Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Fizyolojik Koşullar altında Domuz Kalpleri Dilimleme ve Culturing

17.6K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/60913

⸱

20 Mart 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Molecular Cardiology, Department of Medicine, University of Louisville, 2Department of Bioengineering, University of Louisville, 3Diabetes and Obesity Center, Department of Medicine, University of Louisville, 4Department of Pharmacology and Toxicology, University of Louisville, 5Institute of Cardiovascular Sciences, University of Manchester, 6Faculty of Pharmacy, Zagazig University

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Bu protokol, 6 gün boyunca fizyolojik koşullar altında kalp dokusunun nasıl dilimlenir ve kültürlenir. Bu kültür sistemi yeni kalp yetmezliği terapötik etkinliğini test etmek için bir platform olarak yanı sıra bir 3D kalp modelinde akut kardiyotoksisite güvenilir test olarak kullanılabilir.

Özet

Birçok yeni ilaçlar şu anda mevcut in vitro tahliller ve in vivo hayvan modelleri kötü insan kardiyak yükümlülüklerini tahmin olarak kardiyotoksik yan etkileri nedeniyle klinik çalışmalarda başarısız, ilaç endüstrisi üzerinde multi-milyar dolarlık bir yük poz. Bu nedenle, pahalı ve zaman alıcı 'insan ilk' denemeler üstlenmeden önce ilaç kardiyotoksisite belirlemek için daha iyi yaklaşımlar için dünya çapında karşılanmamış tıbbi ihtiyaç vardır. Şu anda, sadece olgunlaşmamış kalp hücreleri (insan kaynaklı pluripotent kök hücre kaynaklı kardiyomiyositler [hiPSC-CMs]) onlar uzun süre kültürlenebilir tek insan kalp hücreleri olarak terapötik verimlilik ve ilaç toksisitesi test etmek için kullanılır uyuşturucu etkinliğini ve toksisitesini test etmek için gereklidir. Ancak, tek bir hücre tipi birden fazla hücre tipi oluşan karmaşık 3D kalp dokusunun fenotip kopyalayamaz. Daha da önemlisi, ilaçların etkisi yetişkin kardiyomiyositler üzerinde test edilmesi gerekir, hangi farklı özellikleri ve toksisite yanıtları olgunlaşmamış hiPSC-CMs ile karşılaştırıldığında. Bu teknoloji, insan kalp dokusunu taklit eden ve insan miyokardinin fizyolojik veya patolojik koşullarını yansıtan tam bir çok hücreli sisteme erişim sağlar. Son zamanlarda, kültür medya bileşenlerinin optimizasyonu ve kültür koşulları nın 1.2 Hz'de sürekli elektriksel uyarımı ve kültür ortamının aralıklı oksijenletılmasını içermesi ile, yaşanabilirliği koruyan yeni bir kültür sistemi kurulumu geliştirdik. ve kültürde 6 gün boyunca insan ve domuz kalp dilimleri işlevselliği. Mevcut protokolde, domuz kalbini dilimleme ve dilimleme yöntemini örnek olarak ayrıntılı olarak açıklıyoruz. Aynı protokol insan, köpek, koyun veya kedi kalplerinden gelen kültür dilimleri için kullanılır. Bu kültür sistemi preklinik ve klinik test sonuçları arasındaki boşluğu kapatır akut kardiyotoksisite testi için yerinde güçlü bir tahmine sahip insan olma potansiyeline sahiptir.

Giriş

İlaca bağlı kardiyotoksisite piyasa çekilmesi önemli bir nedenidir1. 20. yüzyılın son on yılında, sekiz non-kardiyovasküler ilaçlar piyasadan çekildi onlar ventriküler aritmiler nedeniyle ani ölümle sonuçlandı2. Buna ek olarak, çeşitli anti-kanser tedavileri (birçok durumda etkili iken) kardiyomiyopati ve aritmiler de dahil olmak üzere çeşitli kardiyotoksik etkilere yol açabilir. Örneğin, hem geleneksel (örneğin, antrasiklinler ve radyasyon) ve hedeflenen (örneğin, trastuzumab) meme kanseri tedavileri hastaların bir alt kümesinde kardiyovasküler komplikasyonlara neden olabilir3. Kardiyologlar ve onkologlar arasında yakın bir işbirliği ("kardiyo-onkoloji" gelişmekte olan alan üzerinden) hastaların etkili bir şekilde tedavi edilebilir sağlanması bu komplikasyonları yönetilebilir hale yardımcı oldu2. Her2 ve PI3K inhibitörleri de dahil olmak üzere yeni ajanların kardiyovasküler etkileri daha az belirgindir, özellikle tedaviler birlikte kullanıldığında. Bu nedenle, insan klinik çalışmalar öncesinde ortaya çıkan anti-kanser tedavileri ile ilişkili kardiyovasküler toksisite için güvenilir preklinik tarama stratejileri için artan bir ihtiyaç vardır. 24 saatten fazla işlevsel ve yapısal olarak uygulanabilir olan insan kalp dokusu için kültür sistemlerinin bulunmaması güvenilir kardiyotoksisite testi için sınırlayıcı bir faktördür. Bu nedenle, ilaç toksisitesi test etmek için fizyolojik koşullar altında insan kalp dokusu kültüriçin güvenilir bir sistem geliştirmek için acil bir ihtiyaç vardır.

