Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Erişkin Kardiyak Fibroblastlar ve Miyofibroblastların İzolasyon ve Karakterizasyonu

15.9K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/60909

⸱

12 Mart 2020

 ,  ,  , 
1Department of Pathology, Microbiology, and Immunology, Vanderbilt University Medical Center, 2American Red Cross, National Headquarters

Bu makalede

Özet

Fibroblastların saf bir popülasyon elde yara onarımı ve fibrozis rollerini incelemek için çok önemlidir. Burada açıklanan yaralanmamış ve yaralı fare kalplerinden fibroblastlar ve miyofibroblastlar izole etmek için ayrıntılı bir yöntem immünofloresan, RTPCR, floresan destekli hücre sıralama ve saflık ve işlevsellik karakterizasyonu takip kollajen jel kontraksiyonu.

Özet

Kardiyak fibrozis yaralanmaya yanıt olarak yara iyileşmesi için fizyolojik bir yanıttır. Fibrozisi azaltan fibroblast alt tiplerinin incelenmesi ve hedef altına inme çalışmaları yapılmıştır. Ancak, fibroblast araştırma quiescent yanı sıra aktif fibroblastlar tanımlamak için evrensel olarak kabul edilebilir fibroblast belirteçleri eksikliği nedeniyle engellenmiştir. Fibroblastlar heterojen hücre popülasyonuolup, onları izole etmek ve karakterize etmek zordur. Sunulan protokol, yaralanmamış ve yaralanan fare kalplerinden fibroblastve miyofibroblastları zenginleştirmek için üç farklı yöntem tanımlanmaktadır. Fibroblastları izole etmek için standart ve güvenilir bir protokol kullanmak, homeostazdaki rollerinin ve fibrozis modülasyonunun incelenmesini sağlayacaktır.

Giriş

Kardiyak fibroblastlar, mezenkimal kökenli hücreler, homeostaz sırasında kardiyak mimarinin bakımına ek olarak kalpte elektrikiletimi ve mekanik kuvvetlerin korunmasında önemli bir rol oynamaktadır1. Yaralanmadan sonra, bu hücreler aktive edilir, genişletilir ve ekstrasellüler matriks (ECM) proteinleriüretir2. Birçok preklinik çalışmalar da yaralı bir kalp yapısal bütünlüğünü korumak kritik hücresel düzenleyiciler olarak fibroblastlar ortaya koymuştur3 yanı sıra kontrolsüz üretim ve ECM proteinlerin birikimisorumlu ana efektör hücreleri, sert yara oluşumu ve kalp yetmezliği ile sonuçlanan4. Fibroblastlar heterojen bir hücre grubudur, bu da reparatif fonksiyonlarını pro-fibrotik maladaptif özelliklerden ayırmakiçin zorlayıcı dır. Son zamanlarda, miyokardiyal yaralanma sonrası iki farklı fibroblast alt tipinin fonksiyonel heterojenliği tanımlanmış, farklı fibroblast alt tiplerini izole etme ve yara iyileşmesindeki rollerini inceleme olasılığıgösterilmiştir 5.

Saf fibroblast popülasyonu elde etmek, onarım ve fibrozisteki fonksiyonel rollerini ortaya§ almakta çok önemlidir. Ancak, diğer hücre tiplerini tanıyan birden fazla fibroblast belirteçlerinin varlığı önemli ölçüde saf fibroblastpopülasyonu 6izole etmek için zor olun. Çeşitli zarif çalışmalar yaralanmamış ve yaralanmalı miyokardyum kardiyak fibroblastlar izole etmek için akıllı yollar icat var. Fibroblastları zenginleştirmenin en popüler ve köklü yöntemi enzimatik doku sindirimini7takiben seçici yapışma yoluyla 7.

Ayrıca, hücre yüzeyi antijenlerine dayalı fibroblastların floresan aktive hücre sıralama (FACS) başarıyla tarif edilmiştir8. Çalışmada enzimatik sindirimitaki mezenkimal hücreler fare kalplerinden soy-negatif (Lin: Ter119−CD45−CD31− )ve gp38-pozitif (gp38+) olarak sıralandı. Gp38+ve hücrelerinin col1α1 ve diğer mezenkimal belirteçlerin ortak ekspresyonuna göre fibroblast olduğu doğrulandı. En doku sindirim petri çanak ventrikül dışarı diseksiyon sonra tamamlanmış olsa da, yeni bir çalışma da miyositler ve fibroblastlar içeren non-miyositizole etmek için sol ventrikül doğrudan iğne enzim perfüzyonu kullanımını araştırdı9. Fibroblastlar daha sonra bu durumda selektif yapışma ile izole edildi.

