Yöntem makalesi

Kayan Kinesin Motilite Testi Kullanılarak Çok Bileşenli Lipid Nanotüp Ağlarının Üretilmesi

DOI:

10.3791/60899

⸱

26 Temmuz 2021

 , 
1Center for Integrated Nanotechnologies, Sandia National Laboratories

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, dev unilamellar lipid vezikülleri ile birlikte kayan kinesin motilitesini kullanarak lipid nanotüp ağlarının üretilmesi için bir süreci açıklamaktadır.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Lipid nanotüp (LNT) ağları, ökaryotik hücrelerde bulunan her yerde bulunan lipit tübülleriyle ilgili moleküler taşıma ve lipit biyofiziğini incelemek için in vitro bir model sistemini temsil eder. Bununla birlikte, in vivo LNT'ler, kimyasal enerji ve moleküler motorların monte edilmesini, korunmasını ve yeniden düzenlenmesini gerektiren dengesiz yapılardır. Ayrıca, in vivo LNT'lerin bileşimi, birden fazla farklı lipit türünden oluşan karmaşıktır. LNT'leri ekstrüzyon yapmak için tipik yöntemler hem zaman hem de emek yoğundur ve nanotüpleri dev lipit veziküllerinden zorla çekmek için optik cımbız, mikro boncuk ve mikropipetler gerektirir. Burada, büyük ölçekli LNT ağlarının kinesin ile çalışan mikrotübül motilitesi kullanılarak dev unilamellar veziküllerden (GUV'ler) hızla üretildiği kayma hareketliliği testi (GMA) için bir protokol sunulmaktadır. Bu yöntemi kullanarak, LNT ağları, biyolojik LNT'lerin karmaşıklığını taklit eden çok çeşitli lipit formülasyonlarından oluşur ve bu da onları lipid biyofiziği ve membranla ilişkili transportun in vitro çalışmaları için giderek daha yararlı hale getirir. Ek olarak, bu yöntem yaygın olarak kullanılan laboratuvar ekipmanlarını kullanarak LNT ağlarını kısa sürede (<30 dakika) güvenilir bir şekilde üretebilir. Uzunluk, genişlik ve lipit bölümleme gibi LNT ağ özellikleri, ağları imal etmek için kullanılan GUV'ların lipit bileşimini değiştirerek de ayarlanabilir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Lipid nanotüp (LNT) ağlarının imalatı, dengesiz lipid yapılarının in vitro incelenmesi için artan bir ilgi alanıdır 1,2,3. Hücreler, proteinlerin 4 ve nükleik asitlerin5'in difüzyon taşınması ve hücreden hücreye iletişim 6,7 için lipit tübülleri kullanır. Endoplazmik retikulum ve Golgi aparatı özellikle ilginçtir, çünkü bu zara bağlı organeller lipit ve protein sentezinin yanı sıra bu integral biyomoleküllerin bir hücrenin sitoplazması içinde taşınması için birincil yerlerdir 8,9. Bu organellerin zarları, sonuçta işlevselliklerini tanımlamaya yardımcı olan sfingolipidler, kolesterol ve fosfolipitler10 dahil olmak üzere çoklu lipit türlerinden oluşur. Bu nedenle, bu organelleri daha yakından çoğaltmak ve incelemek için, in vitro LNT'ler giderek daha karmaşık lipit formülasyonlarına sahip veziküllerden imal edilmelidir11.

Dev unilamellar veziküller (GUV'ler), lipid membran davranışını incelemek için yaygın olarak kullanılır, çünkü kolesterol, fosfatidilkolin (PC), fosfatidiletanolamin (PE), fosfatidilserin (PS) ve fosfatidilinositol (PI) 12,13 içeren karmaşık formülasyonlarla güvenilir bir şekilde sentezlenebilirler. Burada açıklanan, LNT'lerin kinesin motorları ve GUV'lara etki eden mikrotübül filamentleri tarafından gerçekleştirilen çalışmalara dayanarak ekstrüde edildiği kayma hareketlilik testi (GMA) kullanılarak değişen lipit formülasyonlarına sahip GUV'lerden LNT'ler üretmek için bir yöntemdir. Bu sistemde, kinesin motor proteinleri, biyotinillenmiş mikrotübülleri bir yüzeye adsorbe ederek, ATP'nin hidrolizinden kimyasal enerjiyi yararlı bir işe dönüştürerek (özellikle, LNT'lerin biyotinillenmiş veziküllerden ekstrüzyonu)11. Ortaya çıkan LNT ağı, lipit fazlarındaki farklılıkların LNT morfolojisindeki değişiklikler üzerindeki etkilerini incelemek için bir model platform sağlar.