Kardiyotoksisite testlerinde insan kaynaklı pluripotent kök hücre kaynaklı kardiyomiyositlerin (hiPSC-CMs) kullanımına yönelik son hamle, bu sorunu çözmek için kısmi bir çözüm sağlamıştır; ancak, hiPSC-CMs olgunlaşmamış doğası ve kalp dokusunun çok hücreli doğası ile karşılaştırıldığında doku bütünlüğünün kaybı bu teknolojinin önemli sınırlamalar vardır4. Yakın tarihli bir çalışma kısmen hidrojeller üzerinde hiPSC-CMs kardiyak dokuların imalatı ve zaman içinde elektriksel stimülasyon kademeli artışa tabi ile bu sınırlama üstesinden gelmiştir5. Ancak, elektromekanik özellikleri yetişkin insan miyokardinde görülen olgunluğa ulaşamadı. Ayrıca, kalp dokusu yapısal olarak daha karmaşıktır, endotel hücreleri de dahil olmak üzere çeşitli hücre tipleri oluşan, nöronlar ve stromal fibroblastlar çeşitli türleri ile birlikte hücre dışı matriks proteinlerinin çok özel bir karışımı ile bağlantılı6. Erişkin memeli kalpte kardiyomiyosit hücre popülasyonu7,8,9 bu heterojenlik tek tek hücre tipleri kullanılarak kalp dokusumodellemesinde önemli bir engeldir. Bu önemli sınırlamalar kalbin fizyolojik ve patolojik koşullarını içeren optimal çalışmalar için bozulmamış kardiyak doku kültürünü sağlamak için yöntemler geliştirmenin önemini vurgulamak5.

Culturing insan kalp dilimleri bozulmamış insan miyokardiyum umut verici bir modeldir. Bu teknoloji, insan miyokardinin fizyolojik veya patolojik koşullarını güvenilir bir şekilde yansıtabilecek insan kalp dokusuna benzeyen tam bir 3Boyutlu çok hücreli sisteme erişim sağlar. Ancak, kullanımı ciddi 2018 10,11,,12kadar bildirilen en sağlam protokolleri kullanarak 24 saat ötesine geçmez kültür, canlılık kısa süre ile sınırlı olmuştur.12 Bu sınırlama, dilimleri kültüre getirmek için hava-sıvı arabiriminin kullanımı ve kardiyak dokunun yüksek enerjik taleplerini desteklemeyen basit bir kültür ortamının kullanımı da dahil olmak üzere birden fazla faktörden kaynaklandı. Biz son zamanlarda sürekli elektrik stimülasyon sağlamak mümkün ve kadar 6 gün13için kardiyak doku dilimleri canlı tutmak için kültür medya bileşenleri optimize bir batık kültür sistemi geliştirdik. Bu kültür sistemi preklinik ve klinik test sonuçları arasındaki boşluğu kapatmak için akut kardiyotoksisite testi için yerinde güçlü bir tahmine sahip insan olma potansiyeline sahiptir. Mevcut makalede, bir örnek olarak bir domuz kalbi kullanarak kalp dilimleri dilimleme ve kültüriçin protokol ayrıntılı vardır. Aynı işlem insan, köpek, koyun veya kedi kalpleri için de uygulanır. Bu protokolle, teknolojiyi bilim camiasındaki diğer laboratuvarlara yaymayı umuyoruz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Tüm hayvan prosedürleri Louisville Üniversitesi'nin kurumsal yönergelerine uygun olarak ve Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanmıştır.