Bu protokol, fibroblastların izolasyonu ve zenginleşmesini üç yöntemle açıklar. İlki enzimatik sindirimi takiben fibroblastların seçici yapışmasını içeren zaten kurulmuş bir yöntemdir. İkinci yöntem öncelikle miyofibroblastları ifade eden yaralanmaya bağlı alfa düz kas izole etmek için kullanılır. Üçüncü yöntem hematopoetik ve endotel hücrelerinin enzim sindirilmiş kardiyak hücre süspansiyonunun sıralı, manyetik olarak tükenmesini içerir. Tükenmeden sonra fibroblastlar/miyofibroblastlar manyetik boncuklar kullanılarak mefsk4 antijeninin varlığına göre izole edilir. Son zamanlarda, MEFSK4 quiescent yanı sıra aktif fibroblastlar üzerinde bir antijen mevcut olarak tarif edilmiştir, fibroblast tanımlama ve izolasyon için uygun bir belirteç yapma. Doğal olarak, burada açıklanan tüm yöntemlerin benzersiz sınırlamaları vardır. Bu nedenle, akış analizi, immünboyama ve yarı kantitatif gerçek zamanlı PCR ile izole hücre popülasyonunun saflığını kontrol etmek şiddetle tavsiye edilir. Ancak, bu metodolojiler üzerine genişletilebilir ve önemli deneyler için fibroblast ve miyofibroblast popülasyonları kullanmadan önce diğer kirletici popülasyonları dışlamak için ek belirteçler eklenebilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüleri Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu'ndaki önerileri kesinlikle onaylar. Vanderbilt Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi protokolü onayladı (protokol numarası: M1600076-01).

1. Kalp Diseksiyonu

  1. Çözüm hazırlama
    1. KHB arabelleği
      1. Bir karıştırma çubuğu kullanarak, 900 mL DDI suda 900 mL'lik Krebs-Henseleit tampon (KHB) tozunu yavaşça çözün.
        NOT: Tampon çok hızlı veya çok uzun süre karıştırılırsa çökelecektir. Fibroblast izolasyonu sırasında KHB tamponu soğuk olmalıdır.
      2. 2,9 mM CaCl2 ve 24 mM NaHCO3ekleyin. pH'ı 7.2-7.3'e ayarlayın ve dH2O ile 1 L'lik bir hacme seyreltin.
      3. Steril filtre (0,22 μm) kullanarak 4 °C'de 4 haftaya kadar saklayın. İzolasyon süresi boyunca buzda veya 4 °C'de tutun.
    2. Kollajenaz sindirim kokteyli
      1. Fibroblast izolasyon u yuzden sindirim kokteyli hazırlayın. Kalp sayısına göre sindirim kokteylinin uygun hacmini belirleyin; 1 kalp başına 5 mL kokteyl.
      2. Üreticinin talimatlarına göre kollajenaz karışımı (Malzeme Tablosuna bakın) ve DNase I hazırlayın.
      3. Toplam sindirim kokteylinin 20 mL'si için 17,5 μL DNase I, 180 μL 1 M HEPES ve 500 μL kollajenaz ekleyin.
      4. 20 mL toplam hacim elde etmek için Ca2+ ve Mg2+ ile Hank'in Dengeli Tuz çözeltisi (HBSS) için yeterli hacim ekleyin.
    3. Kırmızı kan hücresi (RBC) lysis tampon
      1. Kalp sayısına (5 mL/kalp) göre gereken toplam hacmi belirleyin. DH2O kullanarak 10x RBC lysis stok tampon1x seyreltin.
    4. Fibroblast ortam: DMEM F-12'de %10 FBS
      1. L-glutamin ve HEPES ile DMEM-F12'ye %10 FBS ekleyin. 10 U/mL penisilin/streptomisin, 2,5 g/mL anti-mantar ve 2,5 g/mL mikoplazma profilaktik ekleyin (bkz. Malzeme Tablosu). 4 °C'de saklayın.
  2. Kalp diseksiyonu
