Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Memeli Hücrelerinde Hücre İçi Protein Sensörlerinin Mühendisliği

2.8K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/60878

⸱

28 Nisan 2020

 ,  ,  , 
1Istituto Italiano di Tecnologia, 2Synthetic Biology Center, Department of Biological Engineering, Massachusetts Institute of Technology

Bu makalede

Özet

Burada, genetik olarak kodlanmış hücre içi protein sensör-aktüatör(ler)inin mühendisliği için bir protokol sunuyoruz. Cihaz, hücre içi antikorlar (intrakorlar) yoluyla hedef proteinleri spesifik olarak tespit eder ve gen transkripsiyonel çıkışını açarak yanıt verir. Genel mimariyi değiştirmeden istenen herhangi bir proteinin hızlı bir şekilde tespit edilmesini sağlayarak, intrakorları hızla değiştirmek için genel bir çerçeve oluşturulmuştur.

Özet

Proteinler, nörodejeneratif hastalıklar, enfeksiyonlar veya metabolik sendromlar gibi patolojik durumların biyobelirteçleri olarak işlev görebilir. Bu biyobelirteçleri algılamak ve bunlara yanıt vermek için hücrelerin mühendisliği, patolojilerin altında yatan moleküler mekanizmaların anlaşılmasına ve yeni hücre bazlı tedavilerin geliştirilmesine yardımcı olabilir. Hücre dışı proteinleri tespit eden birkaç sistem geliştirilmiş olsa da, farklı hücre içi proteinleri algılamak için kolayca yeniden tasarlanabilen modüler bir çerçeve eksikti.

Burada, hücre içi proteinleri algılayan ve belirli bir hücresel yanıtı aktive eden modüler bir genetik platformu uygulamak için bir protokol açıklıyoruz. Cihaz, ilgilenilen proteini yüksek özgüllükle algılamak için hücre içi antikorlar veya küçük peptitler üzerinde çalışır ve TEV proteaz (TEVp) tabanlı bir çalıştırma modülü aracılığıyla çıktı genlerinin transkripsiyonel aktivasyonunu tetikler. TEVp, kısa akraba peptitleri seçici olarak parçalayan viral bir proteazdır ve bölünme bölgesine yüksek ortogonalliği nedeniyle biyoteknoloji ve sentetik biyolojide yaygın olarak kullanılmaktadır. Spesifik olarak, sırasıyla Huntington hastalığı, hepatit C virüsü (HCV) ve insan immün yetmezlik virüsü (HIV) enfeksiyonlarını tespit etmek için mutasyona uğramış huntingtin, NS3 serin-proteaz, Tat ve Nef proteinleri dahil olmak üzere viral enfeksiyonların ve genetik hastalıkların protein-biyobelirteçlerini tanıyan ve bunlara yanıt veren cihazlar tasarladık. Daha da önemlisi, sistem, biyosensörler için floresan okumaları, bağışıklık tepkisi için antijen sunumunun uyarılması veya sağlıksız hücreleri ortadan kaldırmak için apoptozun başlatılması gibi istenen giriş-çıkış fonksiyonel sonucu için elle uyarlanabilir.

Giriş

Kontrol edilebilir tasarlanmış gen devreleri yoluyla hücresel yanıtların incelenmesi ve modülasyonları, sentetik biyolojide 1,2,3 kanser4, enfeksiyonlar5, metabolik hastalıklar 6 ve immünoloji7'de ilgili biyolojik veya tıbbi uygulamalara sahip ileriye dönük araçların geliştirilmesi için ana hedeflerdir.

Hücre fonksiyonlarının belirli sinyallere yanıt olarak yeniden programlanması, hücre dışı veya hücre içi dinamik değişikliklerin (giriş) algılanmasını aşağı akış işlemeye bağlayan, teşhis amaçlı (yani raportör genler) veya hücre yanıtını yeniden kablolamak (terapötikler) için spesifik çıktıyı tetikleyen akıllı arayüzlerin tasarımını gerektirir. Algılama modülü tarafından algılanan girdiler, bir hastalığın başlangıcına veya ilerlemesine özgü küçük analitler8, proteinler 9,10,11 veya mikroRNA'lar 11,12,13 olabilir. Ayrıca, karmaşık devre düzenlemesi, tanımlanan koşullara yanıt olarak transgen ekspresyonu üzerindeki sıkı kontrolü artıran çoklu girdi bilgi işleme ile sağlanabilir 14,15,16. Örneğin, mikroRNA tabanlı sensörler, kanser hücreleri gibi belirli hücre tiplerini tanımlayabilir ve bir apoptotik genin13 ekspresyonu ile klirenslerini indükleyebilir. MikroRNA'lar sentetik devrelerde modüler bir şekilde kolayca uygulanabildiğinden, genetik olarak kodlanmış biyosensörler için yaygın olarak kullanılan bir girdiyi temsil ederler 12,13,17. Proteinler ayrıca genetik mutasyonlar, kanser ve enfeksiyonlar için geçerli bir biyobelirteçtir ve gerçekten de bir dizi hücre dışı protein algılama cihazı bildirilmiştir18,19.

