzerinde karıştırın. Kabarcıklar oluşturmadan süspansiyonun üzerine 1 veya 1,5 μm kalınlığında bir kapak camı yerleştirin.
    NOT: Kapak camını kaydırağa kapatmak için oje kullanılabilir.
  2. Hafif bir mikroskopta 40x ila 100x yağ objektif lens kullanarak bakteri süspansiyonu gözlemleyin. Her bakteriyi çevreleyen bir boşluk bölgesini (kapsül Hindistan mürekkesini hariç tutar) gözlemleyerek ve basil zincirlerinin kısa olduğundan emin olun.

4. Bakterilerin FITC etiketlemesi

  1. Floresan izotiyosiyanatını (FITC) dimetil sülfitte 2 mg/mL konsantrasyonda çözün.
  2. İnaktive bakteri stoğunun hacmini ölçün.
  3. Sabitleyiciyi çıkarmak için stoku PBS'de 3x yıkayın.
  4. FITC çözeltisini 75 μg/mL'lik son konsantrasyonda ekleyin. Karışımı 4 °C'de 18-24 saat boyunca yavaşça çalkalayın.
  5. Üç kez ≥3000 x g, 45 dk'da peletleme yaparak ve fazla FITC'yi çıkarmak için 30 mL PBS / yıkama kullanarak bakterileri yıkayın. Kabarık peletin yıkama sırasında rahatsız olmadığından emin olun. Basili PBS'de aynı başlangıç hacminde yeniden başlatın.
  6. Aliquot ve kullanıma kadar basili -20 °C'de mikrotüplerde saklayın. Basil kapsülü kaybedebileceği için basili birden çok kez dondurmayın / çözmeyin.

5. Bakteriyel Opsonizasyon

  1. Isı, bir ısı bloğunda 30 dakika boyunca 56 °C'de küçük bir test sera hacmini (NHP'lerden) devre dışı bırakın.
  2. FITC etiketli bakterileri PBS 2x ile 3-5 dakika boyunca 15000 x g'da peletleme yaparak çözün ve yıkayın. PBS'de aynı başlangıç biriminde yeniden başlatın.
  3. 96 kuyu yuvarlak alt plakada (plaka #2), test serasını hücre ortamında seri olarak seyreltin. Başka bir 96 kuyu yuvarlak alt plakada (plaka #3), her kuyuya 10 μL seyreltilmiş test serası ekleyin.
    NOT: Her plakada negatif kontroller olarak seyreltilmiş test sera yerine PBS ve normal maymun serası dahil edilmiştir. Ayrıca, farklı günlerde yapılan tüm tahlilleri normalleştirmek için standart bir eğri oluşturmak için pozitif kontrol olarak bir test serumu seçtik. Pozitif kontrol testi serumu bol olduğu için keyfi olarak seçildi.
  4. #3 plakalamak için, 10 μL taze yeniden inşa edilmiş bebek tavşan tamamlayıcısı ekleyin.
    NOT: Yeniden inşa ettikten sonra, kalan bebek tavşan tamamlayıcısını atın; yeniden donma ve çözülme.
  5. #3 plakalamak için, 1:20'lik çok miktarda enfeksiyon için fitc etiketli basilin uygun hacmini ekleyin. Örneğin, 5 x 10 4hücre için 5 x10 4 x 20 basil içeren birimi ekleyin. Plakadaki her kuyuyu, uygun hücre ortamı hacmiyle toplam 105 μL'ye #3.
    NOT: Hücreleri içeren plaka #1, boşluk hacmi olarak kalan 5 μL ile 100 μL opsonize bakteri alır. Test serasının her seyreltmesini kopya olarak test ettik.
  6. Kuluçka plakası, basili opsonize etmek için nem ile% 5 CO2 varlığında 30 dakika boyunca 37 ° C'de #3.