    1. Diseksiyon sırasında kalpleri depolamak için her kuyuda 2 mL soğuk KHB ile buz üzerinde 6 kuyuluk bir plaka hazırlayın. Otoklavlı cerrahi makas ve forceps yararlanın.
    2. 12 haftalık veya daha büyük dozlarda izofluran aşırı dozda fareleri ötenazi ve servikal çıkış ile takip edin.
    3. Alternatif olarak, aktive fibroblast izolasyonu için, koroner arter ligasyonu10ile 12 haftalık farelerde miyokard infarktüsü indüklemek. Fareleri yaralanmadan 8-10 gün sonra ötenazi.
    4. % 70 etanol ve orient ile sprey vücut böylece ventral tarafı deneyci karşı karşıya. Paraziti önlemek için uzantıları sabitleyin veya dizginleyin.
    5. Karın deri ve kas açık kesin ama karaciğer piercing kaçının. Göğüs kafesini dikey olarak kesin ve kalbin delinmesini önlerken göğüs kafesini dikkatlice açın. Kalbi ortaya çıkarmak için göğüs kafesini kesmeye devam et.
    6. Forseps kullanarak, yavaşça göğüs kalbini kaldırın, herhangi bir akciğer veya kalp dışında bağlı aşırı doku keserek. Ventrikül çıkarın ve soğuk KHB ile 6 iyi plaka bir kuyuya yerleştirin. Tüm örnekler izole edilene kadar kalpleri bu şekilde kesmeye devam edin.
  3. Kalbin enzimatik dissosiyasyonu
    1. Forceps kullanarak, art arda sıkmak ve fazla kan kaldırmak için KHB kalp ajite. Kalbi temiz bir steril 10 cm2 tabağa aktarın. Tek bir kenar bıçak kullanarak, hızlı bir şekilde küçük parçalar halinde kalp kıyma.
    2. Kollajenaz sindirim kokteyli 1 mL ekleyin ve parçalar 1 mL mikropipet ile aktarmak için yeterince küçük olana kadar kıyma devam edin. Parçaları 1 mL mikropipetli 50 mL konik boruya aktarın. 2 mL kollajenaz sindirim kokteyli ile yıkama plakası 2x.
      NOT: Pipet ucunun bir kısmının kesilmesi, pipet ucuna yapışabilecek daha büyük kalp parçalarının toplanmasına yardımcı olabilir.
    3. 37 °C'de 30 dk sallayarak veya ajitasyon ile kuluçka konik tüp. Gerektiği gibi güvenli tüp. İçeriği homojen olana kadar 5 mL pipetle 10x'i yeniden askıya alın ve konik tüpü 37 °C'de 15 dakika boyunca döndürme veya ajitasyon ile kuluçkaya yatırın.
    4. Homojen olana kadar 10 mL pipet ile 10x'i yeniden askıya alın. Filtreyi 1-2 mL KHB tamponu ile ıslatarak 40 μm'lik bir hücre süzgecini yeni bir 50 mL konik tüpün üzerine uygulayın. Sindirim süspansiyonu için 25 mL KHB tampon ekleyin, yeniden askıya alın ve astarlanmış 40 μm hücresüzden süzün. Gerektiğinde filtreyi değiştirin.
      NOT: Filtrasyon yavaşladıkça, tüpü hafifçe dokunarak veya filtrenin alt tarafından süspansiyon çekmek için 1 mL mikropipet kullanmak hücre süspansiyonunun kısmen tıkanmış 40 μm hücreli bir süzgeçten geçmesine yardımcı olabilir.
    5. 10 dk. 400 x g ve 4 °C'de santrifüj. Oda sıcaklığında 2 dakika (RT) kuluçka.
    6. 10 dk. 400 x g ve RT'de santrifüj 10 dk. Supernatant'ı çıkarın ve 1 mL KHB tamponunda peleti yeniden sulayarak yıkayın.
    7. Yeni 50 mL konik tüp içine astarlı 40 μm hücresüz ile KHB tampon 9 mL ekleyin ve filtre. Santrifüj 400 x g ve RT 10 dakika.
    8. Supernatant çıkarın, fibroblast media veya PBS 1 mL resuspend, ve hücre numarasını belirlemek. Fibroblastlar aşağıda açıklanan üç farklı yöntemle izole edilebilir.