Hücre dışı proteinleri tespit eden devrelerin çoğu, bir TEVp'ye duyarlı bölünme bölgesine (TCS) kaynaşmış bir transkripsiyon faktörünü (TF) zara bağlayan mühendislik reseptörlerinin kullanımına dayanır. TEVp'nin önemli bir avantajı, bölünmenin özgüllüğü ve endojen protein işleme ile girişim olmamasıdır. Bu sistemlerde TEVp, hücre dışı moleküllerin bağlanması üzerine tasarlanmış reseptör ile etkileşime giren ikinci bir peptit ile kaynaştırılır. Böylece, harici girişler TEVp aracılı bölünme ve TF salınımını indükler. Bu mekanizma ile çalışan sistemler Tango/TEVp18, ışık kaynaklı20 ve Modüler Hücre Dışı Sensör Mimarisi (MESA)19'dur. Hücre dışı proteinleri tespit etmedeki ilerlemeye rağmen, hücre içi proteinleri modüler bir şekilde algılama teknolojisi, belirli bir proteine yanıt veren tek cihazlar için birçok oluşturma ve test yinelemesinden geçme sınırlaması ile daha önce hiç gerçekleştirilmedi.

Sistemimiz hücre içi protein algılama için ilk platformdur21. Modülerlik, hedefe özgüllüğü tanımlayan iç organların kullanılmasıyla garanti edilirken, hücre yeniden programlaması TEVp aracılıdır. Spesifik olarak, bir iç gövde zara bağlıdır ve bir floresan proteini mKate, bir TCS ve bir TF'ye (füzyon proteini 1) C-terminaline kaynaştırılır; ikinci intrakor TEVp'ye kaynaşır ve sitozolde (füzyon proteini 2) bulunur (Şekil 1).

Böylece, iki intrakor ile hedef protein arasındaki etkileşim sitoplazmada meydana gelir ve TEVp tarafından TCS bölünmesine yol açar, bu da fonksiyonel çıktıyı aktive etmek için çekirdeğe TF translokasyonu ile sonuçlanır. Algılama çalıştırma cihazı, hücre içi hastalığa özgü dört protein için başarıyla test edildi: HCV virüsü22 tarafından eksprese edilen NS3 serin proteaz, HIV enfeksiyonundanTat ve Nef proteinleri 23,24 ve Huntington hastalığının mutasyona uğramış huntingtin (HTT)25. Çıktı ifadesi floresan raportörleri, apoptotik geni (hBax)26 ve immünomodülatörleri (XCL-1)27 içerir. Sistemin hedeflerinin patolojik işlevselliğini de bozabileceğini gösteriyoruz. Örneğin, Nef duyarlı cihaz, hedef proteini tecrit ederek ve enfekte T hücreleri24 üzerindeki HLA-I reseptörünün aşağı modülasyonunu geri döndürerek viral enfeksiyonun yayılmasına müdahale eder. Tarif edilen algılama-çalıştırma platformu, hücre içi proteinlerin tespiti için bu türden bir ilktir ve teşhis ve tedavi amaçlı anormal protein ekspresyonu, translasyon sonrası veya epigenetik modifikasyonları algılamak için potansiyel olarak uygulanabilir20.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