1. Dilimleme için hazırlık (Dilimlemeden Bir Gün Önce)

  1. Titreşimli mikrotomun hazırlanması
    1. Seramik bıçağı şu adımları izleyerek tutucuya yerleştirin: bıçağı dikkatlice açtıktan sonra keskin kenarı önce bıçak aletinin yuvasına yerleştirin. Daha sonra, tutucunun kollarındaki iki vidayı gevşeterek bıçağı tutucuya takın ve bıçağı her yıkayıcının altına kaydırın ve arka stoplara sıkıca geri itin. Bıçağı sabitlemek için vidaları sıkın.
      NOT: Vidalar aşırı sıkılaştırılmamalıdır.
    2. Kalibrasyon protokolünü ve araçlarını kullanarak bıçağı üreticinin protokolüne göre kalibre edin.
      NOT: Kısaca, bıçağın seyahat ekseni ile hizalanmasını kolaylaştırmak ve Z eksenindeki sapmaları en aza indirmek için titreşimli mikrotom sökülebilir bir kalibrasyon cihazı kullanır. Kalibrasyon cihazı cihaza takıldığında varlığı otomatik olarak algılanır ve titreşen mikrotom bıçağın genlik ve frekans ayarlarını en iyi şekilde bıçak hizalama hatasının ayarlanmasına olanak sağlayacak bir büyüklüğe ayarlamayı kontrol altına alır.
      1. En iyi hizalama değerlendirmesi için kesme kenarının kalibrasyon cihazına göre en uygun konumda olması için bıçağı otomatik olarak hareket ettirecek hizalama işlemini başlatmak için Dilim düğmesine basın. Z hizasının 1 μm'lik bir mesafede olduğundan emin olmak için sağlanan tornavidayı kullanarak bıçakta ayarlamalar yapmak için ekrandaki yönergeleri izleyin.
    3. Otoklav iç banyo ve titreşen mikrotom tüm metal parçaları.
  2. Büyük metal tepsileri (dilimleri toplamak ve elektrikstimülasyon plakası kapakları ıslatmak için), herhangi bir cam kap, düzenli dikdörtgen bıçaklar, forsepsler, makas, yazıcı zamanlama kayışı (6 mm genişliğinde parçalar halinde kesilmiş), metal yıkağılar ve 5 L çift distile su (ddH2O).
  3. Kardiyoplegic solüsyon ile kalp için bir adet 1 L kavanoz, bir adet 500 mL kavanoz ve bir plastik tepsi yi sterilize edin.
  4. Dilimleme Tyrode çözeltisinin 2 L'sini 2 L kabında hazırlayın.
    1. Dilimleme Tyrode çözeltisinin 1 L'si için 3 g/L 2,3-butanedione monoxime (BDM), 140 mM NaCl (8,18 g), 6 mM KCl (0,447 g), 10 mM D-glukoz (1,86 g), 10 mM HEPES (2,38 g), 1 mM MgCl2 (1 mL 1 M çözelti), 1,8 mM CaCl2 (1 MM çözelti1,8 mL), 1 L ddH2O. NaOH kullanarak pH'ı 7.40'a ayarlayın. Daha sonra çözeltiyi 1.000 mL, 0,22 m m, vakum filtresi/depolama sistemi kullanarak filtreleyin ve bir gecede 4 °C'de saklayın.
  5. Kardiyoplejik çözeltinin 4 L'sini hazırlayın.
    1. Kardiyoplegic çözeltinin 1 L'si için 110 mM NaCl (6,43 g), 1,2 mM CaCl2 (1 M Çözelti1,2 mL), 16 mM KCl (1,19 g), 16 mM MgCl2 (3,25 g), 10 mM NaHCO3 (0,84 g), 1 U/mL heparin, 1 L ddH2O.NaOH kullanarak pH'ı 7.40'a ayarlayın. Daha sonra çözeltiyi 1.000 mL, 0,22 m m, vakum filtresi/depolama sistemi kullanarak filtreleyin ve bir gecede 4 °C'de saklayın.
      NOT: Kardiyopleji çözeltisinde dilimleme gününe 1.000 U/L heparin ekleyin (bkz. adım 2.1).
  6. Yeni bir biyogüvenlik kabine orijinal şişe kültür orta 500 mL hazırlamak: mix orta 199, 1x insülin-transferrin-selenyum (ITS) takviyesi, 10% fetal sığır serum (FBS), 5 ng / mL vasküler endotelal büyüme faktörü (VEGF), 10 ng / mL FGF-temel, ve 2x antibiyotik-antimikotik. Filtre 0,22 μm, vakum filtre / depolama sistemi ile sterilize ve 4 ° C gecede saklayın.
    NOT: PH'ı ayarlamayın, kullanmadan önce VEGF ve FGF'yi taze olarak ekleyin.
  7. % 4 agar jel plakaları hazırlayın.
    1. 500 mL sterilize edilmiş bir şişeye 200 mL steril ddH2O ekleyin. Tartmak 8 g agarose, ve yavaşça şişe içine dökün. Bir mikrodalga 2 dakika kaynatın, sonra oda sıcaklığında 5 dakika soğutun.
    2. Her 100 mm Petri kabına 25 mL'lik bir biyogüvenlik kabinine dökün (6 tabak hazırlayın) ve katılaşmak için 1 saat bekleyin. Daha sonra tabakları parafin filmle kapatın, temiz sargı ile sarın ve 4 °C'de saklayın.
  8. Otoklavd ddH2O 200-proof mutlak etanol seyrelterek% 70 etanol 4 L hazırlayın.
  9. SterilddH2 O 2x antibiyotik-antimikotik hazırlayın: biyogüvenlik kabinesi altında 20 mL antibiyotik-antimikotik ile steril ddH2O 980 mL karıştırın.

