Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Bakteriyel Sürülerin Hızlandırılmış Görüntülemesi ve Kolektif Stres Tepkisi

7.9K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/60915

⸱

23 Mayıs 2020

 ,  , 
1Department of Molecular Biology & Biochemistry, University of California, Irvine, 2Department of Physics & Astronomy, University of California, Irvine, 3Department of Veterinary and Animal Sciences, University of Copenhagen

Bu makalede

Özet

Biz psödomonas aeruginosa sürüleri bakteriyofaj (faj) ve antibiyotik stres bir flatbed belge tarayıcı kullanarak yanıt yüksek çözünürlüklü zaman atlamalı filmler üretmek için basit bir yöntem detay. Bu prosedür, sürü dinamiklerini izlemek için hızlı ve basit bir yöntemdir ve diğer bakteri türlerinin hareketliliğini ve büyümesini incelemek için uyarlanabilir.

Özet

Swarming Pseudomonas aeruginosa ve Escherichia colidahil olmak üzere birçok bakteri türlerinde gözlenen yüzey hareketliliği bir şeklidir. Burada, yoğun bakteri popülasyonları, saat boyunca karakteristik tendril şekilli topluluklarda büyük mesafeler boyunca hareket eder. Swarming orta nem, nem ve besin içeriği de dahil olmak üzere çeşitli faktörlere duyarlıdır. Buna ek olarak, antibiyotik veya bakteriyofaj (faj) tarafından stresli P. aeruginosa gözlenen kolektif stres yanıtı, stres içeren alana yaklaşan sürüleri iter. Burada açıklanan yöntemler, sürücürün nasıl kontrol altına alınabildiğini ele adamaktadır. Düz yataklı belge tarayıcısı kullanarak sürü dinamiklerini ve kolektif stres tepkisini yüksek zamansal çözünürlükle izlemek ve sürülerin nicel analizini nasıl derleyip gerçekleştirebileceğimizi açıklamak için basit bir yöntem sıyoruz. Bu basit ve uygun maliyetli yöntem, sürünün hassas ve iyi kontrollü bir şekilde ölçülmesini sağlar ve diğer plaka bazlı büyüme tahlillerine ve bakteri türlerine de genişletilebilir.

Giriş

Swarming antibiyotik direnci ve ev sahibi1virülans faktörlerin üretimini artırır koordine bakteriyel hareketlilik kolektif bir şeklidir1 ,2,3. Bu çok hücreli davranış akciğerlerde epitel zarları kapsayan mukoza katmanları benzer yarı katı yüzeylerde oluşur4,5. Biyosürfamaddeler genellikle yüzeylerde yüzey gerilimi aşmak için kalabalık popülasyonlar tarafından üretilen ve bunların üretimi karmaşık hücre-hücre sinyal sistemleri tarafından düzenlenir, ayrıca çoğunluk algılama olarak bilinen6,7,8. Bakteri birçok tür sürü yeteneğine sahiptir, Pseudomonas aeruginosadahil, Staphylococcus aureus, ve Escherichia coli9,10,11,12. Bakteriler tarafından oluşturulan sürü desenleri çeşitlidir ve besin bileşimi, gözeneklilik ve nem13,14dahil olmak üzere yüzey tabakasının fiziksel ve kimyasal özelliklerinden etkilenir. Yüzey özelliklerine ek olarak, büyüme sıcaklığı ve ortam nemi sürü dinamiği çeşitli yönlerini etkiler, swarming oranı ve desenleri de dahil olmak üzere12,13,14,15. Sürüleri etkileyen büyüme değişkenleri, deneysel tekrarlanabilirliği ve sonuçları yorumlama yeteneğini etkileyen zorluklar yaratır. Burada, zaman atlamalı görüntüleme yoluyla bakteri sürülerinin dinamiklerini izlemek için basit bir standart yöntemi tanımlıyoruz. Yöntem, swarming ilerlemesini önemli ölçüde etkileyen kritik büyüme koşullarının nasıl kontrol edilebildiğini açıklar. Geleneksel sürü analizi yöntemleriyle karşılaştırıldığında, bu hızlandırılmış görüntüleme yöntemi, uzun süreler boyunca ve yüksek çözünürlükte aynı anda birden fazla sürünün hareketliliğini izlemeyi sağlar. Bu hususlar, sürülerin izlenmesinden elde edilebilen verilerin derinliğini artırır ve sürüleri etkileyen faktörlerin belirlenmesini kolaylaştırır.