Kısaca, kinesin motor proteinleri, motorların odanın cam yüzeyine adsorpsiyonunu sağlayan kazein içeren bir çözelti içindeki bir akış odasına sokulmuştur. Daha sonra, ATP içeren bir çözeltideki biyotinile mikrotübüller odadan akar ve kinesin motorlarına bağlanmasına ve hareketliliğe başlamasına izin verilir. Daha sonra odaya bir streptavidin çözeltisi verilir ve mikrotübüllere kovalent olmayan bir şekilde bağlanmasına izin verilir. Son olarak, biyotinile edilmiş bir lipit içeren GUV'lar odaya sokulur ve streptavidin kaplı mikrotübüllere bağlanır, daha sonra 15-30 dakika boyunca büyük ölçekli ağlar oluşturmak için LNT'leri ekstrüzyon yapar. Bu yöntem, standart laboratuvar ekipmanlarını ve reaktifleri kullanarak düşük maliyetle büyük, dallanmış LNT ağları üretir11.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Stok mikrotübül çözeltilerinin hazırlanması

DİKKAT: Güvenlik gözlükleri, eldivenler ve laboratuvar önlüğü protokol boyunca her zaman giyilmelidir.

  1. 5x BRB80 tamponu hazırlayın: 1 L'lik bir cam şişeye 24.19 g PIPES (piperazin-N, N′-bis [2-etansülfonik asit]) ve 0.38 g EGTA (etilen glikol-bis [β-aminoetil eter]-N, N, N′, N′-tetraasetik asit) ekleyin. 1 mL'lik 1 M MgCl2 ekleyin ve pH'ı KOH ile 6,9'a ayarlayın. Çözeltiyi 500 mL'lik bir son hacme getirmek için deiyonize su ekleyin.
  2. 100 mM GTP çözeltisi stoğu hazırlayın: 52 mg GTP tartın ve 1 mL damıtılmış suda askıya alın. 100 mM solüsyonu 20 μL alikotlara bölün ve -20 °C'de saklayın.
  3. GPEM çözeltisini hazırlayın: 200 μL 5x BRB80, 10 μL 100 mM GTP çözeltisi, 100 μL% 100 gliserol ve 600 μL deiyonize su karıştırın. GPEM çözeltisini 100 μL alikotlara bölün ve -20 °C'de saklayın.
  4. Ticari olarak temin edilebilen, liyofilize tübülin şişelerini (biyotinillenmiş, floresan olarak etiketlenmiş ve etiketlenmemiş her biri bir şişe) soğuk (4 ° C) GPEM çözeltisinde 5 mg / mL'lik bir stok konsantrasyonuna yeniden yapılandırarak mikrotübül çözeltisi hazırlayın.
  5. 32 mL'lik bir son hacimde 1:1:6'lık bir oran oluşturmak için 4 μL biyotinile tübülin, 4 μL floresan etiketli tübülin ve 24 μL etiketlenmemiş tübülin (hepsi 5 mg / mL konsantrasyonlarında) karıştırarak mikrotübül polimerizasyonu gerçekleştirin. Buz üzerinde tutun. Tübülin karışımını 2 μL alikotlara bölün ve ihtiyaç duyulana kadar -80 ° C'de saklayın.
    NOT: Verimli polimerizasyon, tübülin konsantrasyonunun kritik konsantrasyona (5 mg / mL) eşit veya üzerinde olmasını gerektirir14. Burada, tübülin oranının seçimi, streptavidin ve GUV'ları verimli bir şekilde bağlamak için yeterli konsantrasyonda biyotinillenmiş tübülin ve mikroskobik karakterizasyon için yeterli konsantrasyonda floresan tübülin için optimize edilmiştir.