6. Memeli hücrelerinin Yapışma Tahlil ve Floresan Etiketlemesi

  1. Kullanmadan önce tüm reaktifleri 37 °C'de sakla.
  2. Plakayı, yapışan hücreler içeren #1 37 °C'lik bir ısı bloğuna yerleştirin.
  3. Harcanan ortamı kuyulardan çıkarmak ve plaka #3 100 μL opsonize bakterilerle hızlı bir şekilde değiştirmek için çok kanallı bir pipettör kullanın. Pipetleme sırasında kuyularda kabarcık oluşmamasını sağlayın. Kuluçka plakası 37 °C'de % 5 CO2 ve yapışlık için 30 dakika nem ile #1.
  4. Bağlanmamış basili çıkarmak için her kuyuyu 37 °C ısı bloğunun üzerine 150 μL PBS ile 5x yıkayın.
    NOT: Hücrelerin yıkama sırasında yanlışlıkla dağılmaması için dikkatli olunmalıdır.
  5. %4 PF yapmak için PBS 1:4 ile %16 PF'yi seyreltin. Hücreleri PBS ile 2x yıkayın.
  6. 10 mL PBS'de 2 μL HCS (yüksek içerikli tarama) Turuncu Hücre Lekesi karıştırın. Sabit hücrelere bu boyama çözeltisinin 150 μL'sini ekleyin ve ortam sıcaklığında 30 dakika kuluçkaya yatın.
  7. PBS ile kuyuları 2x yıkayın.
  8. Mikroskopiye kadar 4 °C'de saklayın.

7. Mikroskopi

NOT: Genel olarak, yüksek verimli otomatik floresan mikroskobu OAA için görüntülemeyi kolaylaştıracaktır. Otomatik bir sistem mevcut değilse, yandaş basilin floresan görüntüleri manuel olarak alınabilir21. Bu çalışmada20, yapışan basil ve hücre monolayerleri özel ekipmanlarla Zeiss 700 lazer tarama mikroskopi sistemi kullanılarak görüntülenmiştir; Sistemimiz, otomatik bir aşama, Kesin Odak modülü, 40 x NA 0.6 hedefi, Axio Cam HRc kamera ve Zen 2012 (Blue Edition) yazılımı ile donatılmış Zeiss Axio Observer Z1 ters mikroskoplardan oluşuyordu. Elde edilen görüntüler, konfokal görüntüler değil, geniş alan görüntüleridir. Aşağıdaki protokol, çeşitli otomatik mikroskopi sistemleri için geçerli olan temel bir mikroskop kurulumu olarak tasarlanmıştır.

  1. Kuluçka plakası 30 dakika boyunca ortam sıcaklığında #1. Mikroskobu ve ilgili ekipmanı açın.
    NOT: Ortam sıcaklığında alışma, görüntüleme sırasında cam plakada yoğuşma oluşmasını önler. Ek olarak, sıcaklık kayması nedeniyle odaklanmayı önler.
  2. Plakayı sahne alanına yerleştirin ve parlak alan veya faz kontrastı kullanarak hücrelere odaklanın.
  3. Plaka ayarı olarak 96 kuyu formatını seçin. Kanal ayarlarını seçin.
    NOT: FITC'nin en yüksek uyarımı ve emisyon dalga boyu 495/519 nm'dir; HCS turuncu hücre lekesi 556 ve 572 nm'dir. Mikroskopta bulunan filtrelere bağlı olarak başka floroforlar da kullanılabilir.
  4. Döşeme modu ayarını seçin. Elde edilecek görüntü sayısını belirtin.
    NOT: Döşeme işlevi, örnek bir kuyuda birden fazla konumun yakalanmasına izin verir ve bir döşeme veya rastgele bir biçimde görüntü elde etmek için ayarlanabilir. Kuyu başına 10 rastgele alan görüntüledik.
  5. Alım modunu "siyah beyaz" veya "tek renkli" olarak değiştirin ve 2x2'≥ binning yapın.
    NOT: Binning'i 1x1'den 2x2 veya 4x4'e ayarlamak mikroskopi hızını artırır, ancak görüntünün daha düşük çözünürlüğüne de neden olur. OAA için, test hem makrofajları hem de yapışan bakterileri numaralandırırken bu ayarları kullanmak yeterlidir.
  6. Otomatik netleme veya odaklama modüllerini açın. Otomatik odaklama işlevinin ne sıklıkta gerçekleştirildiğini belirtin. Varsa Z yığını işlevini açın. Hücre monolayer ve yapışan basil kalınlığını yakalayacak Z yığınlarının sayısını belirtin.
    NOT: Seçilen Z yığınlarının sayısı mikroskopi süresini artıracak, ancak her Z yığınında doğru netlemeli bir görüntünün alınmasını sağlayacaktır.
  7. Görüntülerin kaydedilecek dosya klasörünü belirleyin. Otomatik görüntüleme programını çalıştırın.