P. aeruginosa swarming üretimi ve rhamnolipidler ve 3-(3-hidroksyalkanoyloxy) alkanoik asitlerinçevreye,6,16salınımı ile kolaylaştırılır. Faj virüsü ile antibiyotik veya enfeksiyon alt öldürücü konsantrasyonları stres giriş sürüleri organizasyonu etkiler. Özellikle, Bu stresler P. aeruginosa prosing molekül 2-heptyl-3-hidroksi-4-kinolon, ayrıca Pseudomonas quinolone sinyal (PQS) 17 olarak bilinen serbest bırakmak için neden17,18. İki sürü popülasyonu içeren sürü tahlillerinde, strese bağlı popülasyon tarafından üretilen PQS, işlenmemiş sürüleri stres içeren alana girmekten uzaklaştırır(Şekil 1). Bu toplu stres tepkisi yakındaki tehditler hakkında P. aeruginosa uyarır bir tehlike iletişim sinyal sistemi oluşturur18,19. P. aeruginosaüzerinde stresin etkileri , kolektif stres yanıtı aktivasyonu, ve sürülerin itme burada açıklanan hızlandırılmış görüntüleme yöntemi kullanılarak görselleştirilebilir. Burada açıklanan protokol nasıl açıklanabilir: (1) swarming için agar plakaları hazırlamak, (2) kültür P. aeruginosa tahliller iki tür (geleneksel swarming tahliller veya toplu stres tepkisi tahlilleri) (Şekil 1), (3) zaman atlamalı görüntüleri elde, ve (4) görüntüleri derlemek ve analiz etmek için ImageJ kullanın.

Kısaca, P. aeruginosa bir gecede kültürden bir sürü agar plaka ortasında tespit edilirken P. aeruginosa faj ile enfekte veya antibiyotik ile tedavi uydu pozisyonlarında tespit edilir. P. aeruginosa sürüsünün ilerlemesi, nem le ilgili 37 °C inkübatöre yerleştirilen bir tüketici belgesi nde yassı bir tarayıcıda izlenir. Tarayıcı, genellikle 16-20 saat boyunca, düzenli aralıklarla plakaları tarayan bir yazılım tarafından kontrol edilir. Bu yöntem, altı 10 cm'ye kadar sürühalinde eşzamanlı zaman atlamalı videolar verir. Görüntüler filmlerhalinde derlenir ve sürülerin strese bağlı popülasyonlar tarafından itilmesi serbestçe kullanılabilir ImageJ yazılımı kullanılarak ölçülür. Farklı sürü deneyleri arasında tutarlılık ve tekrarlanabilirlik sağlamak için özel önem verilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