2. Dev unilamellar veziküllerin (GUV'lar) hazırlanması

  1. Agarose film hazırlığı
    NOT: Bu protokol Greene ve ark.15'ten uyarlanmıştır.
    1. 250 mL Erlenmeyer şişesinde 100 mL deiyonize suda 1 g agaroz karıştırarak% 1'lik bir w / v çözeltisi hazırlayın. Agaroz çözeltisini 1-2 dakika ısıtmak için standart bir mikrodalga kullanın.
      NOT: Agaroz tamamen çözündükten sonra çözelti yarı saydam hale gelecektir. Kullanmadan önce çözeltinin 65–75 °C'ye soğumasını bekleyin.
    2. 25 mm x 25 mm'lik bir cam kapak kapağı üzerine 300-400 μL agaroz çözeltisi pipetlemek için kesilmiş 1.000 μL pipet ucu kullanın. Kapak kapağının kenarını eldivenli parmaklarla tutarken, erimiş agarozu kapak kapağı boyunca eşit şekilde yaymak için başka bir 1.000 μL pipet ucu kullanın.
      NOT: Agarozun 65–75 °C'de tutulması, kapak kayma yüzeyinde etkili bir şekilde yayılmaya izin verecektir.
    3. Agaroz kaplı örtüleri 37 ° C'lik bir inkübatörde en az 2 saat kurutun, bu noktada agaroz şeffaf hale gelecektir. Agaroz kaplı yüzeyi yukarı bakacak şekilde oda sıcaklığında (RT) tüy bırakmayan kağıt veya balmumu bazlı film gibi temiz bir yüzeye yerleştirerek kapak kapaklarını saklayın.
  2. Lipid formülasyonu
    1. Kloroform içinde çözünmüş lipitleri -20 °C'lik bir dondurucudan alın ve RT'ye ulaşana kadar kimyasal bir duman başlığına yerleştirin.
    2. Aşağıdaki formülü kullanarak formülasyon için gerekli olan her bir bileşen lipitinin lipit stoğunun hacmini hesaplayın:
      figure-protocol-1
      Nerede: V lipid kullanılacak lipid hacmidir, mol% lipit bileşeninin molar yüzdesidir, n formülasyonda kullanılan toplam lipid mol sayısıdır ve M, molar birimlerdeki lipit konsantrasyonudur.
      NOT: Örneğin, 12,72 mM'lik bir stok çözeltisi konsantrasyonuna sahip E mol 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) içeren bir formülasyon ve formülasyonda 1 mikromol toplam lipit kullanılıyorsa, formülasyonda kullanılan DOPC stoğunun hacmi şöyle olacaktır:
      figure-protocol-2
    3. Lipitleri, kimyasal duman davlumbazındaki bir cam şişede hesaplanan oranda karıştırın.
    4. Agaroz kaplı kapaklar üzerine 30 μL lipit çözeltisi pipeti, formülasyonun doymuş lipit bileşeninin erime noktasının üzerine yerleştirilmiş önceden ısıtılmış bir sıcak plaka üzerinde kayar (örneğin; Tm 40 °C olan bir lipit için 50 °C sıcak plaka).
    5. Çözeltiyi, kloroform buharlaşana ve düzgün bir lipit tabakası oluşana kadar 18 G'lik bir iğnenin uzun kenarını kullanarak dairesel bir hareketle agaroz filmi boyunca yayın. Bu adımı gerçekleştirirken kapak kapağının kenarını eldivenli parmaklarınızla tutun.
      NOT: İğne ile agaroz tabakasına zarar vermemeye özen gösterilmelidir.
    6. Agaroz tabakası ve lipit filmi içeren kapak kapağını alüminyum folyo kaplı Petri kabına, film tarafı yukarı bakacak şekilde yerleştirin ve artık çözücüyü çıkarmak için Petri kabını en az 2 saat boyunca vakumlu bir kurutucuya yerleştirin.
  3. Bu arada, 1.92 g sakkarozu 10 mL deiyonize su ile karıştırarak 560 mM sakkaroz çözeltisi hazırlayın.
    NOT: Sakkaroz çözeltisinin konsantrasyonu, tampon GUV'ların seyreltildiği ozmolariteye bağlıdır. Tipik olarak, sakkaroz çözeltisinin ozmolaritesi, GUV'ların seyreltileceği tampondan, özellikle de hareketlilik tamponundan% 10'dan fazla olmamalıdır (bkz. adım 3.11).
  4. GUV oluşumu
    1. Yapışkan odacığı, lipit filmi yukarı bakacak şekilde lipit kaplı kapak kapağının üzerine hafifçe bastırarak lipit filmi ile kaplanmış bir kapak kapağına yapışkan bir oda yapıştırın ve sıkı bir conta oluştuğundan emin olun.
    2. Odaya 400 μL 560 mM sakkaroz çözeltisi (adım 2.3'te hazırlanmış) ekleyin.
    3. Kapak kapağını nem odasına yerleştirin ve kapağı kapatın.
    4. Nem odasını, formülasyonun doymuş lipit bileşeninin erime noktasının üzerine yerleştirilmiş önceden ısıtılmış bir sıcak plaka üzerine yerleştirin.
    5. İyileşmeden önce veziküllerin ≥1 saat boyunca oluşmasına izin verin.
      NOT: Vezikül oluşumu, 40x hava objektif lens ile floresan mikroskopi ile kontrol edilebilir.