1. Sensör-aktüatör cihazının yapımı ve test edilmesi için tasarım ilkeleri

  1. İlgilendiğiniz bir proteini seçin.
    NOT: Sitoplazmada bulunan veya sitoplazma ile diğer bölmeler arasında mekik dokuyan proteinler için bir sistem tasarladık.
  2. Hedef proteinin farklı epitoplarını bağlayan iki intrakor seçin. Çalışmamızda, intrakorların zaten geliştirilmiş ve test edilmiş proteinleri seçtik 28,29,30,31. İntrakorlar mevcut olmadığında, yeni geliştirilmelidirler.
    NOT: İntrakorlara bir alternatif, ilgilenilen protein ile etkileşime giren diğer moleküller olabilir. Örneğin, Nef algılama cihazı, bir intrabody (sdAb19) ve bir p59fyn protein tirozin kinaz32'nin SH3 alanını içerir.
  3. Füzyon proteinlerini kodlayan DNA dizileri ile plazmitleri in silico olarak tasarlayın.
    NOT: Plazmid tasarımı için yazılım ücretsiz olarak mevcuttur veya satın alınabilir.
    1. Aşağıdaki modülleri içeren diziler oluşturun: membran etiketi, floresan işaretleyici (örneğin, mKate), füzyon proteini 1 için vücut içi, TCS ve TF ve füzyon proteini 2 için intrabody ve TEVp.
      NOT: Birkaç bileşenin etkileşimine dayalı yeni bir mimari oluşturmak, hedef protein tespit edildiğinde sinyal aktivasyonunu en üst düzeye çıkarabilecek parametrelere dikkat etmeyi gerektirir. Spesifik olarak, protein-protein etkileşimini kolaylaştırmak için kimerik proteinlerin TEVp aktivitesine ve esnekliğine odaklandık (Tablo 1). Tüm bu özellikler aşağıdaki noktalarda belirtilmiştir.
    2. Vücut içi-TCS ve/veya TEVp-gövde içi arasına esnek bir glisin-serin bağlayıcı alanı (LD) yerleştirin. LD değişken uzunlukta olabilir (0, 10 veya 15 amino asit-AA).
    3. Füzyon proteini 1: TEVp bölünme aktivitesini düzenlemek için yüksek afiniteli TCS (S) veya düşük afiniteli TCS (L) içeren varyantlar tasarlayın. Bu yapının ifadesi, kurucu bir destekleyici tarafından yönlendirilir. TEVp bölünmesi üzerine çekirdeğe translokasyona izin vermek için TCS'nin C-terminalindeki GAL4VP16 transkripsiyon faktörünü dahil edin.
      NOT: hEF1a promotörünü kullandık, ancak diğer kurucu promotörler seçilebilir.
    4. Füzyon proteini 2: TEVp transkripsiyonunu ayarlamak için bir kurucu (hEF1a) veya doksilisin ile indüklenebilir (pTET) promotör kullanın. Protein stabilitesini modüle etmek için küçük molekül kalkanı tarafından düzenlenen bir bozunma alanı (DD) kullanın.
      NOT: Protein ekspresyonunu ayarlayan diğer indüklenebilir sistemler potansiyel olarak seçilebilir.
    5. Çıktı: Bir transkripsiyon faktörüne yanıt veren bir raportör gen aşağı akış UAS promotörü GAL4VP16 yerleştirin. Cihazın uygulamasına göre çıktıyı seçin (yani floresan proteini, sitokin vb.).
  4. Tercih edilen herhangi bir strateji ile klonlama gerçekleştirin. Burada, golden gate veya gateway teknolojileri ile plazmitler inşa ettik.
  5. Cihazın çeşitli konfigürasyonunu geçici transfeksiyon ile istenen hücre hatlarında test edin. Füzyon proteinleri 1 ve 2 için elde edilen plazmitler ve UAS-EYFP gibi floresan raportör geni ile hücreleri birlikte transfekte edin. Füzyon proteini 1, transfeksiyon belirteci olarak kullanılan bir kırmızı floresan proteini (mkate) içerir.
    NOT: Cihazları test etmek için HEK293FT hücreleri gibi anlaşılması kolay hücre dizileriyle başlayın.
    1. HEK293FT hücrelerde transfeksiyon. 2 x 105 hücreyi 500 μL DMEM içeren 24 oyuklu bir plakaya tohumlayın. Transfeksiyon reaktifi kullanarak 300 ng toplam DNA'ya sahip hücreleri transfekte edin, karışımı vorteksleyin ve RT'de 20 dakika inkübe edin.
      1. Hücreleri 37 °C/%5 CO2 inkübatöre yerleştirin. Transfeksiyondan 24 saat sonra taze kültür ortamı ekleyin.
    2. Jurkat hücrelerinde transfeksiyon. 24 oyuklu plaka için 500 μL RPMI hücre kültürü ortamında 3 x 105 hücre kullanın. Üreticinin talimatına göre elektroporasyon gerçekleştirin. Her örnek için 2-4 μg toplam DNA kullanın. Transfeksiyondan 24 saat sonra 500 μL taze hücre kültürü ortamı ekleyin.
      1. Elektroporasyon sırasında, hücreleri ve DNA karışımını buzun üzerine yerleştirin. Ardından, hücreleri 37 °C /% 5 CO2 inkübatöre yerleştirin.
        NOT: Cihazın özel uygulamasına göre farklı hücre hatları ve transfeksiyon yöntemleri seçilebilir.
  6. Cihazın işlevselliği hakkında kalitatif bir anlayış elde etmek için mikroskop görüntüleri elde edin. Hücre zarına yakın floresan sinyalini (mkate) tespit ederek füzyon proteini 1'in zar lokalizasyonunu doğrulayın. Floresan çıkışını (EYFP) hedef proteinin varlığında veya yokluğunda (negatif kontrol-NC) görselleştirin.
    1. mKate ve EYFP floresan proteinlerini tespit etmek için Tx Red ve GFP ışık küpleri ile donatılmış hücre görüntüleme sistemini kullanın. 10x veya 20x reklam verme amacını kullanın.
      NOT: Otofloresan olmadığından emin olmak için transfekte edilmemiş hücreler kullanın.
  7. Transfeksiyonu akış sitometrisi (FACS) ile analiz edin.
    NOT: Numune hazırlama için Protokol 2'ye bakınız.
    1. Cihazları hedef proteinin varlığında değerlendirin. Füzyon proteini 1 ve 2'nin varyantlarını birleştiren, TEVp'yi (i) kurucu hEf1a promotörü, (ii) doksisiklin ile indüklenebilen TET promotörü ve (iii) protein stabilitesi için kalkan ile modüle eden deneysel bir matris oluşturun. Doksisiklin ekleyin ve konsantrasyonlarda (0-1000 nM) kalkan ekleyin.
    2. İlgilenilen proteini olan veya olmayan numuneler arasında EYFP'nin katlama indüksiyonunu karşılaştırmak için FACS analizi yapın.
      NOT: En yüksek katlama indüksiyonu, KAPALI (hedef proteinin yokluğu) moduna kıyasla AÇIK'ta (hedef proteinin varlığı) en yüksek giriş hassasiyetine karşılık gelir.
  8. İstenen uygulamalara göre cihazın işlevselliğini test edin.
    1. Çıkış proteinlerinin veya apoptozun seviyelerini veya diğer ilgili tahlilleri ölçmek için FACS analizi yapın.
    2. Cihazın çıkış kısmı hedef genlerin ekspresyon seviyelerini düzenliyorsa RT PCR analizi yapın. Temizlik genine (GAPDH veya eşdeğeri) göre 2-ddCT'yi hesaplayın ve AÇIK ve KAPALI modlarında çıktı ifadesinin kat değişimini karşılaştırın.