2. Fibroblastların Tek Hücreli Süspansiyondan İzolasyon

  1. Fibroblast izolasyonu: diferansiyel kaplama (Şekil 1)
    1. Kuyu başına 2 mL fibroblast media ekleyerek ve iyi alt kapsayacak şekilde plaka girdap 6-iyi bir plaka hazırlayın.
    2. Kalp başına 1 mL'lik ortamdaki hücreleri yeniden askıya alın. Plaka 1 mL hücre süspansiyon u olabilir ki bir kalp (teorik olarak) iyi başına kaplanmış ediliyor. Örneğin, 6 mL'lik ortamda altı kalp yeniden askıya alınır, ardından kuyu başına 1 mL hücre süspansiyonu ile altı kuyuya kaplanır.
    3. Hücreleri eşit olarak dağıtmak için girdap plakası. Kuyu başına 5 mL'ye kadar toplam hacim için kuyu başına 1-2 mL ek bir ortam ekleyin ve 37 °C'de 4 saat boyunca kuluçkaya yatırın.
    4. Fibroblastlar 4 saat sonra seçici yapışma ile ayrılacak. Ekli hücreleri 2 mL PBS ile yıkayın ve kuyu başına 2-4 mL steril fibroblast media ekleyin. 37 °C'de inküler. Her 2-4 günde bir ortam değiştirin.
  2. Fibroblast İzolasyon: GFP muhabiri fare modeli kullanılarak FACS (Şekil 1)
    1. FACS arabelleği
      1. Ca2+ ve Mg2+olmadan dPBS'de %5 fetal sığır serumunun (FBS) 15 mL'sini hazırlayın. Buzda veya 4°C'de saklayın.
    2. FC bloker çözümü
      1. 0,5 μL FC bloker (saflaştırılmış anti-fare CD16/CD32) 25 μL FACS (1:50 seyreltme) hazırlayın. Numune başına 25 μL FC bloker çözeltisi gereklidir. Buzda veya 4 °C'de saklayabilirsiniz.
    3. Numune hazırlama ve antikor boyama
      NOT: Antikor seyreltmeleri önceden hazırlanabilir, ancak bu ışık veya ısıya maruz kalma riski olabilir.
      1. 7AAD veya Ghost boya mor 510 2x FACS tampon gerekli seyreltme hazırlayın. Antikorlar ve seyreltmeler için Tablo 1'e bakınız.
      2. FC antikor bölgesinin FC reseptörüne spesifik olmayan bağlanmasını önlemek için 25 μL FC bloker çözeltisinde 500.000 yeni izole edilmiş hücreyi yeniden askıya alın. RT 5 dakika kuluçka.
      3. Hücre süspansiyonunun 25°L'lik son hacmine 7AAD veya Ghost boya sımen 510 antikor ekleyin. Karanlıkta buz üzerinde 30-60 dakika kuluçka.
      4. 1 mL FACS arabelleği nde yeniden susallayarak yıkayın. 4°C'de 5 dk için 500 x g santrifüj.
      5. FACS tamponunun (300 μL) önerilen akış sitometrisi örnek hacminde peleti resuspend ve akış sitometri tüpüne aktarın.
    4. Floresan aktive hücre sıralama (FACS)
      NOT: GFP-αSMA muhabiri fareler Dr Ivo Kalajzic bir katkı vardı11. Bu fare alfa düz kas hücresi altında GFP ifade (αSMA) organizatörü. αSMA aktif fibroblastların (miyofibroblastlar) bir belirteci olarak kullanılmıştır12.
      1. Aktive fibroblast (αSMA ifade miyofibroblast) izolasyonu için, koroner arter ligasyonu ile 12 haftalık GFP-αSMA farelerde miyokard infarktüsünü indükler. Fareleri yaralanmadan 8-10 gün sonra kurban edin.
      2. Yaralı farelerin kalplerinden tek hücreli süspansiyon sonrasında, yeşil floresan protein (GFP) için αSMA+ve fibroblastları sıralayın. GFP kanalında arka plan sinyalini telafi sonrası ayarlamak için lekesiz yaralanmamış fibroblastlar kullanın.
      3. 7AAD-ve/GFP+ve hücreleri veya Ghost boya mor 510-ve/GFP+ve hücreleri ve αSMA+ve miyofibroblastları ifade eden GFP'yi sıralayarak canlı GFP+ve hücreleri için kapı. Fibroblast ortamda hücreleri toplamak.
  3. Fibroblast izolasyonu: fibroblastların manyetik boncuk bazlı izolasyonu (Şekil 1)
    1. Denklik tamponu
      NOT: Yalıtımlar için her zaman taze arabellek hazırlayın.