1. P. aeruginosa Swarming Time-lapse Görüntüleme için Swarming Agar Plakaları Hazırlanması

  1. 500 mL çift distile suya 64 g Na2HPO4•7H2O, 15 g KH2PO4ve 2,5 g NaCl ekleyerek cam2şişede 5x M8 minimum ortam 1 L hazırlayın. Sıvı ortamı oda sıcaklığında sterilize etmek ve depolamak için son hacmi ilave ddH2O. Otoklav ile 1 L'ye ayarlayın.
  2. 50 mL ddH'da 24,6 g MgSO4•7H2O ekleyerek cam şişeye 100 mL21 MMg MgSO4 (magnezyum sülfat)2hazırlayın. Oda sıcaklığında saklayın.
  3. 50 mLddH2 O. Sterilize etmek için ek ddH2O. Otoklav ile son hacmi 100 mL'ye ayarlayarak cam şişede %20 casamino asitlerin 100 mL'sini hazırlayın. Oda sıcaklığında saklayın.
  4. 50 mL ddH2O'na 20 gr glikoz ekleyerek cam şişede %20 glikozun 100 mL'sini hazırlayın.2 Oda sıcaklığında saklayın.
  5. 10 swarming agar plakası yapmak için 100 mL ddH2O'ya 1 g agar ekleyin ve 250 mL Erlenmeyer şişesinde ek ddH2O ile son hacmi 160 mL'ye ayarlayın. Otoklavlama ile sterilize edin.
    1. Otoklavlamadan hemen sonra, agar çözeltisini 15 dakika boyunca 55 °C'lik bir su banyosuna yerleştirin.
    2. Agar çözeltisini su banyosundan çıkarın ve 40 mL 5x M8 minimum ortam, 200 μL 1 M MgSO4,2 mL %20 glikoz ve 5 mL %20 casamino asit15. Karıştırmadan hemen sonra adım 1.6'ya geçin.
      NOT: Son konsantrasyonlar %0.5 agar, 1 mM MgSO4, %0.2 glikoz ve %0.5 casamino asitlerdir.
  6. Tutarlı hacim için 25 mL pipet kullanarak, 10 cm çapındaki Petri kabı başına 20 mL'lik sürü halindeki agar çözeltisini ekleyin.
    NOT: Hacim agarın kuruma süresini ve nem içeriğini etkilediği için agar çözeltisinin sabit hacmi önemlidir. Swarming agar plakaları yaparken kabarcıklar kaçının.
  7. Oda sıcaklığında tezgah üzerinde 1 saat kapakları ile tek bir yığın halinde swarming agar plakaları yerleştirerek agar katılaşmak için izin verin. Bir sonraki adımdan önce odanın bağıl nemini %40-50 1 saate düşürmek için nem gidericisini açın.
  8. Oda sıcaklığında % 40-50 bağıl nem ile 300 ft3/dk bir laminar akış kaputunda kapakları kapalı ek bir 30 dakika için swarming agar plakaları kuru. Laminar akış kaputuna yüz koyarak kapakların iç kuru. 4 °C'de 24 saate kadar agar plakalarını saklayın.
  9. Siyah 10 cm Petri çanak kapakları zımpara kağıdı ile kapağın içini yumuşatarak görüntüleme için hazırlayın. Kapakları bir ambalaj kutusunun içine koyun ve ambalaj kutusunu kimyasal bir kaputun altına yerleştirin. Siyah sprey boya kullanarak kapakların içine püskürtün. Kapakların kurumasını bekleyin.
    NOT: Siyah kapaklar ek denemeler için yeniden kullanılabilir. Kapakların tarama sırasında ışığı yansıtmaması için boyanması önemlidir.