2. Akış sitometrisi analizi için numune hazırlama

  1. Transfeksiyondan 48 saat sonra akış sitometresi (FACS) ile protein cihazlarının kantitatif analizini yapın.
    1. DMEM ortamını aspire edin ve hücreleri 300 μL PBS ile HEK293FT yıkayın. 100 μL tripsin ekleyin ve 37 °C /% 5 CO2 inkübatörde 2-4 dakika bekletin.
      NOT: Jurkat hücreleri tripsin gerektirmez.
    2. Fenol kırmızısı içermeyen 400 μL DMEM ortamı ekleyin ve topak oluşumunu önlemek için hücreleri yeniden süspanse edin. FACS tüplerinde transfer.
    3. 405, 488 ve 561 nm lazerlerle donatılmış bir akış sitometresi kullanın.
    4. Aşağıdaki sitometre ayarlarını kullanarak canlı hücre popülasyonundan seçilen 30.000 – 100.000 olayı toplayın: EYFP/EGFP için 488 nm lazer ve 530/30 nm bant geçiren filtre, mKate için 561 nm lazer ve 610/20 nm filtre ve 405 nm lazer, EBFP için 450/50 filtre.
      NOT: Akış sitometresini ayarlamak için, transfekte edilmemiş hücreleri ve tek floresan proteinlerle transfekte edilmiş hücreleri dahil edin.
    5. Tercih edilen yazılımı (örneğin, DIVA yazılımı, Flowjo veya TASBE33 yöntemi) kullanarak toplanan numunelerin analizini gerçekleştirin.