3. Motiliteli test stoklarının ve reaktiflerinin hazırlanması

  1. Kazein stoğunun hazırlanması
    1. 50 mL'lik bir konik santrifüj tüpüne 3 g kuru kazein ekleyin, ardından 30 mL 1x BRB80 ekleyin ve çözelti viskoz hale gelene kadar döndürün. Tüpü 30 dakika boyunca 15.000 x g'de santrifüj yapın.
    2. Süpernatantı başka bir 50 mL konik santrifüj tüpüne aktarın ve peleti atın. Çözeltiyi 1 μm'lik bir şırınga filtresinden süzün ve çözeltiyi 50 mL'lik bir konik şişede toplayın. Çözeltiyi 0,2 μm'lik bir filtreden geçirerek çözeltiyi 50 mL'lik bir konik şişede toplayın.
    3. Bir UV-Vis spektrofotometresi ve kuvars küvet kullanarak absorbansı 280 nm'de ölçerek protein konsantrasyonunu belirleyin.
    4. Aşağıdaki formülü kullanarak mg / mL cinsinden kazein konsantrasyonunu hesaplayın:
      figure-protocol-3
    5. Çözeltiyi 1x BRB80'de 20 mg / mL'ye kadar seyreltin, 100 μL alikotlara bölün ve -20 ° C'de saklayın.
  2. 2 mg glikoz oksidazı 1 mL 1x BRB80 ile karıştırarak glikoz oksidaz (2 mg / mL) stok çözeltisi hazırlayın. 100 μL alikotlara bölün ve -20 ° C'de saklayın.
  3. 0.8 mg katalazı 1 mL 1x BRB80 ile karıştırarak katalaz (0.8 mg / mL) stok çözeltisi hazırlayın. 100 μL alikotlara bölün ve -20 ° C'de saklayın.
  4. 1 mL deiyonize suda 0.3 g D-glikozu askıya alarak 2 M glikoz çözeltisi hazırlayın. 100 μL alikotlara bölün ve -20 ° C'de saklayın.
  5. 1 mL deiyonize suda 0,015 g DTT'yi askıya alarak 100 mM DTT stoğu hazırlayın. 100 μL alikotlara bölün ve -20 ° C'de saklayın.
  6. 100 mM MgCl2'lik 1 mL çözeltide 0.055 g disodyum ATP'yi askıya alarak 100 mM Mg-ATP stoğu hazırlayın. 100 μL alikotlara bölün ve -20 ° C'de saklayın.
  7. 100 mM MgCl2'lik 1 mL'lik bir çözeltide 0,055 g AMP-PNP'yi askıya alarak 100 mM Mg-AMP-PNP çözeltisi hazırlayın, ardından 100 μL alikotlara bölün ve -20 °C'de saklayın.
  8. 1 mL metanole 25.03 mg Trolox ekleyerek 100 mM Trolox çözeltisi hazırlayın ve -20 °C'de saklayın.
  9. 100 μL BRB80'e 1 mg streptavidin ekleyerek 10 mg / mL streptavidin çözeltisi hazırlayın, ardından 2 μL alikotlara bölün ve -80ۛ ° C'de saklayın.
  10. 200 μL 5x BRB80, 20 μL kazein çözeltisi, 10 μL MgATP çözeltisi, 10 μL Trolox, 5 μL paklitaksel çözeltisi ve 765 μL DI suyu karıştırarak BRB90CAT hazırlayın. 4 °C'de saklayın.
  11. 192 μL BRB80CAT, 2 μL D-glikoz çözeltisi, 2 μL glikoz oksidaz çözeltisi, 2 μL DTT çözeltisi ve 2 μL katalaz çözeltisini karıştırarak hareketlilik çözeltisini hazırlayın. 4 °C'de saklayın.
  12. BRB80CAT'teki stok kinesin çözeltisini seyrelterek 1 μM kinesin çözeltisi hazırlayın (örneğin, BRB80CAT'in 98 μL'sinde 2 μL 50 mM kinesin çözeltisi) ve 4 °C'de saklayın.
  13. 90 μL oda sıcaklığında 10 μL stabilize mikrotübülleri seyrelterek 10 μg / mL mikrotübül çözeltisi hazırlayın BRB80CAT. RT'de depolayın.
  14. 99.9 μL hareketlilik çözeltisine 0.1 μL 10 mg / mL streptavidin çözeltisi ekleyerek 10 μg / mL'lik bir streptavidin çözeltisi hazırlayın. 4 °C'de saklayın.
  15. 5 μL GUV stoğunu 55 μL hareketlilik çözeltisine seyrelterek 12x GUV çözeltisi hazırlayın. 4 °C'de saklayın.
  16. Tübülinin mikrotübüllere polimerizasyonu
    1. Önceden hazırlanmış 2 μL tübülin alikotunu -80 °C dondurucudan (adım 1.5'te hazırlanmış) toplayın ve 30 dakika boyunca 37 °C'lik bir su banyosuna yerleştirin.
    2. 1 mL susuz DMSO'ya 1.71 mg paklitaksel ekleyerek 2 mM'lik bir paklitaksel çözeltisi hazırlayın, 10 μL alikotlara bölün ve -20 ° C'de saklayın.
    3. BRB80T'yi 99,5 μL 1x BRB80 ile 0,5 μL 2 mM paklitaksel karıştırarak taze olarak hazırlayın.  Su banyosunda 100 μL BRB80T ila 37 °C ısıtın.
    4. 30 dakika sonra, mikrotübülleri stabilize etmek için tübülin aliquotuna 100 μL BRB80T ekleyin. RT'de depolayın.