2. Domuz Kalp Perfüzyon

  1. Kardiyoplegic çözeltinin her 1 L'sine 1 000 U/mL heparin 1 mL ekleyin. Çözeltiyi buzda tut.
    NOT: Doku kültür odasına transfer sırasında kalbin perfüzyonu ve korunması için en az 3 L gereklidir.
  2. Domuz ameliyathanesine aşağıdaki öğeleri alın: buz dolu büyük bir buz kovası, bir steril metal tepsi (kalp perfüzyonu için buz kovası üzerinde tutmak), bir sterilize 500 mL kavanoz, bir 1 L kavanoz (kardiyopleji çözeltisi geri doku kültür odasına kalp aktarmak için , buz üzerinde), ve bir sterilize plastik tepsi buz dolu (buz üzerinde kardiyoplejik çözüm tutmak için).
  3. 3 yönlü stopcock, 60 mL şırınga, 18 G kelebek iğne kateter ve kardiyoplegic solüsyon rezervuarına uzatma tüpü içeren yerinde kalp perfüzyon sistemi hazırlayın.
  4. Yorkshire erkek domuz (2−3 aylık, 20−25 kg) ilk ketamin (20 mg/kg)/xylazine (2 mg/kg) kokteyl intibak ile anestezi. Çene gerginliği kaybı ile uygun anestezi onaylayın. Daha sonra, ameliyathaneye domuz transfer, entübatve mekanik olarak daha önce açıklandığı gibi akciğerlerihavalandırmak 14.
  5. Anesteziyi %1,5−2 ile koruyun isoflurane.
  6. Sağ yan pozisyonda hayvan yerleştirin ve göğüs bölgesinden kürk tıraş. Alkol scrub ile cildi temizleyin, sonra% 10 (w / v) povison-iyot çözeltisi ile cerrahi site sterilize.
  7. 4interkostal alanda bir neşter kullanarak sol torakotomi kesi tarafından göğüs açın, ve göğüs açık tutmak ve kalp maruz kaburga arasında bir göğüs retraktör kullanın.
    NOT: Bu işlem için tüm sterilize aletleri kullanın.
  8. Kelebek iğne kateterini sol atriyuma yerleştirin ve iğneyi bir çanta ipi kapatmasıyla düzeltin. Bolus dozheparin (100 U/kg) intravenöz enjeksiyondan sonra, sol atriyal kateter ile 500 mL buz gibi kardiyoplegic solüsyon (kalp hızını yavaşlatmak için) ile kalbi yerinde perfüzyon başlar.
  9. %5 isoflurane ile domuzu derinden anestezi yedirin. Hızlı bir şekilde cerrahi makas ile göğüs kalbini dışarı çıkarmak. Aort aort bir aort kanül ile kanül ve vaskülature kan dışarı floş için buz gibi soğuk kardiyoplejik çözelti (100 mL / dk) başka bir 1 L ile in vitro kalp perpin.
  10. Kalp perfüzyonu sonrasında, kalbi buz gibi kardiyopleji solüsyonu ile dolu 1 L'lik bir kavanozda tutun ve doku kültür odasına transfer sırasında buzda tutun.