3. HCV sensör-aktüatör cihazının karakterizasyonu

  1. NS3 proteinini tespit etmek için intrakorları seçin. scFv35 ve scFv162 iki farklı epitopa bağlanır ve bu şekilde seçilmiştir.
  2. Adım 1.3'te açıklanan rasyonelliği takip eden NS3'e duyarlı cihazın tasarım ve test varyantları (örneğin, Füzyon proteini 1: zar etiketi, mKate, tek zincirli fragman iç gövde scFv35, LD0, TCS-L ve TF GAL4VP16; Füzyon proteini 2: tek zincirli fragman intrabody scFv162, LD0 ve TEVp; Çıkış: UAS-EYFP veya UAS-hBax (apoptoz); NS3 (bakınız Tablo 2)).
  3. Yapıları HEK293FT hücrelerde test edin.
    NOT: Her deney için, ilgilenilen proteinin yokluğunda cihazın teslimi ve çıktı nicelemesi olan negatif bir kontrol ayarlayın.
    1. NS3'ün varlığında veya yokluğunda kurucu bir promotör altında cihazları TEVp için test edin. Adım 1.5.1'de açıklandığı gibi HEK293FT hücrelerde füzyon proteini 1 (adım 1.3.3), füzyon proteini 2 (adım 1.3.4) ve EYFP çıkış adımının (1.3.5) transfeksiyonunu gerçekleştirin. Floresan raportörü (EYFP) akış sitometrisi (Protokol 2) ile ölçerek transfeksiyondan 48 saat sonra numuneleri analiz edin.
    2. BFP-NS3 füzyon proteinini kullanarak mKate ve BFP kolokalizasyonu ile intrabody-NS3 etkileşimini değerlendirin. mKate içeren füzyon proteini 1 ve bir BFP-NS3 ile hücreleri transfekte edin. Transfeksiyondan 48 saat sonra, floresan proteinlerin birlikte lokalizasyonunu test etmek için hücreleri konfokal mikroskopta (63x objektif) gözlemleyin.
      NOT: Negatif kontrol olarak bir BFP (NS3 ile sigortalı olmayan) kullanın. Bu durumda, BFP yaygın hücresel lokalizasyon göstermeli ve membrana bağlı mKate ile birlikte lokalize olmamalıdır.
    3. NS3'ün varlığında veya yokluğunda pTET promotörü altında cihazları TEVp için test edin. NS3'ün yokluğunda ve varlığında EYFP'yi karşılaştırın. Adım 1.5.1'de açıklanan protokolü kullanarak füzyon proteini 1 (adım 1.3.3), füzyon proteini 2 (adım 1.3.4) ve EYFP çıkışı (adım 1.3.5) ile hücreleri birlikte transfekte edin. Transfeksiyonlar NS3'ün varlığında veya yokluğunda gerçekleştirilir. Floresan raportörü (EYFP) akış sitometrisi (Protokol 2) ile ölçerek transfeksiyondan 48 saat sonra numuneleri analiz edin.
  4. NS3 cihazı tarafından yönlendirilen hücre öldürmeyi test edin.
    1. EYFP çıkışını apoptotik gen hBax ile değiştirin.
    2. Adım 3.3.3'ü tekrarlayın. Transfeksiyondan 48 saat sonra hücreleri toplayın ve teste başlamadan önce PBS ile yıkayın.
    3. Pasifik Mavisi ile konjuge Annexin V ile apoptoz testi yapın. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca bağlayıcı tamponda (1:20 hacim oranı) seyreltilmiş apoptotik işaretleyici Annexin V (2.5 μL Pasifik Mavisi ile konjuge) ile hücreleri boyayın.
    4. Hücreleri akış sitometrisi ile analiz edin. Popülasyon içindeki apoptoz seviyesini Pasifik Mavisi (Annexin V) pozitif hücrelerin sayısı olarak hesaplayın.