4. Kayan hareketlilik testi (GMA)

  1. Bir cam kızağa 5 mm ile ayrılmış iki çift taraflı bant şeridi yapıştırarak bir akış odası hazırlayın. Her şeridi üç bant katmanı oluşturana kadar bu işlemi tekrarlayın.
  2. Bandın üstüne bir kapak kayması yerleştirin, ardından yeterli yapışmayı sağlamak için bir cımbız veya kalemle kapak kayması/bant arayüzüne hafifçe bastırın.
    NOT: Kanal 5 mm genişliğinde 25 mm uzunluğunda ve 300 mm yüksekliğinde olmalıdır.
  3. Pipet, akış hücresine 30 μL 1 mm kinesin çözeltisi (adım 3.12'de hazırlanmış) ve 5 dakika boyunca inkübe edilmesine izin verin.
    NOT: Kazein, kapak kayması/cam sürgü yüzeyinde bir çift katman oluşturur ve kinesin kuyruğunun yüzeye tutturulmasını kolaylaştırır.
  4. Pipet, çözelti değişimini kolaylaştırmak için akış kanalının karşı ucuna hafifçe bastırılmış bir laboratuvar mendili kullanılarak akış hücresine 10 μg/mL mikrotübül çözeltisinden (adım 3.13'te hazırlanmıştır) 30 μL'dir. 5 dakika boyunca kuluçkaya yatırın.
  5. 1x–3x akış hücresini RT'de 1x hareketlilik çözeltisi ile yıkayın (adım 3.11'de hazırlanır).
    NOT: Bu noktada mikrotübül bağlantısını ve hareketliliğini doğrulamak için 40x hava hedefi kullanan floresan mikroskobu kullanılabilir. Mikrotübüller, yüzey boyunca ~ 0.5 μm / s'de hareket eden (süzülen) floresan filamentler (onlarca mikron uzunluğunda) olarak ortaya çıkar (Şekil 1).
  6. Pipet, çözelti değişimini kolaylaştırmak için akış kanalının karşı ucuna hafifçe bastırılmış bir laboratuvar mendili kullanılarak akış hücresine 10 μg/mL streptavidin çözeltisinden (adım 3.14'te hazırlanmıştır) 30 μL'dir. 10 dakika boyunca kuluçkaya yatırın.
  7. 30 μL 12x GUV çözeltisini (adım 3.15'te hazırlanmıştır), çözelti değişimini kolaylaştırmak için akış kanalının karşı ucuna hafifçe bastırılmış bir laboratuvar mendili kullanarak akışa aktarın. 30 dakika boyunca inkübe edin.
  8. Hareketliliği durdurmak için 2 μL 100 mM AMP-PNP çözeltisi (adım 3.7'de hazırlanmış) ekleyin, ardından odayı sızdırmazlık maddesi ile kapatın.