      1. PBS'de %0.5 BSA ve 2 mM EDTA hazırlayın. Kabın kapağına bir vakum takarak çözeltiyi karıştırarak tamponu degas edin.
        NOT: Karıştırma, vakumdan çıkarılan çözeltiden fazla gazı kaldırır, bu nedenle kabarcıklar kullanımda ayırma sütununu tıkamaz.
    2. Manyetik etiketleme: CD45+ hematopoetik hücreler
      1. 5 dk için 500 x g fare kalplerinden izole hücreleri santrifüj, sonra supernatant kaldırın.
      2. Hücre peletini 1 mL'lik denge tamponunda yeniden askıya alın. Hemositometre kullanarak hücreleri say.
      3. Hücre süspansiyonuna yukarıdaki gibi santrifüj edin ve hücre peletini 1 x 107 toplam hücre başına 90 μL denge tamponu halinde yeniden askıya alın. 1 x 107 toplam hücre başına 10 μL CD45+ manyetik boncuk ekleyin. İyice karıştırın ve 4°C'de en az 15 dakika kuluçkaya yatırın.
      4. Hücreleri 1 x 107 toplam hücre başına 2 mL denge tamponu ekleyerek yıkayın, ardından 4°C'de 10 dakika boyunca 500 x g'de santrifüj edin.
      5. Supernatant çıkarın, bir hemositometre kullanarak hücreleri saymak ve 2 mL denge tampon 1 x 107 toplam hücreleri yeniden askıya. 10'dan fazla7 hücre varsa, arabelleği doğrusal olarak ölçeklendirin. Hücre kümelerinin ayırma sütun matrisini tıkamasını önlemek için hücreleri 40 μm'lik bir filtreden geçirin.
    3. Manyetik ayırma: CD45+ hematopoetik hücreler
      1. Ayırma sütununu uygun bir ayırıcının manyetik alanına yerleştirin ve en az 3 mL PBS ile denge sütunu yerleştirin.
      2. Akışta (FT) etiketlenmemiş hücreleri toplayın ve 3 mL'lik denge arabelleğiyle sütun 3x yıkayın. FT ile yıkar toplamak. Sütunu 15 mL konik bir tüpüzerine yerleştirin.
      3. 5 mL'lik denge tamponu sütunun üzerine boru landırarak ve hücreleri kolonla birlikte verilen bir pistonla sıkıca dalan manyetik etiketli CD45+ hücreleri dışarı atın.
      4. Santrifüj eluent yanı sıra FT / yıkama fraksiyonları 500 x g. Hemositometre kullanarak hücreleri say.
    4. Manyetik etiketleme ve ayırma: CD31+ endotel hücreleri
      1. CD45+ manyetik etiketleme ve ayırma (bölüm 2.3.2-2.3.3) için tekrar protokol, CD31+ manyetik boncuklar CD45+ izolasyon dan FT ve yıkama bölümleri ile kuluçka için kullanmak dışında.
    5. Manyetik etiketleme ve ayırma: MEFSK4+ fibroblastlar
      1. MANYETIK boncuklar yerine MEFSK4 anti-besleyici-APC antikor kullanarak CD45+ manyetik etiketleme için protokolü tekrarlayın. 5 dk için 500 × g CD31+ izolasyon FT ve Yıkama kısımları santrifüj, sonra supernatant kaldırın. Hücre peletini 1 mL'lik denge tamponunda yeniden askıya alın ve hemositometre kullanarak hücreleri sayın.
      2. 1 x 107 hücre başına 10 μL MEFSK4 anti-besleyici-APC antikor ekleyin. 4 °C'de en az 15 dakika kuluçka.
      3. MEFSK4 antikor bağlı hücreleri 1 x 107 toplam hücre başına 5 mL denge tamponu ekleyerek yıkayın, ardından 5 000 x g'de 5 dk santrifüj edin.
      4. Kullanılan MEFSK4 anti-besleyici-APC antikor aynı hacmi kullanarak, anti-APC boncuklar supernatant çıkarın ve resuspend. 4 °C'de 15 dakika buz üzerinde kuluçka.
      5. 10 dk. 500 x g'da santrifüj, 1 x 107 toplam hücre başına 2 mL denge tamponu ile resuspend ve daha önce açıklandığı gibi manyetik ayırma ile devam edin (bölüm 2.3.3). Manyetik olarak ayrılmış MEFSK4+ve/ CD45-ve/CD31-ve fibroblastlar saflık analizleri ve diğer downstream uygulamaları için kullanılabilir.