3. Domuz Kalp Dokusu Dilimleme

  1. Vibratom üzerinde doku banyosu kurmak, doku banyosu soğutma ceket buz ekleyin, sonra doku banyosu içine Tyrode çözeltisi ekleyin. Doku banyosu soğutma ceket erimiş buz bertaraf toplamak için 1 L plastik kavanoz ayarlayın.
  2. Biyogüvenlik dolabıaltında domuz kalbini 1 L taze soğuk kardiyoplejik solüsyon içeren bir tepsiye aktarın.
  3. Geri çekilebilir steril neşterler kullanarak sol ventrikül izole etmek için kalp diseksiyon. Daha sonra, jilet dikdörtgen bıçaklar kullanarak 1−2 cm3 her bloklar halinde sol ventrikül kesin. Dilimleme için tek parça kullanın ve gerekirse daha sonra kesmek için buz üzerinde soğuk Tyrode çözeltisi 50 mL tüp içinde kalan parçaları tutun.
    NOT: Özellikle bu ikinci blok ise, elile dilimleme önce doku masaj. Masaj doğru kas lif yapılandırması geri yardımcı olur ve kalp bloğu içinde herhangi bir sertlik önler.
  4. Metal numune tutucuya 1−2 damla doku tutkal(Malzeme Tablosu)ekleyin ve yaklaşık 1 cm2yüzey alanına sahip %4'lük agar bloğundan bir parça yapıştırın.
  5. Agar üzerine 1−2 damla doku tutkal ekleyin.
  6. Kalp bloğunu agar'a yapıştırın ve kardiyak epikardiyum tarafı doku tutkalına bakacak şekilde ve mümkün olduğunca düz olduğundan emin olun. Daha sonra, vibratom dilimleme banyosunda konumuna kalp bloğu ile doku tutucu aktarın.
  7. Dilimleme banyosu ve metal tepsi dilimleme banyosu (oksijenli Tyrode banyosu) toplamak için Tyrode çözeltisi ile dolu oksijen tüpü takın. Daha sonra, kesme den sonra dilimleri toplamak için metal tepsiye 40 μm hücresüzler ekleyin.
  8. Dilimleme konumunu ayarlama
    1. Vibratom işletim yazılımını ve gösterge panelini kullanarak bıçağın/numunenin yüksekliğini ayarlayın. Yükseklik düğmesini seçin ve yüksekliği ayarlamak için ekrandaki yönergeleri izleyin. İdeal olarak, bıçak doku üst yakın ama papiller kasların altında var ve dilimleme önce doku ve bıçak kapsayan sıvı olduğundan emin olun.
    2. İleri düğmesini seçerek dokuyu dilimlemeye başlayacağınız yeri ayarlayın. Dilim düğmesine basın ve bıçağı dokunun kenarına doğru hareket ettirmek için düğmeyi kullanarak hızı artırın. Ardından, durdurmak için tekrar dilime basın ve işlemi etkinleştirmek için önceden düğmesine basın.
    3. Kesme parametrelerini ayarlayın: ilerleme hızı = 0,03 mm/s, titreşim frekansı = 80 Hz ve yatay titreşim genliği = 2 mm. Ardından dilim düğmesini seçerek dilimlemeye başlayın.
    4. Vibratom un doku sonuna ulaşana kadar ancak numune tutucunun arka ucuna çarpmadan önce dilimlesin. Bu noktada, durdurmak için tekrar dilime basın. Başlangıç konumuna geri dönmek için İade düğmesine basın.
    5. Titreşen mikrotomun dilimleme işlemini 99 kez otomatik olarak tekrarlamasını sağlayacak otomatik yinelemeyi (iki kez tıklatarak) seçin.
  9. Dilimleri toplama
    1. Dilimler tam uzunlukta ve iyi görünene kadar bekleyin (papiller kas katmanları geçtikten sonra), sonra dilimleri toplamaya başlayın.
    2. Yavaşça banyodan doku kapmak için soğuk Tyrode's çözeltisi ile dolu plastik bir Pasteur pipet kullanarak dilimleri toplamak. Gerekirse, doku hala bağlı ise kalp bloğundan dilim ayrıştırmak için forceps ve bahar makas kullanın.
    3. Oksijenli Tyrode banyosunda bir hücre süzgeci için dilim aktarın (adım 3.7 bakınız) ve hücre süzgeçleri üzerinde düz yalan doku almak için plastik Pasteur pipet sıvı kullanın, sonra aşağı doku tutmak için üst bir metal yıkayıcı ekleyin.
      NOT: Dilimler işleme önce Tyrode çözeltisi en az 1 saat için kuluçkaya yatmalıdır (Bu BDM için doku dinlenmek için).