5. LNT ağ karakterizasyonu

  1. Görüntüleme için akış odasını ters çevrilmiş bir mikroskopa aktarın.
  2. Kullanılan floresan lipitlerin veya tübülinin dalga boylarına göre uygun filtre setini seçin. Örneğin, Texas Red etiketli lipitleri kullanırken, 560 nm / 25 nm uyarma filtresi ve 607 nm / 36 nm emisyon filtresi kullanın.
  3. Kapak kapağının yüzeyine odaklanmak için 100x yağ hedefi kullanın.
  4. Floresan mikroskobu kullanarak LNT ağlarını görüntüleyin.
    NOT: LNT'ler daha büyük veziküllerden ekstrüzyon yapan doğrusal yapılardır. LNT'ler GUV'lardan çok daha küçüktür ve daha zayıf floresan sinyallerine sahiptir. Bu nedenle, pozlama ve kontrast görüntü LNT'lerine göre ayarlanmalıdır. Bu ayarlamalar aynı zamanda GUV'ların aşırı maruz kalmasına da yol açar ve bu nedenle GUV'lardaki lamellerliğin ve faz ayrımının bağımsız olarak karakterize edilmesi önerilir.
  5. Mikroskopu bir ilgi alanına odaklayın ve standart veya döşenmiş bir görüntü alın.
  6. LNT'leri görüntülemek ve GUV'lerin doymuş pozlamasını en aza indirmek için pozlama süresini ve nötr yoğunluk filtrelerini ayarlayın. Hem kırmızı hem de yeşil kanallarda görüntüler alın.
    NOT: Burada, kırmızı kanal Teksas-Kırmızı lipitlerin görselleştirilmesine izin verirken, yeşil kanal mikrotübüllerin (örneğin, Oregon Green lipitleri ve HiLyte488 boyaları) görselleştirilmesine izin verir.
  7. Kırmızı ve yeşil kanalları üst üste bekleyerek bileşik bir görüntü oluşturun (Şekil 1).
  8. LNT uzunluğunun ölçülmesiyle LNT ağlarının karakterizasyonu
    1. ImageJ gibi bir görüntü analiz yazılımı kullanarak alınan görüntüleri açın.
    2. Ölçek ayarla özelliğini kullanarak mikroskop için teraziyi kalibre edin, pikselleri mm dönüştürme faktörüne doldurun ve Tamam'ı tıklatın.
      NOT: Dönüştürme faktörü mikroskop, objektif lens ve kameraya bağlıdır ve mikroskop kalibrasyon slaytı kullanılarak elde edilebilir. Genellikle piksel/mm cinsinden ifade edilir.
    3. Ana GUV'den başlayan nanotüplerin uzunluğunu ölçmek için Çok Noktalı çizgi aracını kullanın. Uzunluğu ölçmek için Ctrl + M tuşlarını basılı tutun.
    4. Yukarıdaki adımları izleyerek tek tek tüplerin uzunluklarını ölçmeye devam edin. Görüntü işleme aracı, her yeni ölçümü sonuçlar penceresine kaydeder.
    5. Hangi tüplerin ölçüldüğünü takip etmek için her çizgiyi çizdikten sonra Ctrl + D tuşlarını basılı tutun.
  9. LNT kalınlığının ölçülmesi (Şekil 2)
    1. Görüntüyü ImageJ'de açın ve Görüntü sekmesinin altındaki Eşik özelliğini seçin.
    2. Eşiği uygulamak için Uygula'yı tıklayın.
    3. İstediğiniz tüpün üzerine bilinen uzunlukta bir dikdörtgen çizin (siyah piksellerin değeri 0, kırmızı piksellerin değeri ise 255'tir).
    4. Alanın entegre yoğunluğunu ölçün.
    5. Kalınlığı (piksel cinsinden) elde etmek için yoğunluğu LNT'nin uzunluğuna (piksel cinsinden) bölün.
      NOT: Kalınlık ölçümleri yalnızca görüntüleme ayarları ve eşik aynı şekilde ayarlandığında görüntüler arasında karşılaştırılabilir.
  10. LNT'lerin düğümlerinde lipid bölümlemesinin belirlenmesi (Şekil 3)
    1. Görüntüyü ImageJ'de açın.
    2. İstediğiniz düğümün üzerine çizgi çizmek için Çizgi aracını kullanın.
    3. Hem Oregon Green hem de Texas Red kanallarındaki düğüm yoğunluğunu ölçün.
    4. Çizgiyi LNT'ye taşıyın ve hem Oregon Green hem de Texas Red kanallarındaki LNT yoğunluğunu ölçün.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

LNT ağları (Şekil 4), LNT'leri GUV'lardan ekstrüde etmek için mikrotübüllerin kinesin taşınması tarafından gerçekleştirilen işi kullanan tarif edilen protokol kullanılarak üretilmiştir. Kısaca GUV'lar sakkaroz çözeltisi kullanılarak agaroz jel rehidrasyonu kullanılarak hazırlandı ve mikrotübüller GPEM çözeltisinde polimerize edilerek BRB80T'de stabilize edildi. Daha sonra, kinesin motorları, kapak kaymasının yüzeyinde aktif bir motor tabakası oluşturan bir akış hücresine sokuldu. Daha sonra ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