3. İzole Fibroblast Popülasyonunun Saflık ve İşlevsellik Analizi

  1. FACS popülasyon saflık analizi: αSMA-GFP hücre analizi (Şekil 2)
    1. Antikorların spesifik olmayan bağlanmasını önlemek için 25 μL Fc bloker çözeltisinde yeni izole edilmiş hücreleri yeniden askıya alın. RT 5 dakika kuluçka.
    2. İsteğe bağlı: hücre süspansiyonuna 25 μL 7AAD veya Ghost boya mor 510 ekleyin. Karanlıkta buz üzerinde 30-60 dakika kuluçka.
    3. 1 mL FACS arabelleği nde yeniden susallayarak yıkayın. 5 dk için 500 x g santrifüj.
    4. 50 μL FACS tamponunda peleti yeniden askıya alın. CD31-PE, CD45-APC ve AN2/NG2 antikorlarını doğrudan hücre süspansiyonuna ekleyin. Buz üzerinde 15 dakika kuluçka (Tablo 1).
    5. 1 mL FACS arabelleği nde yeniden susallayarak yıkayın. Santrifüj 400 x g 5 dk.
    6. Eşeği anti-rat AlexaFluor 405 ikincil antikor unconjugated primer antikor ile etiketlenmiş hücrelere ekleyin. Buz üzerinde 30 dakika kuluçka.
    7. 1 mL FACS arabelleği nde yeniden susallayarak yıkayın. Santrifüj 400 x g 5 dk.
    8. FACS tamponunun (300 μL) önerilen akış sitometrisi numune hacminde peleti resuspend ve akış analizi için etiketli akış sitometri tüpüne aktarın.
      NOT: Mefsk4 antijeninin izole fibroblastlar üzerindeki ekspresyonunu karakterize eden FACS analizi bölüm 3.3'te tanımlanmıştır.
  2. Fibroblast saflık analizi: immünoresans (Şekil 3A)
    1. Tohum 30.000 primer fibroblastlar (P0-P1) kapaklar üzerinde iyi başına 24 iyi plaka ve kültür% 80 konfluent yerleştirilir. Veya 400 x × g (bir 24 iyi plaka bir coverslip üzerine hücreleri doğrudan ve eşit olarak yatırmak için kullanılan bir yöntem) 400 x × g (bir coverslip tarafından coverslip üzerinde sıralanmış CD45+ ve CD31+ hücreleri (kuyu başına 30.000 hücre) konsantre.
    2. Hücreleri 15 dk soğuk aseton ile düzeltin.
    3. %10 keçi serumundaki slaytları bloke edin. Bir gecede primer antikorlar içeren kuluçka slaytları(Tablo 2).
    4. Slaytları PBS'de 3 x yıkayın. 2 saat boyunca inkübat sekonder antikorlar (Tablo 2).
    5. Counterstain slaytlar ve yavaş soluk montaj ortamda DAPI bir damla ile monte.
  3. FACS nüfus saflık analizi: MEFSK4 probing (Şekil 3B)
    1. Antikorların spesifik olmayan bağlanmasını önlemek için FC bloker çözeltisinin 25 μL'lik yeni izole hücrelerini yeniden askıya alın. RT 5 dakika kuluçka.
    2. İsteğe bağlı: hücre süspansiyonuna 25 μL 7AAD veya Ghost boya mor 510 ekleyin. Karanlıkta buz üzerinde 30-60 dakika kuluçka.
    3. 1 mL FACS arabelleği nde yeniden susallayarak yıkayın. 5 dk için 500 x g santrifüj.
    4. 50 μL FACS tamponunda peleti yeniden askıya alın. DOĞRUDAN hücre süspansiyonuna MEFSK4 antikorekleyin. Buz üzerinde 15 dakika kuluçka (Tablo 1).
    5. 1 mL FACS arabelleği nde yeniden susallayarak yıkayın. Santrifüj 400 x g 5 dk.
    6. Hücrelere fare IgG-APC ekleyin (Tablo 1). Buz üzerinde 30 dakika kuluçka.
    7. 1 mL FACS arabelleği nde yeniden susallayarak yıkayın. Santrifüj 400 x g 5 dk.
    8. FACS tamponunun önerilen akış sitometrisi numune hacminde (300 μL) pelleti resuspend ve akış analizi için akış sitometri tüpüne aktarın.
  4. Fibroblast saflık analizi: yarı kantitatif gerçek zamanlı rtPCR (Şekil 3C)
    1. RNA izolasyonu ve yarı kantitatif gerçek zamanlı PCR
    2. Fibroblastların zenginleştiriminin ardından RNA izolasyon kiti kullanarak RNA'yı izole edin (bkz. Malzeme Tablosu). Üreticinin talimatlarına uyun.
    3. Üreticinin talimatlarına uyarak cDNA sentez kiti (Bkz. Malzemeler Tablosu)kullanarak ilk iplikçik DNA sentezini tamamlayın.
    4. Yarı kantitatif gerçek zamanlı PCR5gerçekleştirin.
  5. Fibroblast işlevsellik analizi: kollajen jel kontraktilite tahlil (Şekil 4)
    1. Kollajen çözeltisi
      1. DMEM'de 20 mM HEPES ve 44 mM NaHCO3 hazırlayın. HEPES ve NaHCO3ile DMEM 1 mL başına tip 1 sıçan kollajen 1.67 mg ekleyin.
    2. TGFβ destekli DMEM
      1. DMEM antibiyotik ve anti-mantar ile birlikte% 10 FBS hazırlayın. TGFβ'yı 1 ng/mL'lik son konsantrasyona ekleyin.
    3. Hücre/kollajen karışımı ve kaplama
      1. Hücre süspansiyonu (P3-P5) hazırlayın ve 3.3 x 105 hücre elde etmek için gerekli hacmi belirleyin.
      2. 1 mL toplam hacim elde etmek için yeterli kollajen çözeltisi için 3,3 x 105 hücreleri ile süspansiyon hacmi ekleyin.
        NOT: Sıçan kollajen tip 1 konsantrasyonu şimdi 1.5 mg/mL olmalıdır.
      3. Bir 48 iyi plaka, tohum 300 ° L hücre-kollajen karışımı başına iyi (~ 1 x 105 hücre / iyi). 37 °C'de 15-20 dk jöleye kadar kuluçkaya yatırın.
      4. Kuyu duvarlarından jel ayırmak için 30 G iğne kullanın. Her kuyuya 600 μL TGFβ ve FBS destekli DMEM ekleyin. 24 saat ve 48 saat aynaklı bir tarayıcıda görüntü plakaları.
        NOT: Tüm İmmünofloresans deneyleri üç lazer (405 nm, 488 nm ve 640 nm) ile donatılmış bir akış sitometri makinesi nde yapıldı. Veriler, akış verisi edinme yazılımı(Tablo Of Materials)kullanılarak elde edilmiştir. Daha fazla veri analizi akış veri analizi yazılımı kullanılarak yapılmıştır. AlexaFluor 405 ve Ghost Dye Violet 510 405 nm lazer ile heyecanlı ve 450/50 BP ve 525/50 BP filtre kullanılarak toplanan, sırasıyla. GFP ve PE 488 nm lazer tarafından heyecanlı ve 530/30 BP ve 575/26 BP filtreleri kullanılarak toplanan, sırasıyla. Ya APC veya AlexaFluor 647 640 nm lazer tarafından heyecanlı ve 670/14 BP filtre kullanılarak toplanan. Tüm hücre sıralama deneyleri dört lazer (405 nm, 488 nm, 561 nm ve 640 nm) ile donatılmış bir akış sitometri makinesi(Malzeme Tablosu)üzerinde yapılmıştır. 7-AAD 561 nm lazer kullanarak heyecanlı ve 670/14 BP filtre ile toplanan. GFP ve Ghost Boya Violet 510 yukarıda açıklandığı gibi aynı lazer / filtre kombinasyonları kullanılarak toplanmıştır. Tüm sıralama deneyleri hedef hücrelerin daha düşük canlılığı için 17 psi basınç yapılandırması ile 100 um meme kullanılmıştır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