8. Veri Toplama ve Analiz

  1. Görüntü başına yapışan basil ve memeli hücrelerinin sayısını sayın. Her bir bakteri zincirini bir bakteri olarak sayın.
  2. Uygun bir istatistik programında standart bir eğri oluşturmak için pozitif kontrol testi serumu ve titresinin basilini/hücrelerini çizin (örneğin, 1:10 seyreltme 10 titer ünitesidir).
  3. Doğrusal olmayan regresyon eğrisi montajını kullanarak pozitif kontrol testi serumunu analiz edin. Daha sonra karşılık gelen titreleri belirlemek için pozitif kontrol testi serumunun standart eğrisini kullanarak kalan örnekleri analiz edin.
    NOT: Titreleri belirlerken standart eğrinin ortasına yakın örnek seyreltmeleri seçmek genellikle en doğru olanıdır.
  4. Her aşı grubundan örneklerin geometrik ortalamasını hesaplayın. Log dönüştürülmüş titrelerin P değerlerini en az önemli fark ANOVA analizi ile hesaplayın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Bu bölümde, bir OAA deneyi sırasında toplanan temsili mikro grafikler ve OAA'nın antikorların biyolojik işlevini incelemek için kullanılabileceğini gösteren sonuçlar gösterilebilir. Burada, bir şarbon aşısı adayının etkinliğini değerlendirmek için test başarıyla kullanıldı. Basil üzerindeki kapsülleme durumunun, kapsüllemenin çok az veya hiç kapsüllenmemesi nedeniyle konak hücrelere yapışmalarına neden olduğunu ve yüksek bir arka plan ürettiğini doğrulamak önemlidir. Şekil 1, B. anthraci...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Kapsül bazlı aşıların çok sayıda bakteriyel patojene karşı etkili olduğu gösterilmiştir ve birçoğu insanlarda kullanım için lisanslıdır25,26,27. Bu aşılar kapsülü hedef alan antikorlar üreterek çalışır ve bu çalışmaların çoğu OPKA'yı13 , 14 , 16,28,29antikorlarının opsono-fagositik işlevleri...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların çıkar çatışması oluşturabilecek ticari veya başka bir ilişkisi yok.

Teşekkürler

Yazıda açıklanan prosedürleri J. Chua, D. Chabot ve A. Friedlander tasarladı. Deneyleri J. Chua ve T. Putmon-Taylor yaptı. D. Chabot veri analizi yaptı. Taslağı J. Chua yazdı.

Yazarlar Kyle J. Fitts'e mükemmel teknik yardım için teşekkür ediyor.

Çalışma, Savunma Tehdit Azaltma Ajansı hibe CBM tarafından desteklendi. VAXBT.03.10.RD.015, plan numarası 921175.