2. P. aeruginosa ve Kaplama Koşullarıbüyüme

  1. 400 mL ddH2O'na 10 g LB-Miller toz karışımı ekleyerek 400 mL lysogeny suyu (LB) hazırlayın. % 2 LB-agar Petri yemekleri için, agar ek 8 g ekleyin. Otoklav sterilize etmek.
  2. 10 cm çapında Petri yemekleri içine erimiş LB-agar orta 20 mL dökün ve onları bir gecede oda sıcaklığında katılaşmak için izin. Sıvı ortamı oda sıcaklığında ve agar plakalarını 4 °C'de saklayın.
  3. -80 °C'de steril halkalar veya ahşap çubuklar kullanılarak saklanan dondurulmuş bir stoktan LB-agar Petri kabında Seri P. aeruginosa. Petri kabını bir gecede baş aşağı 37 °C'de kuluçkaya yatırın. LB-agar plakasını 4 °C'de 1 haftaya kadar saklayın.
  4. Petri kabından steril bir döngü veya tahta çubukla tek bir koloni seçin, 2 mL LB ortama aşılayın ve kültürü bir gecede doygunluğa (16-18 saat) 37 °C'de 100 rpm'de silindir tambur setinde kuluçkaya yatırın.
  5. Pipet 5 μL adım 2.4 bir P20 pipet ve nokta kullanarak bir p20 pipet ve nokta bir açıyla pipet ucu yaklaşarak (10-45 °) 2.5 cm tespit alanı üzerinde, ilk durağıaşağı borulama ve sadece sıvı damla ile agar dokunmadan(Şekil 1B).
    1. Agar zarar olarak boru ucu ile agar dokunmaktan kaçının. Farklı sürü halindeki agar plakaları arasında sürekli olarak spot konumlandırmak için bir şablon kullanın (Ek Şekil S1).
    2. Geleneksel sürü tahlilleri için yalnızca orta noktayı kullanın ve adım 2.8'e atlayın. Kolektif stres yanıtı tahlilleri için adım 2.6 (faj enfeksiyonu için) veya adım 2.7 (antibiyotik stres için) devam edin.
  6. Faj enfeksiyonu için, p. aeruginosa'nın gecelik kültürünün 30 μL'sini adım 2.4'ten 6 μL 1 x 1012 pfu/mL faj DMS3vir20ile karıştırın. Hemen bir sonraki adıma geçin.
    1. Pipet 6 μL P. aeruginosa-faj karışımı adım 2.6 bir P20 pipet ve nokta kullanarak 6 eşit uzaklıkta uydu pozisyonları nda 2.8 cm yarıçaplı konsantrik daire bir açıyla boru ucu yaklaşarak Petri çanak merkezli (10-45 °) 2.5 cm tespit alanı nın üzerinde, ilk durağıaşağı borulama ve sadece sıvı damla ile agar dokunmadan (Şekil 1C).
    2. Agar zarar olarak boru ucu ile agar dokunmaktan kaçının. Tutarlılık için kaplama şablonu kullanın (Ek Şekil S1). Adım 2.8'e geçin.
  7. Antibiyotik tedavileri için, 30 μL gecelik kültür P. aeruginosa adım 2.4 ile 6 μL 3 mg /mL gentamisin, 100 mg/mL kanamisin veya 7.5 μL 100 mg/mL fosfomycin'i karıştırın. Hemen bir sonraki adıma geçin.
    1. Pipet 6 μL antibiyotik tedavi P. aeruginosa adım 2.7 bir P20 pipet ve nokta kullanarak 6 eşit uzaklıkta uydu pozisyonları nda 2.8 cm yarıçapı konsantrik daire üzerinde çanak merkezi hakkında pipet ucu yaklaşarak (10-45 °) 2.5 cm tespit alanı üzerinde pipet ucu, ilk durağı aşağı borulama ve sadece damla sıvı ile agar dokunmadan (DŞekil).
    2. Agar zarar olarak boru ucu ile agar dokunmaktan kaçının. Tutarlılık için kaplama şablonu kullanın (Ek Şekil S1). Adım 2.8'e geçin.
  8. Açık Petri kabı kapaklarını 1.9 basamaklı siyah kapaklarladeğiştirin (Şekil 2A).
  9. Nemi %75'te tutmak için 37 °C'de 10 L su banyosu ile 37 °C'de bir kuvözde bulunan bir tarayıcıya sürühalindeki agar plakalarını yerleştirin(Şekil 1E, Şekil 2B).
    DİkKAT: Sürühalindeki agar plakaları üzerindeki benekli hücreleri rahatsız etmeyin. Plakaları her zaman yukarı yaslayın.