ΑSMA-GFP muhabiri fareler kullanılarak miyofibroblast izolasyonu gösteren akış şeması
Yaralanmamış kalpler αSMA-GFP muhabiri fare modelinde tespit edilebilir GFP+ hücreleri göstermedi; bu nedenle, gfp kanalının arka plan sinyali için bir geçit kurmak için kullanılmıştır sonra-tazminat (Şekil 2). αSMA+ hücreleri MI'den 10 gün sonra yaralı sol ventrikülden GFP ekspresyonunun varlığına göre sıralandı. Endotel (GFP+/CD31+ hücrelerinin küçük bir yüzdesi; ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Fibroblastlar, çeşitli belirteçler kümesi ile tanımlanan heterojen bir hücre grubudur. Fibroblastları tanımlamak için kullanılan protein belirteçleri diskoidin etki alanı reseptörü 2 (DDR2), fibronektin, vimentin, kollajen I ve III ve Thy115,16,17,18,19,20. Vimentin yaralanmamış quiescent kardiyak fibroblastlar tanımlamak içi...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Teşekkürler

Yazarlar Dr. Ivo Kalaycı'ya αSMA-GFP fareleri için teşekkür etmek istiyorlar. Bu yayında bildirilen araştırma, Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) Ulusal Tıp Bilimleri Enstitüsü (NIH) tarafından R01GM118300 (S.S.), Ulusal Biyomedikal Görüntüleme ve BIYOmühendislik Enstitüsü (S.S.) altında desteklenmiştir. Ödül Numarası R21EB019509 (P.P.Y.) ve Amerikan Kalp Derneği Bilim Adamı Geliştirme Hibe si 17SDG33630187 (S.S.) altında. Vanderbilt Ingram Kanser Merkezi (P30 CA68485) ve Vanderbilt Sindirim Hastalığı Araştırma Merkezi (DK058404) tarafından desteklenen VUMC Flow Sitometri Ortak Kaynak'ta akış sitometrisi analizleri yapıldı.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Reaktifler< / güçlü >
Aseton
Anti-fungal (Amfoterisin B-çözünür; Mantar bölgesi)Sigma AldrichA9528
Sığır Serium Albümini (BSA)Sigma9048-46-8
Kalsiyum klorür
Sitrat Tampon
Kollajenaz karışımı (Liberaz Blendzyme 3 TH)Roche Uygulamalı Bilimler
DAPI
DDI suyu
L-Glutamin ve HEPESLife teknolojilerine
Dnase I(20U/mL)BioRad7326828
Dulbecco'nun Ca2+ ve Mg2+Gibco içermeyen Fosfat Tamponlu Salin (dPBS)13190-144
%70 Etanol
anti-fare CD16 / CD32)Tonbo Biosciences70-0161
Fetal Sığır Serumu (FBS)Yaşam teknolojileri16000044
% 10 keçi serumu
Hank'in Ca2 + ve Mg2 + ile Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS)Corning21-023-CV
1M HEPESCorning25-060-Ci
Krebs-Henseleit Tampon tozuSigmaK3753
Mycoplasma profilaktik (Plazmosin)İnvivojenant-mpp
Penisilin / StreptomisinThermo Fisher Scientific15140122
1x Fosfat Tamponlu Salin (PBS)
10x Kırmızı Kan Hücresi Lizis TamponuMiltenyi130-094-183
Yavaş Solan Montaj Ortamı
Sodyum azid
Sodyum bikarbonat
TGF ve beta;
Tripan Mavi Leke (% 0.4)Gibco15250-061
Tip 1 Sıçan Kollajen
Antikorlar< / güçlü >
7AAD (stok: DMSO'da 1 mg / mL çözelti)Moleküler ProblarA1310seyreltme = 1: 1000; RRID =
CD45-APCBD Bioscience559864seyreltme = 1:200; RRID =
AB_398672 CD31-PEBD Bioscience553373seyreltme = 1:200; RRID = AB_394819
CD31BD Biosciences553370seyreltme = 1:250; RRID = AB_394816
CD45BD Biosciences553076seyreltme = 1:250; RRID = AB_394606
SÜTUN 1 & alfa; 1MD Biyoürünler203002seyreltme = 1:1000; RRID =
Hayalet boya menekşe 510 (Formülasyon: DMSO'da 1 uL / test)Tonbo Biosciences13-0870seyreltme = 1:1000; RRID =
Keçi anti-fare Alexa Fluor 488Moleküler ProblarA11029seyreltme = 1:200; RRID = AB_138404
Keçi anti-tavşan-Cy3Southern Biotech4050-02seyreltme = 1:200; RRID = AB_2795952
Keçi anti-tavşan-FITC,Jackson İmmünoaraştırma Laboratuvarları711-165-152seyreltme = 1:200; RRID = AB_2307443
Keçi sıçan önleyici Alexa Fluor 488Moleküler ProblarA11006seyreltme = 1:200; RRID = AB_2534074
Keçi sıçan önleyici Alexa Fluor 647Thermo-FisherA21247seyreltme = 1:200; RRID = AB_141778
PeriostinSanta CruzSC67233seyreltme = 1:100; RRID = AB_2166650
VimentinSigma AldrichV2258seyreltme = 1:200; RRID = AB_261856
&alfa;-düz kas aktini (&alfa;SMA)Sigma AldrichA2547seyreltme = 1:1000; RRID = AB_476701
Fibroblast spesifik protein 1 (FSP1)Millipore 07-227407-2274seyreltme = 1:100; RRID = AB_10807552
CD45 Manyetik BoncuklarMiltenyi Biotec130-052-301
CD31 Manyetik BoncuklarMiltenyi Biotec130-087-418
Besleyici önleyici hücreler-APC (MEFSK4)Miltenyi Biotec130-102-900seyreltme = 1:100; RRID = AB_2660619
anti-APC BoncukMiltenyi Biotec130-090-855
Sıçan IgG-APCMiltenyi Biotec130-103-034seyreltme = 1:100; RRID = AB_2661598
Eşek sıçan önleyici Alexa Fluor405Abcamab175670seyreltme = 1:100
anti-AN2/NG2Miltenyi Biotec130-097-455seyreltme = 1:11; RRID = AB_2651235
Diğer Malzemeler
0.22 ve mikro; m FiltreThermo Scientific723-2520
10 cm2 Hücre Kültürü KabıCorning430167
10 mL PipetFisherbrand13-678-11E
40 & mikro; m Hücre SüzgeciFisherbrand22363547
5 mL PipetFisherbrand13-678-11D
50 mL Konik TüpFalcon352070
6 kuyulu PlakaCorning3506
Akış Sitometri TüpleriFalcon352058
Forseps
Rocker
Tek Kenar BıçağıPAL62-0177
Cerrahi Makas
GFP-&alfa;SMA Muhabir Fareler
MACS Ayırıcı Manyetik Alan
MACS Ayırma Kolonu
Lameller
Qaigen Rneasy Mini KitQaigen74104
Ambion RNAqueous Mikro Toplam İzolasyon KitiAmbionAM1931
BioRad iScript cDNA Syntehsis KitiBioRad1708891
48 Kuyulu Plaka
30G İğne
Sitometri Makinesi (BD LSRFortessa)BD Biosciences
4 Lazer Akışı Sitometri Makinesi (BD FACSAria III)BD Biosciences
Akış Verisi Toplama Yazılımı (BD FACSDiva Software v8.0a)BD Biosciences
Akış Veri Analiz Yazılımı (FlowJo Software)BD Biosciences
sahip DI su DMEM-F12 11330057 FC Blokeri (Saflaştırılmış), , 3 Lazer Akış