4. Culturing Kalp Dilimleri

  1. Dilimleri kültüre hazırlama
    1. Pürüzsüz kenarlardan kaçınmak için dilimi kenarlardan kırpın. Daha sonra, doku tutkal kullanılarak gömülü metal teller ile sterilize poliüretan 6 mm genişliğinde yazıcı zamanlama kemeri her iki ucundan tutkal.
    2. Desteklenen kalp dilimlerini her kuyuda 6 mL kültür ortamı içeren 6 kuyu plakasına aktarın.
    3. Stimülasyon plakası kapağını(Malzeme Tablosu)6 kuyu plakasının üstüne yerleştirin ve kapağı hücre kültürü elektrik stimülatörüne bağlayın (Malzeme Tablosu). Uyarıcıyı, kalp dilimlerini sürekli olarak 10 V, 1,2 Hz'de sürekli olarak uyarmak için ayarlayın.
      NOT: Uyarımı taktıktan sonra kalp dilimleri atmaya başlar ve bu hareket görsel olarak belirgin olacaktır.
    4. Plakaları bir kuvöze aktarın ve 37 °C'de nemli hava ve %5 CO2ile koruyun.
  2. Kültür ortamını günde 3 x değiştirin ve her ortam değişikliği sırasında her kuyu başına 6 mL kültür ortamı ekleyin.
    NOT: Kültür ortamı her ortam değişikliğinden önce 5 dakika oksijenlenir. Orta günde en az 1x değiştirilmelidir; gerekirse hafta sonları sorun yok. Günde sadece 1 ortam değişikliği iki gün test edilen maksimum.
  3. Kültür ortamında (genellikle gün ortası ortam değişimi sırasında) toksik grafit parçacıklarının salınımını önlemek için stimülasyon plakası kapağını her gün değiştirin.
    1. Uyarım plakası kapağını kültür çanağından çıkarın ve elektrik devresinin su hasarını önlemek için kapağın hücre kültürü elektrik uyarıcısı için kabloya bağlandığı beyaz köpük fişini takın.
    2. 2x antibiyotik-antimikotik ile otoklavlı su banyosunda plaka kapağı yerleştirin. Bu banyoda saklayın (yani, durulama banyosu) bir gecede.
    3. Ertesi gün, dekontamine 5−15 dakika için% 70 etanol banyo içine plaka kapağı hareket ettirin. Banyoları değiştirmeden önce cihazdan çok fazla sıvı çalkalayın.
    4. Daha sonra, otoklavlı su ve 2x antibakteriyel-antimikotik oluşan üçüncü ve son banyo (yani, temiz banyo), herhangi bir kalan etanol izleri durulamak için plaka kapağı aktarın.
    5. Temiz banyoda plaka kapağını duruladıktan sonra, plastik parçalar daki artık suyu kurutmak için temiz bir tüy bırakmayan mendil (etanol ile püskürtülür) kullanın, ardından beyaz köpük parçasını çıkarın ve plaka kapağını kültür plakasına dikkatlice yerleştirin.
      NOT: Cihaz artık steril olmayacağından, kuyuya giren siyah grafit elektrotlara dokunmayın.
    6. Steril çalgılar kullanarak, plaka kapağı doku dokunmaz böylece doku kuyunun merkezinde olduğundan emin olun. Plaka örtüsünün kavisli tarafının plakanın açılı tarafıyla eşleştiğinden ve kare köşelerin hizaya olduğundan emin olun.
      NOT: Stimülasyon plakası kapaklarının kontaminasyonunu en aza indirmek için, deneyi tamamladıktan sonra temiz ve boş 6 kuyu plakasında saklayın.
  4. Taze domuz kalp dilimleri (gün 0) üzerinde bir MTT tayini, kalsiyum ölçümleri ve kontraktil fonksiyon değerlendirmeleri gerçekleştirin ve Ou ve ark.13göre kültürde 6 gün sonra .