Görüşler, yorumlar, sonuçlar ve tavsiyeler yazarların görüşleridir ve mutlaka ABD Ordusu tarafından onaylanmamıştır. Bu yayının içeriği, Savunma Bakanlığı'nın görüşlerini veya politikalarını yansıtmak zorunda değildir ve ticari adlardan, ticari ürünlerden veya kuruluşlardan bahsedilmesi ABD Hükümeti tarafından onay anlamına gelmez.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
0.20 ve mikro; m şırınga filtresi (25mm, rejenere selüloz)Corning, Corning, NY431222
10 mL şırınga (Luer-Lok ucu)BD, Franklin Lakes, NJ302995
15&mikro; 96 kuyulu siyah plaka (görüntüleme için plaka #1)In Vitro Scientific, Sunnyvale, CAP96-1-N
%16 paraformaldehitElektron Mikroskobu Bilimi, Hatfield, PA15710
75 cm metrekare doku kültürü uygulanmış şişeCorning, Corning, NY430641
Agar (toz)Sigma-Aldrich, St. Louis, MOA1296
Bebek Tavşan TamamlayıcısıCedarlane Labs, Burlington, NCCL3441
Bacto Maya ÖzüBD, Sparks, MD288620
BBL Beyin Kalp İnfüzyonu (BHI)BD, Sparks, MD211059
Kan Agar (Koyun Kanı ile TSA) plakalarıRemel, Lenexa, KSR01198
Hücre sıyırıcıSarstedt, Newton, NC83.183
Costar 96 kuyulu hücre kültürü plakaları (seyreltmeler için plaka # 2 ve 3)Corning, Corning, NY3596
Kapak camıElektron Mikroskobu Bilimi, Hatfield, PA72200-10
Difco Besin SuyuBD, Sparks, MD234000
Dulbecco'nun Modifiye Eagle Ortamı (DMEM), yüksek glikozluGibco, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA11965-092, 4500 mg/L glikoz, 4 mM L-glutamin, Fenol Kırmızı
EVOS FL Otomatik Hücre Görüntüleme Sistemi (floresan mikroskobu)içerirLife Technologies, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MAAMAFD1000
Fetal Sığır SerumuHyclone, GE Sağlık Yaşam Bilimleri, Güney Logan, UTSH30071.03gama ışınlanmamış, ısıyla etkisiz hale getirilmemiş
Floresein izotiyosiyanatInvitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MAF143
HCS Hücre Maskesi Turuncu Hücre Lekesiİnvitrojen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MAH32713
hemositometre (Geliştirilmiş Neubauer)Hausser Scientific, Horsham, PA3900
Hindistan Mürekkep çözeltisiBD, Sparks, MD261194
L-glutamin (200 mM)Gibco, Thermo Fisher Scientific, Waltham MA25030081ek 2mM L-glutamin içeren ek ortam
Nikon Eclipse TE2000-U (ters bileşik mikroskop)Nikon Instruments, Melville, NYTE2000
PBS Kalsiyum veya Magnezyum içermezLonza, Walkersville, MD17-516F
Penisilin-Streptomisin Çözeltisi, 100xHyclone, GE Healthcare Yaşam Bilimleri, Güney Logan, UTSV30010
petri kapları (100 x 15 mm)Falcon, Corning, Durham, NCagar plakaları için
351029 RAW 264.7 makrofaj hücre hattı (Tib47)ATCC, Manassas, VAATCC TIB-71
SlaytlarVWR, Radnor, PA16004-422
Sodyum BikarbonatSigma-Aldrich, St. Louis, MOS5761
Tripan Mavisi Çözeltisi (% 0.4)Sigma-Aldrich, St. Louis, MOT8154
Zeiss 700 Lazer Tarama Mikroskobu (konfokal mikroskop)Carl Zeiss Mikrogörüntüleme, Thornwood, NY4109001865956000