3. Tarayıcı ile Görüntü Edinme

  1. Düz yataklı belge tarayıcısının 40-60 cm yukarısına siyah mat kumaş takarak Petri yemeklerinin ortam aydınlatmasını azaltın. Fermuar bağları kullanarak emniyete alalar (Şekil 2B).
  2. Tarayıcı bir tarama yazılımı ve otomatik komut dosyası yazılımı kullanılarak kontrol edilecektir.
    1. Tarama yazılımında, Ana Sayfa Modu 'nu(Şekil 3A)seçin. Görüntü Türüaltında Renk'i seçerek renkli görüntüler yakalayın. Görüntü kalitesini ayarlamak için Hedef Altındaki Diğer'i seçin ve Çözünürlüğü 300 dpi'ye ayarlayın. Hedef Boyutuiçin Orijinal'i seçerek görüntüler için standart boyutu koruyun. Standart görüntü kalitesi için tüm seçenekleri Görüntü Ayarlamaları altında işaretsiz bırakın.
      NOT: Hedef Boyutu varsayılan olarak Orijinal olarak ayarlanır. Hedef Boyutu için diğer seçenekleri seçmek için önce Önizleme'yi tıklatın.
  3. Dosya Kaydet Ayarlarını(Şekil 3A)açmak için Scan'ın sağındaki klasör simgesine tıklayarak görüntülerin kaydetme yolunu ayarlayın.
    1. Konum altında Diğer'i seçerek görüntüleri kaydetmek için klasör hedefini seçin ve Gözat'atıklayın. Görüntüleri kaydetmek için bir klasör seçin.
    2. Önek metin kutusundaki görüntüleri adlandırın. Görüntüler için sıralama sırasına başlamak için Başlangıç Numarası 001'i ayarlayın. Resim Biçimi altında Yaz için JPEG (*.jpg) seçerek dosya biçimini JPEG'e ayarlayın ve Ayrıntılariçin ayarlamak için Seçenekler'e tıklayın. Sıkıştırma Düzeyini 16'ya, Kodlamayı Standart'a ayarlayarak görüntü biçimi kalitesini ayarlayın ve Embed ICC Profilini denetleyin. Pencereyi kapatmak için Tamam'ı tıklatın (Şekil 3B).
    3. İlk seçeneği işaretsiz bırakın ("Aynı ada sahip dosyaların üzerine yazılsın") ve sonraki 3 seçeneği işaretleyin ("Bir sonraki taramadan önce bu iletişim kutusunu göster", "Taramadan sonra resim klasörünü aç", ve "Taramadan sonra Sayfa Ekle iletişim kutusunu göster"). Pencereyi kapatmak için Tamam'ı tıklatın
    4. Önizleme'ye tıklayarak görüntü kalitesini kontrol edin. Önizleme penceresi görüntülenir ve Tsk simgesi işlevsel hale gelir (Şekil 3C).
  4. Görüntü edinimi otomatikleştirmek için komut dosyası yazılımını kullanın. Sağlanan komut dosyası, 30 dakika aralıklarla Dosya Kaydet Ayarları penceresinde Tsam penceresinde Scan'a ve Tamam'a tıklar.
    1. Görev'e tıklayarak komut dosyasını alma | hem Single_scan.tsk hem de Idle_scanning.tsk'yı (EK Dosya 1 ve 2olarak sağlanan TSK dosyaları) içe aktarın ve seçin. Bkz. Şekil 3D.
      NOT: Single_scan.tsk, Scan penceresindeki Tbm'yi tarayıp Dosya Yı Kaydet penceresinde tamam düğmesine tıklar. Idle_scanning.tsk aktivSingle_scan.tsk her 30 dk. Bir Idle_scanning.tskaktivasyon değiştirerek tbmkasyon frekansı değiştirebilirsiniz.
    2. Hem Boşta tarama (içe aktarılan) hem de Tek tarama (içe aktarılan)seçeneğini seçerek 30 dk aralıklarla otomatik taramayı etkinleştirin , Boşta tarama (içe aktarılan)sağ tıklayarak ve Etkin'e soltıklayarak (Şekil 3D, Ek Şekil S2).
      NOT: Otomatik tarama, kullanıcı komut dosyasını el ile durdurana kadar çalışır. Komut dosyasını durdurmak için Boşta tarama (içe aktarılan) seçeneğini, Boşta tarama (içe aktarılan) seçeneğinisağ tıklatın ve Etkin'esol tıklatın. Onay işareti kaldırılır.