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Aynı anda sekiz 6 kuyu plakaları barındırabilir bir ticari hücre kültürü elektrik uyarıcı kullanarak, fizyolojik frekansta elektriksel stimülasyon indükleyerek yetişkin kardiyak ortam taklit (1.2 Hz), ve kültür fonksiyonel domuz kalp dilimleri süresini uzatmak için temel orta bileşenleri için taranmış13. Domuz ve insan kalpleri boyutu ve anatomi15benzer olduğundan, biz domuz kalpleri kullanarak bir biyomimetik kalp dilimi kültür sistemi geli...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Burada basitleştirilmiş orta iş batışı (48 dilim/cihaza kadar süreçler) akut kardiyotoksisiteyi test etmek için yeterince uzun bir süre domuz kalp dilimleri kültürünü sağlayan yöntem için son zamanlarda yayınlanan yöntemimiz için ayrıntılı video protokolünü açıklıyoruz13. Önerilen koşullar, elektriksel stimülasyon sıklığı, besin kullanılabilirliği ve aralıklı oksijenasyon da dahil olmak üzere kalbin çevresini taklit eder. Biyomimetik uyarılmış kültürümüzdeki kalp dilimlerinin uzun süreli canlılığı...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

TMAM Tenaya Therapeutics'de hisse senedi sahibidir. Diğer yazarlar çakışma bildirmez.

Teşekkürler

TMAM NIH hibe P30GM127607 ve Amerikan Kalp Derneği hibe 16SDG29950012 tarafından desteklenir. RB P01HL78825 ve UM1HL113530 tarafından desteklenir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
1.000 mL, 0.22 ve mikro; m, Vakum Filtresi/Depolama SistemleriVWR28199-812
2,3-Bütandion monoksit (BDM)FisherAC150375000
500 mL, 0.22 & m, Vakum Filtresi/Depolama SistemleriVWR28199-788
6 kuyulu C-Çanak Kapağı (elektrik-stimülasyon-plaka-kapak)İyon OptixCLD6WFC
6 kuyulu plakalarFisher08-772-1B
AgaroseBioline USABIO-41025
Antibiyotik-AntimikotikTermo15-240-062
C-Pace EM ( hücre kültürü-elektrik-stimülatörü)İyon OptixCEP100
Kalsiyum Klorür (CaCl2)FisherC79-500
Titreşimli Mikrotom için Seramik BıçaklarCampden Instruments7550-1-C
Cooley Göğüs EkartörüMillennium Surgical63-G5623
D-GlikozFisherD16-1
Tek Kullanımlık Neşter #20Biologyproducts.comDS20X
Falcon Hücre Süzgeçleri, Steril, CorningVWR21008-952
Fetal Sığır SerumuTermoA3160502
Graefe ForsepsFisherNC9475675
Heparin sodyum tuzuSigma-AldrichH3149-50KU
HEPESBalıkçıBP310-1
Histoakril MAVİ Doku yapıştırıcısıAmazonhttps://www.amazon.com/HISTOACRYL-FLEXIBLE-1051260P-Aesculap-Adhesive/dp/B074WB5185/
İris Yaylı makasFisherNC9019530
İris Düz MakasFisher731210
İzofluran, USPPiramalNDC 66794-017-25
ITS Sıvı Medya TakviyesiSigma-AldrichI3146-5ML
Ketamin HCl (500 mg / 10 mL)West-WardNDC 0143-9508
Magnezyum Klorür (MgCl2< / sub>)FisherM33-500
Mayo SuperCut Cerrahi MakasAROSurgical Instruments CorporationAROSuperCut & trade; 07.164.17
Orta 199, Earle's SaltsThermo11-150-059
Oksijen regülatörüPraxair
Oksijen tankları -Praxair
Plastik Pasteur pipetleriFisher13-711-48
Potasyum Klorür (KCl)Fisher
Yazıcı Triger KayışıAmazonhttps://www.amazon.com/Uxcell-a14081200ux0042-PRINTER-Precision-Timing/dp/B00R1J3KDC/
Jiletli dikdörtgen bıçaklarFisher12-640
Rekombinant İnsan FGF temelR& D Sistemleri233-FB-025/CF
Rekombinant İnsan VEGFAr-Ge D Systems293-VE-010 / CF
Geri çekilebilir neşterlerFisher22-079-716
Sodyum Bikarbonat (NaHCO3< / sub>)FisherAC217125000
Sodyum Klorür (NaCl)FisherAC327300010
Titreşimli MikrotomCampden Instruments7000 SMZ-2
Ksilazin HCl (100 mg / mL)Heartland Veteriner MalzemeleriNADA 139-236
AC193780010