4. Nef-duyarlı HIV sensör-aktüatör cihazının karakterizasyonu

  1. Nef'e bağlanan iç gövdeleri seçin. Tek alanlı intrakor sdAb19 ve SH3 farklı epitoplara bağlandıkları için seçildi.
    NOT: SH3 bir intrabody değil, fizyolojik olarak Nef ile etkileşime giren bir p59fyn protein tirozin kinaz alanıdır.
  2. Adım 1.3'te açıklanan rasyonelliği takip eden Nef duyarlı cihazın tasarım ve test varyantları (örneğin, Füzyon proteini 1: membran etiketi, mKate, sdAb19, LD0, TCS-L ve GAL4-VP16; Füzyon proteini 2: SH3, LD0 ve TEVp; Çıktı: UAS-EYFP; Nef (bkz. Tablo 3)).
  3. Cihazları HEK293FT ve Jurkat T hücrelerinde test edin.
    NOT: Her deney için, ilgilenilen proteinin yokluğunda cihazın teslimi ve çıktı nicelemesi olan negatif bir kontrol belirledik
    1. HEK293FT transfeksiyonu: Nef'in varlığında veya yokluğunda adım 1.5.1'de açıklanan prosedürü izleyin.
    2. Jurkat T hücrelerinin transfeksiyonu: Nef varlığında veya yokluğunda adım 1.5.2'de açıklanan prosedürü izleyin.
    3. Transfeksiyondan 48 saat sonra, numuneleri Protokol 2'de açıklandığı gibi akış sitometresi ile analiz edin.
  4. HIV tespiti için Jurkat hücrelerini HIV LAI suşları ile enfekte edin.
    1. Deneyden en az 48 saat önce viral stokları hazırlayın. HEK-293T hücrelerinin bulaşıcı moleküler klonlar (NIH AIDS reaktifleri programı) ve üretici talimatlarını kullanarak ticari reaktiflerle transfeksiyonundan elde edilen virüsü kullanın. Viral partikül içermeyen proteinlerden kaçınmak için virüsü 1 saat, 64.074 x g, 4 ° C'de ultrasantrifüjleme ile %20 sükroz üzerine 40 saat sonra konsantre edin. HIV-1 p24 ELISA ile titre viral stokları.
    2. 500 ng p24 inokülum ile HIV-1 suşları olan hücreleri enfekte edin. Enfeksiyondan 40 saat sonra, viral protein p24'ü KC57-FITC konjuge antikor ile tespit ederek ve akış sitometrisi analizi yaparak enfekte hücrelerin yüzdesini ölçün.
    3. Hücreleri HLA-A, B, C'ye karşı AlexaFluor 647 konjuge antikor klonu W6 / 32 ile boyayın. Hücreleri sabitleyin ve bir akış sitometresinde analiz edin. Protein sensör cihazının varlığında veya yokluğunda Jurkat T hücrelerinde HLA-I'in Nef aracılı aşağı modülasyonu.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Modüler hücre içi protein tespiti için bir mimari
Şekil 1'de gösterildiği gibi, cihaz şunlardan oluşur: 1) membrana bağlı floresan işaretleyiciye (mKate) ve TEVp bölünme bölgesine (TCS) bağlı gövde içi 1, ardından bir transkripsiyon aktivatörü GAL4VP16 (TF); 2) TEV proteaza (TEVp) kaynaşmış gövde içi 2, sitozolde serbest; 3) GAL4VP16 yanıt veren, bir muhabir genin ekspresyonunu yönlendiren sentetik bir promotör. Modülerlik, istenen herhangi bir proteini hedeflemek için ta...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Yakın zamana kadar hücrelerin hücre içi ortama dayalı olarak sorgulanması, belirli hedefler için de novo olarak geliştirilen sistemlerle yapılmaktaydı. Mevcut protokol, istenen yeni biyobelirteçlere hızla uyarlanabilen, tek bir cihazda protein algılama ve harekete geçirme için en yeni hücre mühendisliği yaklaşımının bir örneğini açıklamaktadır.

Bu öncü sistem, hücre içi proteinleri algılar ve hastalığı tespit etmek veya nötralize etmek için spesifik bir çıktı ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar rekabet eden hiçbir mali çıkar beyan etmemektedir.