4. Hızlandırılmış Görüntülerin Derlenmesine ve Sürü Repulsion'un Ölçülmesi

  1. ImageJ'i kullanarak film düzenleme ve görüntü analizi gerçekleştirin.
  2. Tüm taranmış görüntüleri Dosya'ya tıklayarak ImageJ'e aktarın | İthalat | Görüntü Sırası ve görüntüleri seçin. Sıra Seçenekleri penceresinde, görüntüleri renkli tutmak için RGB'ye Dönüştür'ü işaretleyin. Görüntü sayısı, seçilen görüntü sayısını gösterir.
  3. Özgün boyutu korumak için klasördeki ilk resimden başlamak için görüntüyü 1'de başlatın ve görüntüleri %100 ölçekleyin. Sanal yığını işaretlenmemiş olarak kullanın. Tamam'ı tıklatın ve resimlerin yüklenmesini bekleyin (Şekil 4A).
  4. Video sıkıştırma düzeyini Düzenleme 'ye tıklayarak 100'e ayarlama | Seçenekler | Giriş/Çıkış... ve JPEG kalitesini 100'e ayarlayın.
  5. Dosyayı .avi olarak dosyaya tıklayarak kaydet | Olarak Kaydet | AVI. Sıkıştırmayı JPEG'e ve Kare Hızı'nı 5 fps'ye ayarlayın(Şekil 4B). .avi zaman atlamasını istenilen klasöre kaydedin.
  6. Sürü itme mesafelerini ölçmek için ImageJ'deki sürü döneminin sonuna doğru bir görüntü açın. Dosyaya Tıklayın | Görüntüyü açın ve seçin. Analiz et ' e tıklayarak ölçeği ayarlama | Ölçek ve ayar Mesafeyi piksellerde 118' e, Bilinen uzaklığı 1'e, Piksel en boy oranını 1,0'a ve uzunluk birimini cm'ye ayarla (Şekil 4C). Global'i kontrolsüz bırakın. Pencereyi kapatmak için Tamam'ı tıklatın.
  7. Düz simgesine tıklayın ve uydu konumundaki koloninin merkezinden kalabalık nüfusun kenarına kadar ölçün. Analiz'i Seçin | Ölçümlerle yeni bir pencere nin görünmesini sağlamak için ölçün (Uzunluk) (Şekil 4D).
    NOT: Yakınlaştırmak için "+" ve uzaklaştırmak için "-" kullanın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

P. aeruginosabüyümek için adımlar, hücreleri stres, ve görüntü swarming agar plakaları Şekil 1temsil edilmektedir. Biz 37 ° c gecede LB suyu 2 mL bir LB-agar plaka bir LB-agar plaka vahşi tip P. aeruginosa UCBPP-PA14 suşu tek bir koloni aşılanmış ve swarming agar plaka merkezinde 5 μL tespit. Bu plakanın hızlandırılmış görüntüleme merkezinde bir koloni şeklinde ilk büyüme ortaya koymaktadır ve daha sonra koloniden radyal tendrils yayılıyor(Video 1). Kolektif stres tepki...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Bu protokol, agar plakaları sürühalindeki değişkenliği en aza indirmeye ve P. aeruginosa swarming ve strese yanıt veren hızlandırılmış görüntüleri elde etmek için basit ve düşük maliyetli bir yöntem sağlamaya odaklanır. Bu prosedür, ortam kompozisyonu ve büyüme koşulları uyarlayarak görüntü diğer bakteri sistemleri uzatılabilir. P. aeruginosaiçin , Her ne kadar M9 veya FAB minimal orta sürücünü ikna etmek için kullanılabilir16,21, burada sunulan...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Teşekkürler