Kaynaklar

  1. Onakpoya, I. J., Heneghan, C. J., Aronson, J. K. Post-marketing withdrawal of 462 medicinal products because of adverse drug reactions: a systematic review of the world literature. BMC Medicine. 14, 10(2016).
  2. Fermini, B., Fossa, A. A. The impact of drug-induced QT interval prolongation on drug discovery and development. Nature Reviews Drug Discovery. 2 (6), 439-447 (2003).
  3. Moslehi, J. J. Cardiovascular Toxic Effects of Targeted Cancer Therapies. The New England Journal of Medicine. 375 (15), 1457-1467 (2016).
  4. Robertson, C., Tran, D. D., George, S. C. Concise review: maturation phases of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Stem Cells. 31 (5), 829-837 (2013).
  5. Ronaldson-Bouchard, K., et al. Advanced maturation of human cardiac tissue grown from pluripotent stem cells. Nature. 556 (7700), 239-243 (2018).
  6. Pinto, A. R., et al. Revisiting Cardiac Cellular Composition. Circulation Research. 118 (3), 400-409 (2016).
  7. Kanisicak, O., et al. Genetic lineage tracing defines myofibroblast origin and function in the injured heart. Nature Communications. 7, 12260(2016).
  8. Fu, X., et al. Specialized fibroblast differentiated states underlie scar formation in the infarcted mouse heart. Journal of Clinical Investigations. 128 (5), 2127-2143 (2018).
  9. Kretzschmar, K., et al. Profiling proliferative cells and their progeny in damaged murine hearts. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (52), E12245-E12254 (2018).
  10. Perbellini, F., et al. Investigation of cardiac fibroblasts using myocardial slices. Cardiovascular Research. 114 (1), 77-89 (2018).
  11. Watson, S. A., et al. Preparation of viable adult ventricular myocardial slices from large and small mammals. Nature Protocols. 12 (12), 2623-2639 (2017).
  12. Kang, C., et al. Human Organotypic Cultured Cardiac Slices: New Platform For High Throughput Preclinical Human Trials. Scientific Reports. 6, 28798(2016).
  13. Ou, Q., et al. Physiological Biomimetic Culture System for Pig and Human Heart Slices. Circulation Research. 125 (6), 628-642 (2019).
  14. Jones, S. P., et al. The NHLBI-sponsored Consortium for preclinicAl assESsment of cARdioprotective therapies (CAESAR): a new paradigm for rigorous, accurate, and reproducible evaluation of putative infarct-sparing interventions in mice, rabbits, and pigs. Circulation Research. 116 (4), 572-586 (2015).
  15. Crick, S. J., Sheppard, M. N., Ho, S. Y., Gebstein, L., Anderson, R. H. Anatomy of the pig heart: comparisons with normal human cardiac structure. Journal of Anatomy. 193 (Pt 1), 105-119 (1998).
  16. Fischer, C., et al. Long-term functional and structural preservation of precision-cut human myocardium under continuous electromechanical stimulation in vitro. Nature Communications. 10 (1), 117(2019).
  17. Franke, J., Abs, V., Zizzadoro, C., Abraham, G. Comparative study of the effects of fetal bovine serum versus horse serum on growth and differentiation of primary equine bronchial fibroblasts. BMC Veterinary Research. 10, 119(2014).
  18. Vuorenpaa, H., et al. Novel in vitro cardiovascular constructs composed of vascular-like networks and cardiomyocytes. In Vitro Cellular & Developmental Biology - Animal. 50 (4), 275-286 (2014).
  19. Qiao, Y., et al. Multiparametric slice culture platform for the investigation of human cardiac tissue physiology. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 144, 139-150 (2018).
  20. Watson, S. A., et al. Biomimetic electromechanical stimulation to maintain adult myocardial slices in vitro. Nature Communications. 10 (1), 2168(2019).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Kalp Dokusu DilimlemeDomuz Kalp K lt rVibratom Kesit AlmaElektriksel Stim lasyonOksijenlendirilmi BesiyeriAkut KardiyotoksisiteMTT Canl l k AnaliziKontraktil Fonksiyon De erlendirmesiKalsiyum Transiyent l m
Fizyolojik Koşullar altında Domuz Kalpleri Dilimleme ve Culturing
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.