Teşekkürler

Bu çalışma Istituto Italiano di Tecnologia tarafından desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
AlexaFluor 647 fare anti-insan HLA-A, B, C antikor klonu W6/32Biolegend311414Antikorları
Annexin VLifeTechnologiesA35122Apoptoz belirteci
AttracteneQiagen301005Transfeksiyon reaktifi
BD Falcon Yuvarlak Tabanlı TüplerBD Biosciences352053FACS tüpleri
DoksisiklinKlonlama Teknolojisi-Hücre Kültürü:
İlaçlar Dulbecco'nun modifiye edilmiş Eagle ortamıCellgro10-013-CMHücre Kültürü: Orta
Evos Hücre Görüntüleme SistemiYaşam TeknolojisiEVOS M5000Görüntüleme sistemleri; Enfeksiyöz moleküler klonlar
FACSDiva8 yazılımıBD Biosciences659523FACS yazılımı
Hızlı SYBR Green Master MixThermoFisher Scientific4385612qPCR reaksiyonu
FBS (Fetal Bovin Serumu)Atlanta BIOS11050Hücre Kültürü: Orta
Ağ Geçidi SistemYaşamTeknolojileri-Plazmid Yapısı
Golden Gate SistemiçiPlazmid Yapısı
HEK 293FTInvitrogenR70007Hücre Kültürü: Hücre
İnfüzyon Klonlama SistemiClonetech638920Plazmit Yapısı
JetPRIME reaktifiPolyplus transfeksiyon114-15Transfeksiyon reaktifi
Jurkat HücreleriATCCTIB-152Hücre Kültürü: Hücreler
L-GlutaminSigma-AldrichG7513-100MLHücre Kültürü:
Plus Reaktifli Orta Lipofektamin LTXThermo Fisher Scientific15338030Transfeksiyon reaktifi
LSR Fortessa akış sitometresi (405, 488 ve 561 & thinsp; nm lazerler)BD Biosciences649225Akış sitometresi
MicroAmp Hızlı Optik 96 Kuyulu Reaksiyon Plakası (0.1 & thinsp; mL)ThermoFisher Scientific4346907qPCR reaksiyonu
Neon Transfeksiyon SistemiYaşam TeknolojileriMPK10025Transfeksiyon reaktifi
Esansiyel olmayan amino asitlerHyCloneSH3023801Hücre Kültürü: Orta
Opti-MEM I azaltılmış serum ortamıYaşam Teknolojileri31985070Transfeksiyon ortamı
Penisilin / StreptomisinSigma-AldrichP4458-100MLHücre Kültürü: Orta
QuantiTect Ters Transkripsiyon KitiQiagen205313Rev Transkriptaz kiti
RNeasy Mini KitQiagen74106RNA ekstraksiyon kiti
RPMI-1640ATCCATCC 30­ 2001Hücre Kültürü: Orta
KalkanClonetech632189Hücre Kültürü: İlaçlar
SpheroTech RCP-30-5-A boncuklarSpherotechRCP-30- 5A-2Kompanzasyon kurulumu
StepOnePlus 7500 Hızlı makineUygulanan Biyosistemler4351106qPCR reaksiyonu