J.-L.B., A.S., ve N.M.H-K. taslağı yazdı ve gözden geçirdi. Deneyleri tüm yazarlar tasarladı. J.-L.B. deneyleri ve analizleri yaptı. Bu çalışma NIH ödülü K22AI112816 ve R21AI139968 a.s. ve University of California tarafından desteklenmiştir. N.M.H-K. Lundbeck Bursları R220-2016-860 ve R251-2017-1070 tarafından desteklenmiştir. Fon, eserin yayına sunulması kararında hiçbir rol sahip değillerdi. Beyan etmek için rekabet eden bir çıkarımız yok.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Reaktifler< / güçlü >
Bacto agar, susuzBD Difco214010LB-agar plakası ve sürü agar plakası için
Casamino asitlerBD Difco223050Sürü ortamı için
D-GlikozFisher KimyasalD16500Dekstroz. Sürü ortamı için
Fosfomisin disodyum tuzuTokyo Kimya EndüstrisiF0889Stok konsantrasyonu: 200 mg / mL. ddH2O
Gentamisin sülfatSigma-AldrichG1914Stok konsantrasyonu: 3 mg/mL. DdH2O
Kanamisin sülfatSigma-Aldrich60615içinde çözünmüş Stok konsantrasyonu: 100 mg/mL. ddH2O içinde çözülür
LB-MillerBD Difco244620LB et suyu ve LB-agar plakaları için
Magnezyum sülfat heptahidratSigma-Aldrich230391Sürü ortamı için
Potasyum fosfat monobazikSigma-AldrichP06625x M8 ortamı için
Sodyum klorürSigma-AldrichS98885x M8 ortamı için
5x M8 ortamı için sodyum fosfat dibazik heptahidratFisher ChemicalS373
Suşlar< / strong>
Pseudomonas aeruginosa< / em >Siryaporn labAFS27E.1 18 < / sup>PA14 suşu
DMS3virO'Toole laboratuvarıDMS3vir20< / sup>Bakteriyofaj
< güçlü > Malzemeler< / güçlü >
Alüminyum oksit zımpara kağıdı3M150 İnceSiyah kapaklar için
Siyah kumaşJoannPRD7089Siyah kumaş
Siyah sprey boyaKrylon5592 Mat Siyahkapaklar için
Erlenmeyer şişesiKimax26500250 mL
Cam saklama şişeleriPyrex13951L250 mL, 500 mL, 1.000 mL
8 inç fermuarGardner BenderE173770Siyah mat kumaş
Petri kaplarını takmak için (100 mm x 15 mm)FisherFB0875712100 mm x 15 mm polistiren plakalar
Tahta çubuklarFisher23-400-102Bakterileri çizgi haline getirmek ve aşılamak için
Ekipman
OtoklavPazarı Forge IndustriesSTM-EReaktifleri sterilize etmek için
25 mL pipetUSA Scientific, Inc.1072-5410Agar plakalarını kaynatmak için 20 mL pipetlemek için
Nem AlmaCihazı FrigidaireFAD704DWD 70 pintOda bağıl nemini yaklaşık %45'te tutmak
içinImageJNIHv1.52aGörüntü analizi yazılımı
İnkübatörVWR89032-09237 ° C'de bakteri büyümesi için; C
Isotemp su banyosuFisher15-462-21QOrtamı 55 ° C'ye soğutmak için; C
Laminer akış başlığıThe Baker CompanySG603AKurutma plakaları
için P-20 pipetGilsonF123601Sürü halindeki agar plakalarında lekelenme
Pipet Kontrol CihazıBrandTechaccu-jetSürü halinde agar plakaları için 20 mL pipetlemek için
Rulo TamburNew BrunswickTC-7100 rpm'de bakteri büyümesi için
TarayıcıEpsonGörüntüleme plakaları için Epson Perfection V370 FotoğrafTarayıcı
Tarayıcı otomasyon yazılımıRoboTask Litev7.0.1.93230 dakikalık dahili görüntüleme için
Tarayıcı görüntü alma yazılımıEpsonv9.9.2.5USGörüntüleme plakaları için yazılım
içinde çözünmüş Siyah