LNT ağları, membran özelliklerine ve transmembran proteinleri gibi biyomoleküllerin taşınmasına yönelik in vitro çalışmalar için yararlı bir araçtır. Ayrıca, LNT ağlarını üretmek için karmaşık lipit formülasyonlarının kullanılması, biyolojik olarak daha ilgili çalışmalara olanak tanır. Diğer imalat çalışmaları ya 1) basit lipit formülasyonları ve çok katmanlı veziküller ya da 2) karmaşık lipit formülasyonlarından oluşan GUV'lardan ağlar üretmek için daha hantal hareketlilik teknikleri kullanmıştır. Burada açıklanan yönte...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sandia Ulusal Laboratuvarları, DE-NA-0003525 sözleşmesi kapsamında ABD DOE'nin Ulusal Nükleer Güvenlik İdaresi için Honeywell International, Inc.'in tamamına sahip olduğu bir yan kuruluşu olan Sandia, LLC.'nin Ulusal Teknoloji ve Mühendislik Çözümleri tarafından yönetilen ve işletilen çok misyonlu bir laboratuvardır. Bu yazıda objektif teknik sonuçlar ve analizler açıklanmaktadır. Makalede ifade edilebilecek herhangi bir öznel görüş veya görüş, ABD Enerji Bakanlığı veya ABD Hükümeti'nin görüşlerini temsil etmek zorunda değildir.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma ABD Enerji Bakanlığı, Temel Enerji Bilimleri Ofisi, Malzeme Bilimleri ve Mühendisliği Bölümü (BES-MSE) tarafından desteklenmiştir. Kinesin sentezi ve floresan mikroskobu, ABD Enerji Bakanlığı (DOE) Bilim Ofisi için işletilen bir Bilim Ofisi Kullanıcı Tesisi olan Entegre Nanoteknolojiler Merkezi'ndeki bir kullanıcı projesi (ZIM) aracılığıyla gerçekleştirildi.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
100x/1.4 Sayısal Açıklık Yağa Daldırma ObjektifiOlympus1-U2B836Olympus UPlanSApo 100X/1.40 Yağ Objektifi Sonsuz Düzeltmeli, RMS Thread
Çalışma Mesafesi 0.12mm
3.0 ND FiltreOlympusNötr Yoğunluk Filtresi
AMP-PNPSigma-AldrichA2647(β,γ-imidoadenosin 5′-trifosfat)
ATPSigma-AldrichA7699Adenozin 5'-trifosfat disodyum tuzu hidrat BioXtra
Brightline Pinkel DA/FI/TR/Cy5/Cy7-5X-A000 filtre setiSemrockLED-DA/FI/TR/Cy5/Cy7-5X-A-000
BrightLine Pinkel filtre seti, DAPI, FITC, TRITC, Cy5 & LED tabanlı ışık kaynakları ile aydınlatılmış Cy7 ve benzeri floroforlar
KazeinSigma-Aldrich22090Mikrobiyoloji için kazein hidrolizatı
KatalazSigma-AldrichC9322Sığır Karaciğerinden Katalaz
KloroformSigma-Aldrich288306Susuz kloroform stabilizatör olarak %0.5-1.0 etanol içerir
KolesterolAvanti700000Pkolesterol (küçükbaş yünü, %>98) (toz)
D-GlukozSigma-AldrichG7021D-(+)-Glikoz tozu, BioReagent, hücre kültürüne uygun, böcek hücre kültürüne uygun, bitki hücre kültürüne uygun, > % 99,5
DOPCAvanti850375C1,2-Dioleoil-sn-glisero-3-fosfokolin (kloroformda)
DOPE-BiotinAvanti870282C1,2-dioleoil-sn-glisero-3-fosfoetanolamin-N- (biyotinil) (sodyum tuzu)
DPPCAvanti850355P1,2-dipalmitoil-sn-glisero-3-fosfokolin (toz)
DPPE-BiotinAvanti870285P1,2-dipalmitoil-sn-glisero-3-fosfoetanolamin-N- (biyotinil) (sodyum tuzu)
DTTSigma-Aldrich43816DL-Ditiyotreitol çözeltisi 1 M
EGTASigma-AldrichE4378EGTA, Egtazik asit, Etilen-bis (oksietilennitrilo) tetraasetik asit, Glikol eter diamin tetraasetik asit
Glikoz OksidazSigma-AldrichG6125Aspergillus niger
Tip II, &ge'den Glikoz Oksidaz; 10.000 birim/g katı (oksijen eklenmemiş)
GliserolFisherG33Gliserol (Sertifikalı ACS), Fisher Chemical
GTP Sigma-AldrichG8877Guanozin 5′-trifosfat sodyum tuzu hidrat
IX-81 Olympus MikroskopOlympusN/AIX81 Olympus
KOHSigma-Aldrich1050121000Potasyumdan Ters Mikroskop Hidroksit
Magnezyum KlorürSigma-AldrichM10281.00 M magnezyum klorür çözeltisi
Orca Flash 4.0 Dijital KameraHamamatsuC13440-20CUORCA-Flash 4.0 V3 Dijital CMOS kamera
Oregon Yeşili-DHPEInvitrogenO12650Oregon Yeşili 488 1,2-Dihekzadekanoyl-sn-Glisero-3-Fosfoetanolamin
PaklitakselThermoFisherP3456Paklitaksel (Taksol Eşdeğeri) - sadece araştırmada kullanım için
PIPESSigma-AldrichP67571,4-Piperazindietansülfonik asit, Piperazin-1,4-bis (2-etansülfonik asit), Piperazin-N, N ve prime;-bis (2-etansülfonik asit)
Texas Red-DHPEInvitrogenT1395MPTexas Red 1,2-Dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-Fosfoetanolamin,
Trietilamonyum Tuzu
TroloxSigma-Aldrich238813(±)-6-Hidroksi-2,5,7,8-tetrametilroman-2-karboksilik asit
Tubulin, BiotinHücre İskeletiT333PTubulin proteini (biotin) domuz beyni
Tubulin, Hy-Lite 488Hücre iskeletiTL488MTubulin proteini (floresan HiLyte 488) domuz beyni
Tubulin,Etiketsiz Hücre İskeletiT240Tubulin proteini domuz beyni