Kaynaklar

  1. Bernardo, D., Marucci, L., Menolascina, F., Siciliano, V. Predicting Synthetic Gene Networks. Synthetic Gene Networks: Methods and Protocols. 813, 57-81 (2012).
  2. Krams, R., et al. Mammalian synthetic biology: emerging medical applications. J. R. Soc. Interface. 12, (2015).
  3. MacDonald, J. T., Siciliano, V. Computational Sequence Design with R2oDNA Designer. Methods in molecular biology. 1651, Clifton, N.J. 249-262 (2017).
  4. Zah, E., Lin, M. -Y., Silva-Benedict, A., Jensen, M. C., Chen, Y. Y. T cells expressing CD19/CD20 bi-specific chimeric antigen receptors prevent antigen escape by malignant B cells. Cancer Immunology Research. 4, 498-508 (2016).
  5. Wu, F., Bethke, J. H., Wang, M., You, L. Quantitative and synthetic biology approaches to combat bacterial pathogens. Current Opinion in Biomedical Engineering. 4, 116-126 (2017).
  6. Ye, H., et al. Pharmaceutically controlled designer circuit for the treatment of the metabolic syndrome. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 141-146 (2013).
  7. Caliendo, F., Dukhinova, M., Siciliano, V. Engineered Cell-Based Therapeutics: Synthetic Biology Meets Immunology. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, (2019).
  8. Thaker, M. N., Wright, G. D. Opportunities for synthetic biology in antibiotics: Expanding glycopeptide chemical diversity. ACS Synthetic Biology. 4, 195-206 (2015).
  9. Culler, S. J., Hoff, K. G., Smolke, C. D. Reprogramming cellular behavior with RNA controllers responsive to endogenous proteins. Science. 330, New York, N.Y. 1251-1255 (2010).
  10. Ausländer, S., et al. A general design strategy for protein-responsive riboswitches in mammalian cells. Nature Methods. 11, 1154-1160 (2014).
  11. Cella, F., Siciliano, V. Protein-based parts and devices that respond to intracellular and extracellular signals in mammalian cells. Current Opinion in Chemical Biology. 52, 47-53 (2019).
  12. Miki, K., et al. Efficient Detection and Purification of Cell Populations Using Synthetic MicroRNA Switches. Cell Stem Cell. 16, 699-711 (2015).
  13. Xie, Z., Wroblewska, L., Prochazka, L., Weiss, R., Benenson, Y. Multi-input RNAi-based logic circuit for identification of specific cancer cells. Science. , New York, N.Y. 1307-1311 (2011).
  14. Sun, J., et al. Engineered proteins with sensing and activating modules for automated reprogramming of cellular functions. Nature Communications. 8, 477(2017).
  15. Shigeto, H., et al. Insulin sensor cells for the analysis of insulin secretion responses in single living pancreatic β cells. Analyst. 144, 3765-3772 (2019).
  16. Cella, F., Wroblewska, L., Weiss, R., Siciliano, V. Engineering protein-protein devices for multilayered regulation of mRNA translation using orthogonal proteases in mammalian cells. Nature Communications. 9, (2018).
  17. Siciliano, V., et al. MiRNAs confer phenotypic robustness to gene networks by suppressing biological noise. Nature communications. 4, 2364(2013).
  18. Barnea, G., et al. The genetic design of signaling cascades to record receptor activation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 64-69 (2008).
  19. Schwarz, K. A., Daringer, N. M., Dolberg, T. B., Leonard, J. N. Rewiring human cellular input–output using modular extracellular sensors. Nature Chemical Biology. 13, 202-209 (2016).
  20. Wieland, M., Fussenegger, M. Engineering molecular circuits using synthetic biology in mammalian cells. Annual review of chemical and biomolecular engineering. 3, 209-234 (2012).
  21. Siciliano, V., et al. Engineering modular intracellular protein sensor-actuator devices. Nature Communications. 9, 1881(2018).
  22. Lin, C. HCV NS3-4A Serine Protease. , (2006).
  23. Romani, B., Engelbrecht, S., Glashoff, R. H. Functions of Tat: the versatile protein of human immunodeficiency virus type 1. Journal of General Virology. 91, 1-12 (2010).
  24. Basmaciogullari, S., Pizzato, M. The activity of Nef on HIV-1 infectivity. Frontiers in microbiology. 5, 232(2014).
  25. Ross, C. A., Tabrizi, S. J. Huntington's disease: from molecular pathogenesis to clinical treatment. Lancet neurology. 10, 83-98 (2011).
  26. Pfeffer, C. M., Singh, A. T. K. Apoptosis: A Target for Anticancer Therapy. International journal of molecular sciences. 19, 448(2018).
  27. Guzzo, C., et al. The CD8-derived chemokine XCL1/lymphotactin is a conformation-dependent, broad-spectrum inhibitor of HIV-1. PLoS pathogens. 9, 1003852(2013).
  28. Marasco, W. A., LaVecchio, J., Winkler, A. Human anti-HIV-1 tat sFv intrabodies for gene therapy of advanced HIV-1-infection and AIDS. Journal of Immunological Methods. 231, 223-238 (1999).
  29. Gal-Tanamy, M., et al. HCV NS3 serine protease-neutralizing single-chain antibodies isolated by a novel genetic screen. Journal of molecular biology. 347, 991-1003 (2005).
  30. Southwell, A. L., et al. Intrabodies binding the proline-rich domains of mutant huntingtin increase its turnover and reduce neurotoxicity. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 28, 9013-9020 (2008).
  31. Bouchet, J., et al. Inhibition of the Nef regulatory protein of HIV-1 by a single-domain antibody. Blood. 117, 3559-3568 (2011).
  32. Arold, S., et al. The crystal structure of HIV-1 Nef protein bound to the Fyn kinase SH3 domain suggests a role for this complex in altered T cell receptor signaling. Structure. 5, 1361-1372 (1997).
  33. Beal, J. Signal-to-Noise Ratio Measures Efficacy of Biological Computing Devices and Circuits. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 3, 93(2015).
  34. Arold, S., et al. The crystal structure of HIV-1 Nef protein bound to the Fyn kinase SH3 domain suggests a role for this complex in altered T cell receptor signaling. Structure. 5, London, England : 1993. 1361-1372 (1997).
  35. Tyshchuk, O., et al. Detection of a phosphorylated glycine-serine linker in an IgG-based fusion protein. mAbs. 9, 94-103 (2017).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

TEV ProteazGenetik PlatformAntikor Tabanlı AlgılamaPeptit TanımaTranskripsiyonel AktivasyonHuntington HastalığıHepatit C VirüsüHIV Tespiti

Bu makale yayımlandı

Video yakında

Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.