Kaynaklar

  1. Ivey, M. J., Tallquist, M. D. Defining the Cardiac Fibroblast. Circulation Journal. 80 (11), 2269-2276 (2016).
  2. Prabhu, S. D., Frangogiannis, N. G. The Biological Basis for Cardiac Repair After Myocardial Infarction: From Inflammation to Fibrosis. Circulatory Research. 119 (1), 91-112 (2016).
  3. Duan, J., et al. Wnt1/betacatenin injury response activates the epicardium and cardiac fibroblasts to promote cardiac repair. EMBO Journal. 31 (2), 429-442 (2012).
  4. Shinde, A. V., Frangogiannis, N. G. Fibroblasts in myocardial infarction: a role in inflammation and repair. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 70, 74-82 (2014).
  5. Saraswati, S., Marrow, S. M. W., Watch, L. A., Young, P. P. Identification of a pro-angiogenic functional role for FSP1-positive fibroblast subtype in wound healing. Nature Communications. 10 (1), 3027(2019).
  6. Kong, P., Christia, P., Saxena, A., Su, Y., Frangogiannis, N. G. Lack of specificity of fibroblast-specific protein 1 in cardiac remodeling and fibrosis. American Journal of Physiology -Heart and Circulatory Physiology. 305 (9), 1363-1372 (2013).
  7. Furtado, M. B., Nim, H. T., Boyd, S. E., Rosenthal, N. A. View from the heart: cardiac fibroblasts in development, scarring and regeneration. Development. 143 (3), 387-397 (2016).
  8. Stellato, M., Czepiel, M., Distler, O., Blyszczuk, P., Kania, G. Identification and Isolation of Cardiac Fibroblasts From the Adult Mouse Heart Using Two-Color Flow Cytometry. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 6, 105(2019).
  9. Ackers-Johnson, M., et al. A Simplified, Langendorff-Free Method for Concomitant Isolation of Viable Cardiac Myocytes and Nonmyocytes From the Adult Mouse Heart. Circulatory Research. 119 (8), 909-920 (2016).
  10. Saraswati, S., Marrow, S. M. W., Watch, L. A., Young, P. P. Identification of a pro-angiogenic functional role for FSP1-positive fibroblast subtype in wound healing. Nature Communications. 10 (1), 3027(2019).
  11. Kalajzic, Z., et al. Use of an alpha-smooth muscle actin GFP reporter to identify an osteoprogenitor population. Bone. 43 (3), 501-510 (2008).
  12. Travers, J. G., Kamal, F. A., Robbins, J., Yutzey, K. E., Blaxall, B. C. Cardiac Fibrosis: The Fibroblast Awakens. Circulatory Research. 118 (6), 1021-1040 (2016).
  13. Bell, E., Ivarsson, B., Merrill, C. Production of a tissue-like structure by contraction of collagen lattices by human fibroblasts of different proliferative potential in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 76 (3), 1274-1278 (1979).
  14. Montesano, R., Orci, L. Transforming growth factor beta stimulates collagen-matrix contraction by fibroblasts: implications for wound healing. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 85 (13), 4894-4897 (1988).
  15. Goldsmith, E. C., et al. Organization of fibroblasts in the heart. Developmental Dynamics. 230 (4), 787-794 (2004).
  16. Bagchi, R. A., Lin, J., Wang, R., Czubryt, M. P. Regulation of fibronectin gene expression in cardiac fibroblasts by scleraxis. Cell Tissue Research. 366 (2), 381-391 (2016).
  17. Goodpaster, T., et al. An immunohistochemical method for identifying fibroblasts in formalin-fixed, paraffin-embedded tissue. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 56 (4), 347-358 (2008).
  18. Chapman, D., Weber, K. T., Eghbali, M. Regulation of fibrillar collagen types I and III and basement membrane type IV collagen gene expression in pressure overloaded rat myocardium. Circulatory Research. 67 (4), 787-794 (1990).
  19. Vasquez, C., Benamer, N., Morley, G. E. The cardiac fibroblast: functional and electrophysiological considerations in healthy and diseased hearts. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 57 (4), 380-388 (2011).
  20. Hudon-David, F., Bouzeghrane, F., Couture, P., Thibault, G. Thy-1 expression by cardiac fibroblasts: lack of association with myofibroblast contractile markers. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 42 (5), 991-1000 (2007).
  21. Kanisicak, O., et al. Genetic lineage tracing defines myofibroblast origin and function in the injured heart. Nature Communications. 7, 12260(2016).
  22. Pinto, A. R., et al. Revisiting Cardiac Cellular Composition. Circulatory Research. 118 (3), 400-409 (2016).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Miyofibroblast zolasyonuH cre zolasyonuAk SitometrisiManyetik Ay rmaDiferansiyel PlaklamaFloresanla Aktive Edilmi H cre Ay klamaAlpha SMA GFP FareleriMEFSK4 AntijeniKolajen Kontraksiyonu
Erişkin Kardiyak Fibroblastlar ve Miyofibroblastların İzolasyon ve Karakterizasyonu
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.