Kaynaklar

  1. Walters, M. N., Papadimitriou, J. M. Phagocytosis: a review. CRC Critical Reviews in Toxicology. 5 (4), 377-421 (1978).
  2. Metschnikoff, E. Untersuchurgen uber die intracellulare Verdauung, bei wirbellosen Thieren. Arbeiten aus dem Zoologischen Instituten der Universität Wien. 5, 144(1883).
  3. Tauber, A. I. Metchnikoff and the phagocytosis theory. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 4 (11), 897-901 (2003).
  4. Janeway, C. A. The immune system evolved to discriminate infectious nonself from noninfectious self. Immunology Today. 13 (1), 11-16 (1992).
  5. Kumagai, Y., Akira, S. Identification and functions of pattern-recognition receptors. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 125 (5), 985-992 (2010).
  6. Flannagan, R. S., Jaumouille, V., Grinstein, S. The cell biology of phagocytosis. Annual Review of Pathology. 7, 61-98 (2012).
  7. Candela, T., Fouet, A. Poly-gamma-glutamate in bacteria. Molecular Microbiology. 60 (5), 1091-1098 (2006).
  8. Kocianova, S., et al. Key role of poly-gamma-DL-glutamic acid in immune evasion and virulence of Staphylococcus epidermidis. Journal of Clinical Investigation. 115 (3), 688-694 (2005).
  9. Rothbard, S. Protective effect of hyaluronidase and type-specific anti-M serum on experimental group A Streptococcus infection in mice. Journal of Experimental Medicine. 88 (3), 325-342 (1948).
  10. Oh, S. Y., Budzik, J. M., Garufi, G., Schneewind, O. Two capsular polysaccharides enable Bacillus cereus G9241 to cause anthrax-like disease. Molecular Microbiology. 80 (2), 455-470 (2011).
  11. Knuf, M., Kowalzik, F., Kieninger, D. Comparative effects of carrier proteins on vaccine-induced immune response. Vaccine. 29 (31), 4881-4890 (2011).
  12. Wang, T. T., Lucas, A. H. The capsule of Bacillus anthracis behaves as a thymus-independent type 2 antigen. Infection & Immunity. 72 (9), 5460-5463 (2004).
  13. Vogel, L., et al. Quantitative flow cytometric analysis of opsonophagocytosis and killing of nonencapsulated Haemophilus influenzae by human polymorphonuclear leukocytes. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 1 (4), 394-400 (1994).
  14. Salehi, S., Hohn, C. M., Penfound, T. A., Dale, J. B. Development of an Opsonophagocytic Killing Assay Using HL-60 Cells for Detection of Functional Antibodies against Streptococcus pyogenes. mSphere. 3 (6), 00617-00618 (2018).
  15. Wang, Y., et al. Novel Immunoprotective Proteins of Streptococcus pneumoniae Identified by Opsonophagocytosis Killing Screen. Infection & Immunity. 86 (9), (2018).
  16. Humphries, H. E., et al. Seroprevalence of Antibody-Mediated, Complement-Dependent Opsonophagocytic Activity against Neisseria meningitidis Serogroup B in England. Clinical and Vaccine Immunology. 22 (5), 503-509 (2015).
  17. List of Tier 1 BSAT. , Available from: www.selectagents.gov/ohp-app1.html (2017).
  18. Jansen, W. T., et al. Use of highly encapsulated Streptococcus pneumoniae strains in a flow-cytometric assay for assessment of the phagocytic capacity of serotype-specific antibodies. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 5 (5), 703-710 (1998).
  19. Wang, T. T., Fellows, P. F., Leighton, T. J., Lucas, A. H. Induction of opsonic antibodies to the gamma-D-glutamic acid capsule of Bacillus anthracis by immunization with a synthetic peptide-carrier protein conjugate. FEMS Immunology and Medical Microbiology. 40 (3), 231-237 (2004).
  20. Chabot, D. J., et al. Protection of rhesus macaques against inhalational anthrax with a Bacillus anthracis capsule conjugate vaccine. Vaccine. 34 (34), 4012-4016 (2016).