Kaynaklar

  1. Butler, M. T., Wang, Q., Harshey, R. M. Cell density and mobility protect swarming bacteria against antibiotics. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (8), 3776-3781 (2010).
  2. Lai, S., Tremblay, J., Déziel, E. Swarming motility: a multicellular behaviour conferring antimicrobial resistance. Environmental Microbiology. 11 (1), 126-136 (2009).
  3. Overhage, J., Bains, M., Brazas, M. D., Hancock, R. E. W. Swarming of Pseudomonas aeruginosa is a complex adaptation leading to increased production of virulence factors and antibiotic resistance. Journal of Bacteriology. 190 (8), 2671-2679 (2008).
  4. Yeung, A. T. Y., et al. Swarming of Pseudomonas aeruginosa is controlled by a broad spectrum of transcriptional regulators, including MetR. Journal of Bacteriology. 191 (18), 5592-5602 (2009).
  5. Girod, S., Zahm, J. M., Plotkowski, C., Beck, G., Puchelle, E. Role of the physiochemical properties of mucus in the protection of the respiratory epithelium. The European Respiratory Journal. 5 (4), 477-487 (1992).
  6. Caiazza, N. C., Shanks, R. M. Q., O'Toole, G. A. Rhamnolipids modulate swarming motility patterns of Pseudomonas aeruginosa. Journal of Bacteriology. 187 (21), 7351-7361 (2005).
  7. Déziel, E., Lépine, F., Milot, S., Villemur, R. rhlA is required for the production of a novel biosurfactant promoting swarming motility in Pseudomonas aeruginosa: 3-(3-hydroxyalkanoyloxy)alkanoic acids (HAAs), the precursors of rhamnolipids. Microbiology. 149, Reading, England. Pt 8 2005-2013 (2003).
  8. Dusane, D. H., Zinjarde, S. S., Venugopalan, V. P., McLean, R. J. C., Weber, M. M., Rahman, P. K. S. M. Quorum sensing: implications on rhamnolipid biosurfactant production. Biotechnology & Genetic Engineering Reviews. 27, 159-184 (2010).
  9. Köhler, T., Curty, L. K., Barja, F., van Delden, C., Pechère, J. C. Swarming of Pseudomonas aeruginosa is dependent on cell-to-cell signaling and requires flagella and pili. Journal of Bacteriology. 182 (21), 5990-5996 (2000).
  10. Pollitt, E. J. G., Crusz, S. A., Diggle, S. P. Staphylococcus aureus forms spreading dendrites that have characteristics of active motility. Scientific Reports. 5, 17698(2015).
  11. Burkart, M., Toguchi, A., Harshey, R. M. The chemotaxis system, but not chemotaxis, is essential for swarming motility in Escherichia coli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (5), 2568-2573 (1998).
  12. Kearns, D. B. A field guide to bacterial swarming motility. Nature Reviews. Microbiology. 8 (9), 634-644 (2010).
  13. Tremblay, J., Déziel, E. Improving the reproducibility of Pseudomonas aeruginosa swarming motility assays. Journal of Basic Microbiology. 48 (6), 509-515 (2008).
  14. Morales-Soto, N., et al. Preparation, imaging, and quantification of bacterial surface motility assays. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (98), e52338(2015).
  15. Ha, D. -G., Kuchma, S. L., O'Toole, G. A. Plate-based assay for swarming motility in Pseudomonas aeruginosa. Methods in Molecular Biology. 1149, Clifton, N.J. 67-72 (2014).
  16. Tremblay, J., Richardson, A. -P., Lépine, F., Déziel, E. Self-produced extracellular stimuli modulate the Pseudomonas aeruginosa swarming motility behaviour. Environmental Microbiology. 9 (10), 2622-2630 (2007).
  17. Morales-Soto, N., et al. Spatially dependent alkyl quinolone signaling responses to antibiotics in Pseudomonas aeruginosa swarms. The Journal of Biological Chemistry. 293 (24), 9544-9552 (2018).
  18. Bru, J. -L., et al. PQS produced by the Pseudomonas aeruginosa stress response repels swarms away from bacteriophage and antibiotics. Journal of Bacteriology. , (2019).
  19. van Kessel, J. C. PQS signaling for more than a quorum: the collective stress response protects healthy Pseudomonas aeruginosa populations. Journal of Bacteriology. , (2019).
  20. Zegans, M. E., et al. Interaction between bacteriophage DMS3 and host CRISPR region inhibits group behaviors of Pseudomonas aeruginosa. Journal of Bacteriology. 191 (1), 210-219 (2009).
  21. Kamatkar, N. G., Shrout, J. D. Surface hardness impairment of quorum sensing and swarming for Pseudomonas aeruginosa. PloS One. 6 (6), 20888(2011).
  22. Mattingly, A. E., Kamatkar, N. G., Morales-Soto, N., Borlee, B. R., Shrout, J. D. Multiple Environmental Factors Influence the Importance of the Phosphodiesterase DipA upon Pseudomonas aeruginosa Swarming. Applied and Environmental Microbiology. 84 (7), (2018).
  23. Boyle, K. E., Monaco, H., van Ditmarsch, D., Deforet, M., Xavier, J. B. Integration of Metabolic and Quorum Sensing Signals Governing the Decision to Cooperate in a Bacterial Social Trait. PLoS computational biology. 11 (5), 10004279(2015).
  24. Bernier, S. P., Ha, D. -G., Khan, W., Merritt, J. H., O'Toole, G. A. Modulation of Pseudomonas aeruginosa surface-associated group behaviors by individual amino acids through c-di-GMP signaling. Research in Microbiology. 162 (7), 680-688 (2011).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Bakteriyel S r lemeS r leme Agar PlakalarPseudomonas aeruginosaBakteriyofaj Yan tAntibiyotik StresiDok man Taray cImageJ AnaliziAVI Zaman Atlamal G r nt lemeAyd nl k Alan Mikroskobisi
Bakteriyel Sürülerin Hızlandırılmış Görüntülemesi ve Kolektif Stres Tepkisi
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.