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bouxsein, N. F., Carroll-Portillo, A., Bachand, M., Sasaki, D. Y., Bachand, G. D. A continuous network of lipid nanotubes fabricated from the gliding motility of kinesin powered microtubule filaments. Langmuir. 29 (9), 2992-2999 (2013).
  2. Paxton, W. F., Bouxsein, N. F., Henderson, I. M., Gomez, A., Bachand, G. D. Dynamic assembly of polymer nanotube networks via kinesin powered microtubule filaments. Nanoscale. 7 (25), 10998-11004 (2015).
  3. Leduc, C., et al. Cooperative extraction of membrane nanotubes by molecular motors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (49), 17096-17101 (2004).
  4. Lippincott-Schwartz, J., Roberts, T. H., Hirschberg, K. Secretory protein trafficking and organelle dynamics in living cells. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 16, 557-589 (2000).
  5. Belting, M., Wittrup, A. Nanotubes, exosomes, and nucleic acid-binding peptides provide novel mechanisms of intercellular communication in eukaryotic cells: implications in health and disease. Journal of Cell Biology. 183 (7), 1187-1191 (2008).
  6. Rustom, A., Saffrich, R., Markovic, I., Walther, P., Gerdes, H. H. Nanotubular highways for intercellular organelle transport. Science. 303 (5660), 1007-1010 (2004).
  7. Onfelt, B., Nedvetzki, S., Yanagi, K., Davis, D. M. Cutting edge: Membrane nanotubes connect immune cells. Journal of Immunology. 173 (3), 1511-1513 (2004).
  8. Sciaky, N., et al. Golgi tubule traffic and the effects of brefeldin A visualized in living cells. J Cell Biol. 139 (5), 1137-1155 (1997).
  9. Sprong, H., van der Sluijs, P., van Meer, G. How proteins move lipids and lipids move proteins. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 2 (7), 504-513 (2001).
  10. Keenan, T. W., Morre, D. J. Phospholipid class and fatty acid composition of golgi apparatus isolated from rat liver and comparison with other cell fractions. Biochemistry. 9 (1), 19-25 (1970).
  11. Imam, Z. I., Bachand, G. D. Multicomponent and Multiphase Lipid Nanotubes Formed by Gliding Microtubule-Kinesin Motility and Phase-Separated Giant Unilamellar Vesicles. Langmuir. 35 (49), 16281-16289 (2019).
  12. Wesolowska, O., Michalak, K., Maniewska, J., Hendrich, A. B. Giant unilamellar vesicles - a perfect tool to visualize phase separation and lipid rafts in model systems. Acta Biochimica Polonica. 56 (1), 33-39 (2009).
  13. Momin, N., et al. Designing lipids for selective partitioning into liquid ordered membrane domains. Soft Matter. 11 (16), 3241-3250 (2015).
  14. Fygenson, D. K., Braun, E., Libchaber, A. Phase diagram of microtubules. Physical Review E. 50, 1579(1994).
  15. Greene, A. C., Sasaki, D. Y., Bachand, G. D. Forming Giant-sized Polymersomes Using Gel-assisted Rehydration. Journal of Visualized Experiments. (111), (2016).
  16. Bachand, M., et al. Directed self-assembly of 1D microtubule nano-arrays. Royal Society of Chemistry Advances. 4 (97), 54641-54649 (2014).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Kayma Hareketlili i DeneyiDev Tek Tabakal Vezik llerKinezin G d ml HareketlilikLipid Biyofizi iMikrot b l Hareketlili iFaz Ayr mImageJ AnaliziLipid B l nmesiMembran Transportu

İlgili makaleler