  21. Chabot, D. J., et al. Efficacy of a capsule conjugate vaccine against inhalational anthrax in rabbits and monkeys. Vaccine. 30 (5), 846-852 (2012).
  22. Revised FSAP Policy Statement: Inactivated Bacillus anthracis and Bacillus cereus Biovar anthracis. , Available from: www.selectagents.gov/policystatement_bacillus.html (2017).
  23. Chua, J., et al. Formaldehyde and Glutaraldehyde Inactivation of Bacterial Tier 1 Select Agents in Tissues. Emerging Infectious Diseases. 25 (5), 919-926 (2019).
  24. Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (Eighth Edition). , Available from: https://grants.nih.gov/grants/olaw/guide-for-the-care-and-use-of-laboratory-animals.pdf (2011).
  25. Durando, P., et al. Experience with pneumococcal polysaccharide conjugate vaccine (conjugated to CRM197 carrier protein) in children and adults. Clinical Microbiology and Infection. 19, Suppl 1 1-9 (2013).
  26. Adams, W. G., et al. Decline of childhood Haemophilus influenzae type b (Hib) disease in the Hib vaccine era. JAMA. 269 (2), 221-226 (1993).
  27. Balmer, P., Borrow, R., Miller, E. Impact of meningococcal C conjugate vaccine in the UK. Journal of Medical Microbiology. 51 (9), 717-722 (2002).
  28. Chen, M., et al. Induction of opsonophagocytic killing activity with pneumococcal conjugate vaccine in human immunodeficiency virus-infected Ugandan adults. Vaccine. 26 (38), 4962-4968 (2008).
  29. Paschall, A. V., Middleton, D. R., Avci, F. Y. Opsonophagocytic Killing Assay to Assess Immunological Responses Against Bacterial Pathogens. Journal of Visualized Experiments. (146), e59400(2019).
  30. Ezzell, J. W., Welkos, S. L. The capsule of Bacillus anthracis, a review. Journal of Applied Microbiology. 87 (2), 250(1999).
  31. Hanna, P. C., Acosta, D., Collier, R. J. On the role of macrophages in anthrax. Proceedings of the National Academies of Sciences of the United States of America. 90 (21), 10198-10201 (1993).
  32. Fleck, R. A., Romero-Steiner, S., Nahm, M. H. Use of HL-60 cell line to measure opsonic capacity of pneumococcal antibodies. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 12 (1), 19-27 (2005).
  33. Chua, J., Deretic, V. Mycobacterium tuberculosis reprograms waves of phosphatidylinositol 3-phosphate on phagosomal organelles. Journal of Biological Chemistry. 279 (35), 36982-36992 (2004).
  34. Chua, J., et al. pH Alkalinization by Chloroquine Suppresses Pathogenic Burkholderia Type 6 Secretion System 1 and Multinucleated Giant Cells. Infection & Immunity. 85 (1), (2017).
  35. Ober, R. J., Radu, C. G., Ghetie, V., Ward, E. S. Differences in promiscuity for antibody-FcRn interactions across species: implications for therapeutic antibodies. International Immunology. 13 (12), 1551-1559 (2001).
  36. Sorman, A., Zhang, L., Ding, Z., Heyman, B. How antibodies use complement to regulate antibody responses. Molecular Immunology. 61 (2), 79-88 (2014).
  37. Henckaerts, I., Durant, N., De Grave, D., Schuerman, L., Poolman, J. Validation of a routine opsonophagocytosis assay to predict invasive pneumococcal disease efficacy of conjugate vaccine in children. Vaccine. 25 (13), 2518-2527 (2007).
  38. Wolf, J. J. Special Considerations for the Nonclinical Safety Assessment of Vaccines. , Elsevier. 243-255 (2013).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

RAW 264 7 H creleriFloresan MikroskopiFITC EtiketlemeKompleman OpsonizasyonuOtomatik G r nt lemeEnkaps lasyon Do rulamasSterilite TestiA Etkinli i
Bacillus anthracis ve Diğer Kapsüllenmiş Patojenlere Karşı Aşı Geliştirmede Fonksiyonel Antikorları Değerlendirmek için Opsono-Adherence Tahlili
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.